桑国俊博士论文第2章 卵母细胞低温保存研究进展Word文档格式.docx

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1卵母细胞冷冻保存意义及其发展状况

1.1卵母细胞冷冻保存的意义

哺乳动物卵母细胞的冷冻保存，可充分利用各种卵母细胞资源，为体外受精、核移植等胚胎工程技术提供丰富而方便的材料来源，为科研和生产服务。

卵母细胞的冷冻保存技术已经应用在医学、动物学和生物医学等方面，其意义为：

（1）哺乳动物卵母细胞的有效冷冻保存是护品种资源和拯救濒危动物不可缺少的技术保障之一。

（2）是加快家畜品种改良和胚胎移植技术产业化的重要组成部分，可代替活畜进口，不受时间和空间的限制。

（3）可用于卵母细胞的低温生物学特性和体外受精机理研究。

（4）通过冷冻保存卵母细胞，不但可以建立雌性动物的基因库，还可以充分利用丰富廉价的卵母细胞资源，使体外受精、转基因及克隆等技术的研究应用不受时间和地域的约束。

（5）在医学方面，人卵母细胞的冷冻保存可以克服胚胎冷冻保存所引起的伦理道德以及法律上的问题，为那些接受化疗、放疗或由于其它病理原因而过早摘除卵巢或输卵管堵塞病人提供怀孕的机会[230]。

1.2卵母细胞冷冻保存

卵母细胞冷冻成功于1977年，Whttingham等[231]用慢速冷冻法对小鼠卵母细胞冷冻保存后受精，移植后得到了后代。

随后，Al-Hasan等[232]对兔卵母细胞冷冻保存后受精，移植后也得到了后代。

家畜的卵母细胞冷冻保存主要集中在牛上，Lim等[233]首次成功冷冻保存了牛的卵母细胞，且第一头超低温冷冻保存的卵母细胞产生的牛犊出生于1992年。

虽然牛卵母细胞的冷冻方法借鉴了胚胎的冷冻方法，但是其效果远不及牛胚胎的冷冻。

1998年，Vajita等首次采用OPS法冷冻牛卵母细胞取得了成功，体外受精后囊胚发育率达11％～25％。

2002年Amir等[234]结合微滴法和超低温液氮的方法，取得了20%的囊胚率并获得一头健康小牛。

与成熟卵母细胞相比，未成熟卵母细胞的冷冻更为困难。

Suzuki等[235]用慢速冷冻法冷冻牛GV期卵母细胞，体外受精后有35.3％～42.2％卵裂率，1.3％～3.1％的卵母细胞发育到囊胚。

此后，GV期卵母细胞冷冻的进展缓慢。

最近国内也有一些关于GV期卵母细胞冷冻的进展，2004年包华琼等[236]冷冻牛GV期卵母细胞，冷冻解冻后体外受精卵裂率为36.67％～52.3％。

2005年禹学礼等[237]用OPS法和细管法冷冻牛GV期卵母细胞，成熟率分别为66.0％和48.2％，只有OPS法得到了4％的囊胚率。

牛卵母细胞冷冻的研究主要集中在玻璃化方法的应用和寻求减少冷冻液体积和加快降温速率的方法上，在低温生物学机理和探讨冷冻损伤的机理方面做的还不够，因此，卵母细胞的冷冻保存条件及低温生物学特性等方面还有待进一步研究[238]。

在人卵母细胞冷冻方面：

1986年Chen[239]成功冷冻人卵母细胞并获得后代。

2000年，Yong等[240]首次用玻璃化冷冻方法冷冻人成熟卵母细胞，获得了第一例来自玻璃化冷冻方法的后代。

最近研究人员通过理论和试验分析比较了人卵母细胞冷冻和胚胎冷冻的优缺点。

2004年Andrea等[241]通过优化卵母细胞的冷冻技术获得了高达12.5％出生率，Andrea认为随着卵母细胞冷冻技术的发展，人卵母细胞的冷冻可以作为胚胎冷冻的一种选择。

