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与之前对申报资料的要求相比,更加明确了中间体质量研究的重要性,为使该品种顺利申报,在对中间体研究的方案设计时就加大了质量研究工作,明确了中间体方法验证的必要性。
根据《化学药物原料药制备和结果确证研究技术指导原则》《化学药物治疗控制分析方法验证技术指导原则》等相关法规,我们对中间体的质量控制方法及限度进行了研究。
本文主要总结了拉呋替丁的中间体的质量分析方法的研究工作。
1.合成工艺试验部分
1.1反应式
1.2具体工艺流程
1.2.1N-{-4-[4-(哌啶基甲基)吡啶基-2-氧代]-顺-2-烯丁基}邻苯二甲酰亚胺(LF-08)的制备
将5Kg马来酸盐投入到50L反应釜中,倒入乙酸乙酯20L,机械搅拌,使其悬浮。
降温至0-10℃,滴加10%NaOH溶液搅拌5小时至固体完全溶解。
分出水层,有机层用饱和食盐水洗。
减压蒸干溶剂,直接用于下一步反应。
1.2.24-[4-(哌啶基甲基)吡啶基-2-氧代]-顺-2-烯丁胺(LF-09)的制备
50℃下用20L乙醇将LF-08溶解,降温至0-15℃倒入甲胺10L,自然升至室温(20-30℃)反应5小时。
降温至0-15℃缓慢倒入10%NaOH溶液(0.5Kg溶解到3L水中),反应1hr。
减压浓缩溶剂,至基本不再滴出。
向反应罐中加入3L饱和氯化钠溶液和20L乙酸乙酯溶液,搅拌10min,静置,分出水层。
有机层用饱和食盐水洗,用无水硫酸钠(1.5Kg)干燥2小时,滤除干燥剂,用1L乙酸乙酯洗滤饼。
滴定测得LF-099.14mol,收率92.7%。
1.2.3LF-10的制备
将上述溶液置于50L反应釜中,搅拌下加入活性酯2.82Kg,20-30℃反应3hr。
降温至0-10℃滴加盐酸溶液(0.8L溶于8L水)。
分出水层,用乙酸乙酯提取。
水层倒回反应罐,加入乙酸乙酯17L,冰浴0-10℃滴加氢氧化钠溶液(0.72Kg溶于5L水中)。
滴加完反应20min,分出水层,有机层用饱和食盐水洗。
50℃,2Kg无水硫酸镁干燥2hr,过滤,干燥剂用2L乙酸乙酯洗。
滴定得8.4mol,3.62Kg,收率92%。
0-15℃搅拌析晶5hr。
过滤,滤饼用乙酸乙酯(3L、2L)洗。
得粗品3.4Kg。
母液浓缩至2L,0-15℃搅拌析晶5hr,回收产品0.2Kg。
1.2.4重结晶
将3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解,加入0.17Kg活性炭脱色20min热过滤,用1L乙酸乙酯洗滤饼,滤液倒回20L反应罐,降至0-10℃析晶5hr,过滤,用2L乙酸乙酯洗滤饼,得3.06KgII型拉呋替丁,精制率90%,母液浓缩至2L,回收产品0.27Kg,待与其他批合并处理。
1.2.4转晶
将3.4Kg拉呋替丁粗品用16L乙酸乙酯回流溶解,加入0.17Kg活性炭脱色20min热过滤,用1L乙酸乙酯洗滤饼,滤液倒回20L反应罐,降至0-10℃析晶5hr,过滤,用2L乙酸乙酯洗滤饼,得3.06KgII型拉呋替丁,精制率90%。
2.质量研究部分
2.1有关物质的研究
我公司选定的工艺路线是以市售的马来酸盐和活性酯为起始原料,其中关键反应步骤,为胺解步骤。
我们对胺解过程反应生成的两个中间体(LF08和LF09)进行了分离纯化,并通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱进行了结构确证为顺-N-甲基-N-(4-(4-哌啶基甲基)吡啶基-2-氧代)-2-烯丁基)邻苯二甲酰胺(LA)和邻苯二甲酰胺二甲胺。
从而推测胺解反应按如下机理进行:
缩合步骤的反应过程如下:
综上所述,合成中可能产生的杂质如表1所示。
表1拉呋替丁生产工艺过程中可能产生的所有杂质
杂质名称
杂质结构
杂质来源
