大学《基因工程》复习归纳重点复习资料完整Word文档格式.docx

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第二章DNA重组克隆的单元操作

一、用于核酸操作的工具酶

1.限制性核酸内切酶（主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵）。

限制性核酸内切酶的功能与类型

主要特征

I型

II型

III型

功能

限切/修饰

限切

蛋白结构

异源三聚体

单体

异源二聚体

辅助因子

ATPMg2+SAM

Mg2+

识别序列

TGAN8TGCT

AACN6GTGC

旋转对称序列

GAGCC

CAGCAG

切割位点

距识别序列1kb处

识别序列内

距识别序列下游

24-26bp处

其中II型限制性核酸内切酶：

切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。

特点：

1.识别、并切割双链DNA分子中特异序列的DNA内切酶。

2.识别序列为4-6碱基对的回文对称结构（旋转对称结构）。

3.单体蛋白、仅有限制性内切酶活性，无甲基化酶活性。

4.切割产物末端：

5’突出末端、3’突出末端、平头末端.6.最适温度：

大多为37℃,适盐浓度：

高盐、中盐、低盐。

8.当反应条件不适合时，识别和切割序列发生变化（星号反应）。

星活性（staractivity）：

在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星活性。

引起星活性的因素：

①高浓度甘油（>

5%）、②酶过量（>

100U/g）、③低离子强度（<

25mM）

④高pH（>

pH8.0）、⑤有机溶剂、⑥用其它二价阳离子代替Mg2+，如Mn2+，Cu2+，Co2+,Zn2+。

II型限制性核酸内切酶的命名

具体规则是：

以生物体属名的第一个大写字母和种名的前两个小写字母构成酶的基本名称，如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将株名的一个字母加在基本名称之后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则还需用一个大写字母表示这些非染色体的遗传因子。

酶名称的最后部分为罗马数字，表示在该生物体发现此酶的先后次序。

例子：

Eschericha（属名）coli（种名）R（质粒）大肠杆菌R质粒—EcoRIEcoRV

Haemophilus（属名）influenzae（种名）d（株名）嗜血流感杆菌d株--HindIIHindIII。

罗马数字表示同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶。

特殊性质的II型限制酶：

同裂酶，同尾酶

同裂酶：

又称异源同序酶或异源同工酶，是指识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶识别相同序列，如HindIII–HsuI:

A/AGCTT

同尾酶：

是指识别位点不同，但切出的ＤＮＡ片段具有相同的末端序列的一类酶，如BglII：

A/GATCT；

BamHI:

G/GATCC。

同尾酶的切割产物互为粘性末端，并能连接，但连接后二个酶的识别序列均被破坏。

2.DNA连接酶（T4-DNA连接酶）

功能：

体外连接ＤＮＡ片段

常用的连接酶：

Ｔ４ＤＮＡ连接酶

参与连接反应的基团：

３端羟基和５端磷酸基团，形成磷酸二酯键

DNA连接酶的基本性质：

修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键、修复RNA-DNA杂合分子中DNA链上缺口处的磷酸二酯键、连接多个平头双链DNA分子

T4DNA连接酶的活性单位定义：

在20μl反应体系中于16℃，使HindⅢ切过的DNA（300μg/ml，0.12μM5'

末端）在30分钟内连接50%所需的酶量为1个NEB单位。

3.DNA聚合酶

①大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）

基本性质：

1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性2.5‘→3‘的核酸外切酶活性3.3‘→5‘的核酸外切酶活性

大肠杆菌DNA聚合酶I的基本用途：

1.切口平移标记法2.Nicktranslation3.制备32P标记的探针。

所有的DNA聚合酶中只有此酶有该反应。

缺口平移标记原理见ppt。

大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow酶）：

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得N端三分之二的大肽段，即为Klenow酶。

Klenow酶仍拥有5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性，但失去了5‘→3‘的核酸外切酶活性。

Klenow酶的基本用途：

1.补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端2.DNA片段的同位素末端标记3.cDNA第二链的合成4.双脱氧末端终止法测定DNA序列。

②T4-DNA聚合酶

基本特性：

1.5‘→3‘的DNA聚合酶活性和3‘→5‘的核酸外切酶活性（极强）2.在无dNTP时，可以从任何3‘-OH端外切3.在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位

基本用途：

1.切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端，该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。

2.DNA片段的同位素末端标记。

③依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）

1.以RNA为模板合成cDNA链2.双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链

4.核酸酶

单链核酸外切酶：

核酸外切酶VII（ExoVII）；

双链核酸外切酶：

核酸外切酶III（ExoIII）；

λ核酸外切酶（λExo）

【特异性地从5‘端外切】；

单链核酸内切酶：

S1核酸酶【降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍，比降解单链RNA快7倍】

5．核酸修饰酶

末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）；

碱性磷酸单酯酶【小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（CIP）&

大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（BAP）】；

T4-多核苷酸磷酸激酶（T4-PNP）

二、用于克隆的载体

1.载体（Vector）：

是把外源DNA（目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增或表达的工具。

载体应具备的条件：

1.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或结合位点3.具有较高的外源DNA的载装能力4.具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点（多克隆位点）5.具有合适的筛选标记