Tucker[242]等从社会、伦理和建立“卵子库”的意义等方面分析也认为人卵母细胞的冷冻将是未来人工辅助生殖技术发展的方向。

1.3胚胎冷冻保存

1.3.1胚胎冷冻保存的意义

在繁殖生物学技术的应用中，胚胎的冷冻保存是关键环节，同时它也是胚胎移植技术步入商业化阶段的关键。

优质冷冻胚胎含有良种家畜的全部基因，移植到任何同种动物体内都不会改变，所以为良种家畜品种的快速繁殖提供了可靠的基础。

利用胚胎冷冻技术，人们可以将优质胚胎冷冻保存起来，当需要时将所需的贮存胚胎随时运送到各地进行移植，不受时间、地点的限制。

随着研究工作的不断深入，超低温冷冻保存技术在动物胚胎上的应用将越来越广泛，越来越深入，会有更多种化合物作为防冻剂进入胚胎冷冻的行列。

随着其他生物技术的发展，给胚胎冷冻技术的应用提供更多新思路和新方法，这对于解决我国动物遗传资源急速减少，挽救濒危品种，建立“胚胎库”和“胚子库”，提供了一个广阔前景。

从长远的观点看，将来对人类的各种组织器官冷冻保存的探讨，从中可得到一些启发。

综上所述，胚胎的冷冻保存的意义具有以下几方面：

（1）可以大量回收供体的胚胎，便于迅速挽救那些即将灭绝、数量有限的物种。

（2）胚胎冷冻保存的年限，目前认为在200年以上[243]，极大地延长了世代间隔，基本不用考虑漂变、交配体制、留种和近交系数等活畜保种面临的问题。

（3）冷冻保种主要考虑冷源（液氮）的维持，不受地域及生态环境等条件的限制。

（4）冷冻保种保险系数大，在胚胎的透明带内始终未发现病原体，完整的透明带对细菌和病毒是一有效的屏障，它克服了活畜保种中疾病、自然灾害等因素造成的保种困难。

（5）胚胎冷冻为建立“胚胎库”奠定了基础，通过胚胎冷冻可以远距离运输胚胎，节省人力、物力和财力。

1.3.2胚胎冷冻保存的发展概况

Whittingham（1973）首先在小鼠胚胎冷冻上获得成功，在此之后牛（Wilmut，1973[244]）、兔子（Whittingham，1974[245]）、绵羊（Willadsen，1975[246]）、山羊（Bilton，1976[247]）、大鼠（Whi，1975[248]）等胚胎冷冻保存相继成功。

到目前为止，已有数十种哺乳动物的胚胎冷冻保存获得成功。

1985年Rall和Fahy将玻璃化冷冻用于哺乳动物胚胎的低温保存方法。

J.R.Dobrinsky等[249]的研究中，经过玻璃化冷冻、解冻后86%的牛受精卵在体外可继续发育。

经过移植后妊娠率为24%，常规冷冻、解冻妊娠率为28%，IVP胚胎直接培养并用于移植后作为对照，有26%的建立了妊娠。

S.Y.Tomita等[250]用程序化冷冻法进行双犊试验，同时将每头受体牛移入两枚冷冻胚胎，获得36.21%的双犊率。

随着胚胎生物技术的发展，胚胎的低温保存将成为把这些技术发展到应用阶段的不可缺少的一种技术手段。

常规冷冻和玻璃化冷冻都已经应用到体细胞核移植、胚胎细胞核移植所得胚胎和用于核移植的细胞玻璃化低温保存。

另外，牛胚胎的基因注射也已应用了低温保存技术，并且移植妊娠产犊；

除此之外，精子的细胞质内注射所获得的胚胎冷冻处理后也移植产下牛犊。

人胚胎冷冻方面：

1998年Mukaida等[251]首次采用玻璃化技术冻贮人类胚胎并移植妊娠获得成功。

以后玻璃化技术冻贮原核期胚胎、早期分裂期胚胎和囊胚等不同发育阶段的胚胎相继取得成功。

早期分裂期胚胎的冷冻，研究时间较长，技术比较成熟，已被各生殖中心广泛采用。

2000年Saito等[252]年应用EG（EG）为基础的VS液成功保存了人类8-细胞胚胎，并获得较高的胚胎存活率。

同年Iman[253]采用EG（EG）和蔗糖（Sucrose）作VS液冷冻215个发育到第3天的人胚胎，获得49.3%（106/215）的总存活率，比较了发育人8细胞胚、7细胞胚和6细胞胚，玻璃化技术冻融后存活率分别为79.2%（62/78），39.7%（33/84），21.1%（11/53）。