马来酸盐
起始原料
活性酯(LF-14)
LF-08
胺解步产物
LA
胺解步中间产物
邻苯二甲酰胺二甲胺
N-甲基邻苯二甲酰亚胺
可能杂质
邻苯二甲酸
C8H6O4
对硝基苯酚
缩合步产物
拉呋替丁在合成工艺变更后,其杂质的情况发生了一些变化。
为了能对新工艺中存在的杂质进行全面的检查,需要对有关物质检查的方法进行全面的研究。
通过研究验证,采用了梯度洗脱的HPLC法对本品进行有关物质的测定。
另外,在这些杂质中,由于对硝基苯酚具有对皮肤有强烈刺激作用和可引起高铁血红蛋白血症等毒害作用,应该进行严格控制。
为了能对其进行准确测定,另行研究了对硝基苯酚HPLC的测定方法。
2.2有关物质分析方法的选择与验证
2.2.1试验仪器及试剂
试验仪器:
Waterse2695,2489检测器,2998进样器
安捷伦液相色谱仪1200
试剂:
磷酸二氢钾分析纯
甲醇色谱纯
乙腈色谱纯
2.2.2色谱条件的选择
(1)检测波长的选择
分别称取LA、LF09、LF08马来酸盐和拉呋替丁,用流动相(0.02M磷酸缓冲盐-乙腈(80∶20)溶解并稀释制成0.1mg/ml的溶液,进行紫外全波扫描,各溶液的最大吸收波长见表2。
表2不同溶液的紫外光谱测定结果
样品及杂质
最大吸收波长
194,217,277
LF09
193,217,278
191,221,280
拉呋替丁
192,217,278
由表2可见,拉呋替丁及相关物质的最大吸收峰比较接近,均约为193nm、217~220nm和278nm附近。
根据测定吸收峰应避开流动相中溶剂的末端吸收峰,并应有较高的吸收值的原则,选择检测波长为220nm。
(2)流动相选择
以流动相为溶剂,分别配制LA、LF09、马来酸盐、拉呋替丁粗品及拉呋替丁样品的试验溶液,溶液浓度约为0.1~0.2mg/ml,采用不同的流动相条件,在220nm波长下进行测定,其试验结果如下:
A.采用流动相A为甲醇-乙腈-0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液(用三乙胺调节pH值至6.0)(25∶15∶60),进行各试验溶液的测定。
试验结果见表3。
表3采用流动相为甲醇-乙腈-0.2mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液的测定结果
主峰保留时间(分)
溶剂空白
3.33,4.6
14.4
4.68
3.67(实际主峰未检出)
18.3
拉呋替丁粗品
9.74(0.52%),10.62(0.18%)
B.流动相改变缓冲液浓度和流动相比例,缓冲液(0.02mol/LKH2PO4)∶乙腈(80∶20),测定结果见表4。
表4改变流动相测定结果
保留时间(分)
2.169,2.364
5.07(95.7%)
2.26(98.5%)
2.49(实际主峰未检出)
7.188(99.8)
7.229(97.2%),2.198(1.4%),34.3(0.4%)
由于起始原料LF8马来酸盐与中间体LF09的极性相差较大,用流动相为等度的色谱条件进行测定,在流动相中乙腈比例较少时,可检测到中间体LF09,但LF8马来酸盐需超过1小时的检测时间才可检测到;
而当加大流动相中乙腈比例时,在拉呋替丁主峰前的杂质不易分离,故对本品的有关物质检查,宜采用梯度的测定方法。
C.梯度测定方法
参考有关文献[2]并经多种不同的梯度方法进行比较,最后确定采用表5所示梯度测定方法:
表5、拉呋替丁有关物质测定流动相梯度
时间
流动相A(%)
流动相B(%)
87
13
8
20
60
40
20.01
25
分别对各杂质及起始原料按上述梯度方法进行测定,对含有马来酸盐、活性酯、拉呋替丁、LA、LF09、邻苯二甲酰亚胺、邻苯二甲酰甲胺、邻苯二甲酸和对硝基苯酚的混合杂质对照品溶液进行测定,并对拉呋替丁粗品(未经精制的样品)进行测定,其结果见表6。
表6梯度测定结果
拉呋替丁及相关物质
保留时间(分)(归一化%)
3.09,3.7
4.35(94%)
3.66(97%)
19.8(99.88%)
2.08(82.9%)
活性酯
3.37(59.55)19.99(39.3%)
3.35(14.6%)19.0(70.8%)
5.46
5.11(99.3%)
19.98(98.9%)
粗品
2.23(0.35%),3.09(溶剂),3.35(0.05%),3.67(0.56%),
5.77(拉呋替丁98.29%),15.74(0.34%),19.07(0.28%),19.87(0.01%)
从表6可以看出,采用梯度测定方法,拉呋替丁与起始原料及中间体可较好的分离;
对粗品的测定结果表明,该方法可以检出各种原料和中间体、副产物杂质。
2.2.3专属性
按照上述确定的梯度测定的色谱条件,进行专属性试验。
取流动相A、LA、邻苯二甲酰胺二甲胺、N-甲基邻苯二甲酰亚胺、LF09、活性酯、LF08马来酸盐,邻苯二甲酸、对硝基苯酚和拉呋替丁各适量,以流动相A为溶剂,分别配制各被测物试验溶液(除拉呋替丁溶液浓度为0.2mg/ml外,其余均约为0.02mg/ml),进行测定。
由所测色谱图可见,流动相A作为空白溶剂,出峰时间为3.09分和3.66分,LA的保留时间为4.35分,邻苯二甲酰甲胺的保留时间为3.66分,邻苯二甲酰亚胺的保留时间为19.86分,LF09的保留时间为2.08分,活性酯为3.37分和19.99分(主峰),LF08马来酸盐的保留时间为3.38分和19.07分(主峰),邻苯二甲酸为5.12分,对硝基苯酚为19.99分,拉呋替丁主峰为5.77分,拉呋替丁与各杂质峰均可较好的分离,各杂质之间也可分离。
试验表明,确定的HPLC色谱条件,可以分离各原料及中间体杂质,各杂质与拉呋替丁主峰之间没有干扰。
2.2.4最小检出
称取拉呋替丁对照品1.9mg置10ml量瓶中,用流动相A溶解并稀释至10ml,将此溶液稀释100倍,分别进样10μl、5μl和3μl,测定。
经对图谱分析,进样3μl时,信噪比为3,最小检出量为5.7μg。
2.2.5不同测定方法的比较
分别采用等度和梯度两种不同检测方法,对同一样品进行检测比较。
取同批拉呋替丁样品(试验样品为130902批稳定性加速6个月,分别用两种不同的测定方法进行测定,测定结果见表7和表8。
表7等度法有关物质测定结果
杂质1
杂质2
总杂质(%)
拉呋替丁主峰
17.67
29.33
18.66
杂质含量(%)
0.035
0.066
0.07
-
表8梯度法有关物质测定结果
杂质3
5.11
10.37
19.24
0.02
0.13
由测定结果的比较可以看出,采用修订后的测定方法,主峰前的杂质与主峰的分离度比原标准更好;
另外,采用等度方法,不能将易溶于有机相的杂质检出,在主峰后只检出1个杂质,而采用梯度的方法,可以测定不同极性的化合物,在主峰后,可检出更多的杂质,梯度测定的方法更为灵敏和准确。
2.3对硝基苯酚测定方法验证
2.3.1检测波长的确定
溶液配制:
称取对硝基苯酚5mg,置50ml量瓶中,加乙腈-水(40∶60)溶解并稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml至10ml量瓶中,加乙腈-水(40∶60)稀释至刻度,摇匀。
取此对硝基苯酚溶液,在190nm~700nm波长处进行紫外-可见光谱扫描。
试验结果表明,对硝基苯酚的最大吸收波长为316.2nm。
2.3.2专属性试验
取0.01mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(9∶1)溶液为空白溶液,分别取空白溶液、对照品溶液和供试品溶液,注入色谱仪,照上述测定方法进行测定。
由色谱图可见,空白溶液对对硝基苯酚的测定没有干扰。
2.3.3系统适用性试验