三者之间均有显著差异，由此可见冷冻8细胞的胚胎可获得较高的胚胎存活率。

2001年Yokota等[254]报道应用OPS玻璃化冷冻人类囊胚后移植后获得妊娠。

2卵母细胞低温冷冻保存的基本原理

哺乳动物卵母细胞的超低温保存，是指在超低温（-196℃）条件下抑制细胞内一切新陈代谢活动，并使细胞被长期保存，按一定方式解冻后，又能恢复其受精、卵裂等发育潜能的一种保存技术。

一般情况下，哺乳动物的细胞冷冻到-20℃以下时极难存活。

大多数细胞存在一种最适宜的冷冻速度，如果超出这一速度，细胞内结冰和解冻时容易再次形成冰晶，引起细胞死亡。

若低于这一速度，因冰晶形成产生的溶液变化较大，同样也会引起细胞死亡。

低温冷冻保存的最大优点是细胞能长期保存而不丧失活性，其原因是因为细胞内一切新陈代谢过程中的化学反应被低温所抑制，当温度降到一定程度时，细胞内所有化学变化也就处于一种“暂停”状态而使细胞得以长期保存，低温保存的细胞以一定方式复苏后，又具有存活能力[255]。

卵母细胞和胚胎的水分占胞质80%以上，在一般情况下，低温冷冻时有90%的水分形成游离水而冻结成冰晶，可破坏蛋白质结构并发生不可逆的变化，从而导致细胞死亡。

通常，在冷冻过程中，冰晶首先在细胞外液中形成，此时冰晶与溶质分离，细胞外液未冻结部分的溶液浓度升高，细胞外液的渗透压增加，细胞内水分渗出。

随着温度继续下降，细胞外冰晶不断形成，未冻结部分的溶液浓度增加，细胞内外的渗透压差增大。

这时可能发生两种情况：

（1）当降温速度很慢时，胞质内更多的水分有足够的时间渗出，水分在细胞外冻结，随着细胞外冰晶的形成，细胞内外形成了较高的渗透压，使细胞内水分逐渐减少，细胞内电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和膜的分解。

（2）当降温速度很快时，胞质内水分形成的冰晶使细胞受到物理性的损伤。

温度过低会引起膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢。

采用合理的冷冻方法，添加适当的冷冻保护剂，就能减少细胞在冷冻过程中的损害[256]。

2.1诱发结晶

溶液在温度达到冰点时不结冰，待降到冰点以下一定温度时才结晶，这种现象叫过冷现象。

过冷现象的产生，使得溶液在冰点以下任何温度都可结冰，这样易对卵母细胞造成两种损伤：

一是溶液在结冰时放出的潜热使温度回升而后再下降，如果溶液结冰时的温度距冰点较远（-15℃下），则这种温度的急剧变化往往会造成卵母细胞死亡；

二是分子运动和温度有关，当溶液在冰点附近结冰时，水分子运动相对活跃，来不及排列成整齐的冰晶，生成的冰晶较小，对细胞的影响相对较小；

出现过冷现象时，结冰的温度相对较低，则相应形成的冰晶就大，对细胞造成的损伤也严重。

为了防止过冷现象的发生，通常在-7℃左右时通过人工强制诱发结晶，以避免较大冰晶的形成[257]。

诱发结晶主要在冷冻降温速率较慢的程序化冷冻中使用。

诱发方法有两种：

①用液氮预冷过的镊子夹麦管中部含卵母细胞的冷冻液上部；

②在冷冻液中加入制冷剂晶母等。

2.2冷冻保护剂对卵母细胞的保护作用

（1）渗透性保护剂

渗透性保护剂是一类小分子化合物，因其在冷冻过程中能够渗透进入胞质内而得名，常用的有GL（Glycerol,GL）、二甲基亚砜（Dimethysulphoxide,DMSO）、丙二醇（1,2-Propanediol,PROH）、EG等（EthyleneGlycol,EG）。

该类物质在冷冻过程中进入细胞内部，可以起到以下作用：

①防止卵母细胞因脱水过度收缩；

②与水分子发生水合作用，减慢溶液结晶速度；

③稀释胞质中因脱水而产生的高盐，减少盐害作用的产生[258]。

（2）非渗透性保护剂

相对于渗透性保护剂，这是一类大分子化合物，能溶于水，但不能渗入细胞，较为常用的有蔗糖、聚蔗糖、血清等。

冷冻降温过程中，卵母细胞外液首先结晶，随着结晶程度的加深，胞外溶质浓度逐渐增加，并顺着胞内外化学势能差进入胞质内，对卵母细胞产生盐害作用。

冷冻保护剂中含有这类大分子物质，就能有效降底胞质外溶质的浓度，减少盐害作用的产生；

在快速冷冻时，可协助渗透性保护剂促使细胞脱水，减少细胞内冰晶形成；

组成玻璃化液时，可有效降低渗透性保护剂的克分子浓度、可使发生玻璃化的相变温度升高、可促进胞质及保护液玻璃化；

解冻时，为卵母细胞提供一个高渗环境，避免水分进入胞内过快而产生的渗透性破裂。

（3）其他保护剂

主要是指最近所发现的一些新型冷冻保护剂，如抗冻蛋白。

抗冻蛋白（AntifreezingProtein，AFP）最早是在极地耐寒动物身上发现的一种具有特殊性质的蛋白质。

在低温（4℃）和超低温（-30℃~-196℃）下，与细胞膜相互作用，封闭离子通道，阻止演技渗透而使细胞膜受到保护[259]。

也有研究表明，AFP的作用机理是与能够与冰晶相互作用，防止降温过程中冰晶生成和升温过程中重结晶的发生[260]。

2.3玻璃化的保护作用

玻璃化是高浓度的冷冻保护液在低温或超低温下溶液由液相变为固相时，其内部的分子、离子分布不改变其原有的分布，不形成有规则外表的物质形态，可有效避免冰晶形成时对卵母细胞内部骨架结构和亚细胞器膜的牵拉断裂和尖锐刺伤。

3卵母细胞和胚胎在低温冷冻保存过程中的受损机制

卵母细胞的冷冻保存技术来源于胚胎冷冻保存，由于细胞自身所具有的一系列特殊性质，因而冷冻保存的难度较大。

与精子、胚胎冷冻保存相似，卵母细胞在冷冻保存及复温过程中易受到一系列的损伤。

3.1细胞内冰晶损伤

在胚胎及卵母细胞冷冻过程中，当温度降低到冰点以下，在细胞外液内液都有冰晶产生，使细胞受到致命性的损伤（物理损伤）[261]，这个因素也是胚胎及卵母细胞冷冻保存的关键。

Mazur等（1992）[262]对仓鼠组织培养细胞的低温保存试验数据进行分析认为，冷冻速度过快形成的细胞内冰晶，对细胞产生致命性损伤。

并且冷冻速度越快，损伤越大。

Miyake和Bank认为[263]，在快速冷冻中形成的细胞内冰晶本身对细胞并非是致命的，致命性损伤是由于细胞内产生重结晶。

快速冷冻时，由于降温速率快，结晶时的冰晶核较多，从而形成数目多且体积小的冰晶，对细胞造成的损害较小。

如果解冻时采取快速复温，则细胞仍能存活，但若在解冻过程中，在温度较高的区域（如-40℃或更高）经历较长时间或进行慢速复温，则会产生重结晶现象，即细胞内小冰晶重结晶成大冰晶，从而机械性的破坏细胞的超微结构而造成细胞的致命损伤。