量取对照品溶液10μl,连续注入液相色谱仪,记录色谱图,以最后6针峰面积计算,RSD应不大于5.0%。
测定结果见下表9:
表9系统适用性试验结果
序号
1
2
3
4
5
6
平均
峰面积
1952
1853
1929
1947
1945
1913
RSD%=2.47
系统适用性符合要求。
2.3.4线性
取对照品贮备液,按下表进行稀释,制备线性测定的各对照品溶液。
表10线性溶液配制列表
取对照品储备液体积(ml)
稀释体积(ml)
200
100
50
浓度(μg/ml)
0.01032
0.02064
0.04128
0.0516
0.08256
0.1032
按测定方法进行测定。
测定结果见表11。
表11线性测定结果
平均峰面积
367
708
1504
1841
3135
4130
试验结果:
对硝基苯酚线性范围为0.01mg/ml~0.1mg/ml,
线性方程为y=40308x–132.58,相关系数r=0.9984
试验表明,对硝基苯酚溶液浓度与峰面积的线性关系良好。
2.3.5稳定性试验
取对硝基苯酚对照品溶液,分别在0、2、5、22、23、24小时进行测定,测定结果见表12。
表12溶液稳定性考察结果
时间(小时)
相对零时回收率(%)
1852
94.88
1832
93.85
22
1915
98.16
23
2026
103.8
24
1868
95.70
稳定性试验表明,对照品溶液在24小时内测定,测定结果未见明显变化,表明溶液在24小时内是稳定的。
2.3.6最小定量限和最小检出限
定量限的测定:
取对照品溶液稀释10倍,按测定方法进行测定,信噪比约为10。
检测限测定:
取对照品溶液稀释20倍,按测定方法进行测定,信噪比约为3。
测定结果见表13。
表13定量限和检测限试验结果
定量限
检测限
浓度
信噪比
186
10ng/ml
9.6
113
5ng/ml
3.2
2.3.7重复性试验
取同一批拉呋替丁样品(130901批),按检验方法,同时测定6份,测定结果见表14。
重复性试验结果,对硝基苯酚含量测定的平均值为0.0012%,RSD为13.1%,重复性良好。
表14重复性试验结果
对硝基苯酚含量(%)
0.0014
0.001
0.0013
0.0011
2.3.8样品检验
取拉呋替丁样品(130901批、130902批、130903批)25mg,精密称定,置25ml量瓶中,加流动相A使拉呋替丁溶解,用流动相稀释至刻度,进样10μl,每份分别进样2针,记录色谱图。
测定结果见表15。
三批样品测定结果显示,本品中含对硝基苯酚均未超过0.002%。
表15拉呋替丁中对硝基苯酚测定结果
批号
100901
100902
100903
0.0012
0.0003
4.分析与结论
通过对拉呋替丁合成路线和杂质的分析,通过实验选择并优化了拉呋替丁有关物质的液相分析方法,并对选定的分析方法进行验证。
实验结果表明,梯度洗脱的方法有利于有关物质的检测,相关杂质均能被检出并与主成分峰达到完全分离。
对硝基苯酚在浓度为0.01mg/ml~0.1mg/ml的范围内线性良好,相关系数r=0.9984。
该方法专属性强,简便,准确,灵敏度高,可以作为拉呋替丁中间体对硝基苯酚有关物质的检测方法。
通过多批样品的测试,该方法及限度可有效保证拉呋替丁的质量,并得到有关物质项合格的原料药。
对拉呋替丁原料药的合成有关物质分析方法进行了较全面的研究与验证工作,更加符合当前药品审评的要求,也为今后合成原料药的质量研究工作探索新的思路,并为新的工作积累了经验。
参考文献
[1]渡边,大一,小川等.拉呋替丁的化学构造及其物理化学的性质[J].医药品研究,Vol.26No.7(1995)524~535
[2]上官盈盈,施菁等.高效液相色谱法测定拉呋替丁中有关物质[J].中国现代应用药学杂志,2005,22(4):
304~306