3.2细胞外冰晶损伤

慢速冷冻时，冰晶首先在细胞外形成。

细胞外液冰晶形成后，使得溶液中离子浓度的升高，对细胞产生了离子影响，此损伤又称盐损伤[264]。

随着更多冰晶的产生，使溶液逐渐浓缩，溶液的浓缩对细胞的影响越来越大，此现象被称为溶液效应又称为化学损伤。

冷却的速度越慢，则浓度越高，对卵母细胞的作用时间也越长，对卵母细胞膜蛋白复合体造成的伤害也越大。

这主要是由于细胞内外的电解质浓度增高，导致细胞膜蛋白复合体的破坏和核膜的降解[265]。

3.3破裂损伤

采用常规法冷冻的卵母细胞或胚胎解冻后可见到透明带破裂，这主要是由于物质的膨胀率和收缩率不同，这种现象被称作破裂损伤。

DePaz等[266]、Titterington等[267]发现，即使在没有冰晶形成的玻璃化冷冻中，这中损伤也达到了20%左右。

葛西等[268]小鼠的胚胎反复冻融，结果快速反复冻融10次样本中有75%发生了破裂，但缓慢通过-110℃～-130℃的冷冻液变相温度区域的反复冻融10次后，样本没有发现破裂损伤。

由此可见，破裂损伤往往发生在液相和固相急速转化的过程中。

因此，慢速冷冻时缓慢通过冷冻液变相温度区域非常重要。

3.4渗透压损伤

损伤主要来自解冻过程，卵母细胞或胚胎在冷冻液中平衡或脱出冷冻保护剂时，由于渗透压的急剧变化而引起细胞过度膨胀或收缩使细胞受到损伤；

同时渗透压的急剧变化使大量水或冷冻保护剂快速通过细胞膜，而引起细胞膜机械性损伤[269]。

解冻时若将胚胎直接移入等渗溶液中，由于内部的渗透压较高，水分很容易渗入细胞内，冷冻保护剂未来得及脱出，造成细胞膨胀而受到损伤。

所以，在脱出细胞内部冷冻保护剂的同时使细胞膨胀控制在最小程度。

Pedro等[270]指出，冷冻解冻后的胚胎比鲜胚更容易受到膨胀和收缩的损伤，可能与冷冻使胚胎细胞膜机能不全而导致膜易破损有关。

3.5冷冻保护剂化学毒性损伤

当卵母细胞或胚胎移入冷冻保护剂液平衡时，随着时间的延长和浓度的升高，生存率下降。

造成这个结果的原因是冷冻保护剂中渗透性冷冻保护剂的化学毒性作用[271]。

冷冻过程中渗透性冷冻保护剂渗入细胞，影响和改变细胞内超微结构和大分子物质的结构和功能，间接引起高级结构的破坏。

毒性表现在引起细胞膜变脆或破裂[272-274]、透明带硬化[275]、微管及微丝聚合或解聚[275-278]、染色体和DNA[279-280]损伤等。

冷冻保护剂中主要是渗透性保护剂对卵母细胞产生化学毒害作用，其毒性大小随作用温度、作用时间和作用浓度的增大而增大[281-282]。

具体表现为细胞变脆崩裂[283-286]、透明带硬化[287]、微管微丝的聚合和解聚[288-290]、染色体和DNA损伤[291-292]等。

3.6低温损伤

卵母细胞和胚胎对温度的降低极为敏感，在温度高于冰点，细胞内外均无冰晶形成的情况下，仍会造成细胞的损伤。

不同哺乳动物的细胞在低温保存过程中都会受到一定的低温影响，特别是脂质含量较多的猪卵母细胞和牛卵母细胞。

这种由于温度低于正常温度所造成的细胞损伤被称为低温损伤。

这种损伤很大程度上取决于温度的变化。

造成这种损伤的机理可能是的低温引起膜脂肪相的变化，从而影响细胞的新陈代谢[293]。

低温损伤与细胞质内脂肪颗粒的含量有关，如猪和牛卵母细胞及早期胚胎此现象由为突出，其他哺乳动物脂肪含量较少，受低温损伤影响不大。

3.7过冷损伤

冰晶的成核过程主要由热力学条件决定。

溶液在被冷却到低于冰点的某一温度时才开始结冰，在冷冻过程中溶液温度降低到冰点以下是有可能回升到冰点的，对细胞产生损伤。

如果溶液结冰的温度离冰点有一定距离，如-15℃以下，由于潜热的释放使溶液温度迅速上升，潜热释放完后又急剧下降，细胞往往在温度的这种剧烈变化中死亡，所以在常规冷冻中，在稍低于溶液冰点，在-5℃时采取人工植冰，使溶液瞬间度过冰点温度，防止过冷损伤的发生。

4冷冻方法

4.1慢速冷冻法

此法由Whittingham（1971）建立，是早期胚胎冷冻研究中常用的方法。

该法将胚胎置于冷冻保护液中以0.2~0.8℃/min的速率缓慢降温至-80℃，然后投入液氮保存。

利用这一方法先后对多种家畜和实验动物的胚胎进行冷冻试验并取得成功，但由于其冷冻过程花费的时间比较长（6h以上），而且需要特殊的冷冻降温设备，因此目前已经很少采用。

4.2快速冷冻法

又称常规冷冻法。

该法一般使用混合保护液，保护液由浓度为0.2～3.5mol/l渗透性的保护剂如GL和丙二醇与浓度为0.25～0.5mol/l的非渗透性的保护剂如蔗糖混合而成。

胚胎冻前脱水，使细胞内水分减少，冰晶量及大块冰晶形成减少，可以获得较高存活率。

1978年，Wiladsen等在牛的胚胎冷冻中首次建立并使用了这种方法，此法使冷冻时间缩短到2h。

具体操作为在-4.6～-7℃开始，将装有胚胎的细管置于冷冻仪中，并保持10～15min（放入胚胎后开始植冰）；

从植冰温度开始以0.3～0.5℃/min的降温速度降温至-30℃；

在-30℃时将胚胎快速投入到液氮中保存。

该法最大的优点在于将水从细胞中脱出的速度和水结成冰的速度达成了平衡状态,但需要价格昂贵的程序化冷冻仪。

慢（快）速冷冻法是通过冷冻程序仪来控制其降温速率，一般以1℃/min左右的速率降至-7℃左右时，进行人工诱导结晶，再以0.1~1.0℃/min的速率降至-30~-40℃（快速冷冻）或者-80℃（慢速冷冻）时，投入液氮中保存。

4.3玻璃化法。

玻璃化冷冻法是1985年发展起来的一种快速冷冻胚胎的方法。

“玻璃化”是一个物理学上的概念，是指当水或溶液快速降温达到或低于-100～-110℃的温度范围时，形成一种具有高粘度的介于液态和固态之间、非晶体态、杂乱无章、透明的玻璃状态。

它虽然不能像液态那样流动，却可向晶体一样保持自己的形状。

配制的高浓度冷冻保护液在液氮中能形成类似玻璃状稳定而透明的非晶体化固体物质状态。

其特点为：

①分子不按晶格结构排列，为无定型结构。

②在玻璃化过程中，分子不重新排列，发生剧烈运动，没有准确固定的转变固化点，其形态的转变是在一定的温度区内完成的，即玻璃化变相温度是代表一个区域的温度。

③当水溶液有电解质或其他可溶性成分转变成玻璃态时，由于其均一的分散系统未遭到破坏，所以溶液的浓度发生改变或改变很小[294]。

玻璃态的物理性能与晶体不同，是一种即可以避免或减轻冷冻细胞、组织损伤，又可长期保存细胞、组织的良好方法。

玻璃化冷冻法是超快速降低细胞温度的一种冷冻模式，因为冷冻液在液氮中形成的是一种非晶体物质状态，因而避免了慢速冷冻过程中细胞所遭受的机械损伤，同时缩短了冷冻处理所需的时间，简化了步骤，也不需要昂贵的程序降温仪，逐渐成为胚胎和卵母细胞冷冻的趋势。

但是，高浓度的冷冻保护剂对细胞有较大的化学毒性，在操作时间上不易掌握。

因此，在具体实施玻璃化冷冻时，要注意保护剂浓度和作用时间的平衡，既要使细胞质充分脱水，又不能作用时间过长，或者进一步寻找开发容易实现玻璃化且对细胞损伤较小的防冻剂。

根据采用不同的材料和处理方法分为：

OPS法（OpenPulledStraw，OPS—开放式细管）；

冷冻环（Cryo-loop）法；

玻璃微细管法；

封闭式细管法，此方法和OPS法很相似，不同的是需要封住细管的两端，使用0.25ml细管，不需要自己拉制细管；

电镜铜网法，利用电镜的铜网作为胚胎的载体，将电镜铜网连同胚胎一起放入液氮中。

（1）OPS法。

这是利用0.25ml细管，