2.载体类型：

（1）根据主要用途可以分为：

克隆载体和表达载体

①克隆载体：

主要用于在大肠杆菌细胞中克隆目的基因，或在大肠杆菌或酿酒酵母细胞中构建基因文库。

克隆载体关键元件：

A.多克隆位点B.筛选标记基因C.复制起始位点

表达载体：

除含基因克隆所需元件外，还有供外源基因表达用的启动子、终止子等顺式元件，用于在特定的宿主中表达目的基因。

（2）按传代特性分：

①自主复制型载体：

含复制子，可独立于宿主染色体外复制与传代（穿梭载体：

装有针对两种不同受体的复制起点，便于基因克隆）。

整合型载体：

不含复制子，需借助同源重组机制整合于宿主基因组。

3.分子克隆载体常用类型：

（1）质粒：

15kb以下

严紧型复制控制的质粒：

1-5拷贝，如pSC101

松弛型复制控制的质粒：

30-50拷贝，如ColE1

氯霉素扩增：

在宿主菌生长的中后期，通过添加氯霉素抑制蛋白质合成、关闭主要代谢途径，以使松弛型质粒迅速大量扩增（可达上千拷贝）的操作。

质粒载体的特点：

分子量小，便于操作；

易于构建，可作为其他宿主系统载体的骨架；

用途广泛；

缺点：

装载量小（小于10kb），不能用来克隆大片段。

重要的大肠杆菌质粒载体：

pBR322：

松弛型复制；

氯霉素可扩增；

拷贝数50–100/cell；

用于基因克隆。

还有pUC18/19；

T载体，详见ppt，了解一下。

实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：

1氯化铯密度梯度离心法：

质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染；

②碱裂解法（最常用）：

质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间；

③沸水浴法：

质粒DNA纯度底、快速、操作简便。

质粒的不相容性的分子机制

两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，可导致子代细胞质粒组成不同，且这种差异具随机性，经过若干代后宿主细胞中处于数量弱势的质粒必然被淘汰，而仅剩强势质粒。

质粒载体不稳定性的类型

分离的不稳定性：

在细胞分裂过程中发生的质粒不平均的分配，有的细胞没有获得质粒DNΑ拷贝，并最终增殖成为无质粒的优势群体。

结构的不稳定性：

由转位作用和重组作用所引起的质粒DNΑ的重排与缺失。

影响质粒载体稳定性的主要因素

新陈代谢负荷对质粒载体稳定性的效应；

拷贝数差度对质粒载体稳定性的影响——低差度-稳定/高差度-不稳定；

寄主重组体系对质粒载体稳定性的效应——形成重组质粒二聚体，便会以高出质粒单体分子两倍的速度进行复制，从而导致出现质粒寡聚体的克隆增殖。

（2）lamda噬菌体DNA:

　25kb

λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体，由外壳包装蛋白和l-DNA组成。

DNA重组技术一般需要λ噬菌体进入溶菌状态

λ-DNA是线性双链DNA分子，全长48502个核苷酸。

λ-DNA两端各带有一个12bp的粘性末端，称为cos位点。

噬菌体感染细菌以后，双链DNA分子通过COS位点成环状。

①插入型载体：

改造后的长度正好为包装的下限，因而本身也能被包装，叫插入型载体

1.cI基因失活：

cI基因失活后将导致噬菌体不能溶原化，产生清晰的噬菌斑。

相反，产生混浊的噬菌斑。

2.LacZ基因插入失活：

在lacZ基因上有EcoRI位点，插入失活后利用X-gal法筛选（蓝白筛选）。

②取代型载体：

长度为40kb，在非必需区域有酶切位点，距离为14kb。

载量为10-25kb。

用取代型载体克隆外源DNA可能需要经过哪些步骤？

第一，应用适当的核酸内切限制酶消化λ载体，除去基因组中可取代的DNA区段。

第二，将上述所得的λDNA臂同外源DNA片段连接。

第三，对重组体的λDNA分子进行包装和增殖，以得到有感染性的λ重组噬菌体。

λ-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。

λ-DNA作为载体的优点：

1.λ-DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌2.λ-DNA载体的装载能力为25kb，远远大于质粒的装载量3.重组l-DNA分子的筛选较为方便4.重组λ-DNA分子的提取较为简便5.λ-DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。

cos质粒：

lamdaDNA的cos区和质粒组成的载体:

31-45kb

（3）考斯质粒载体的特点：

1.能像λ-DNA那样进行体外包装，并高效转染受体细胞2.能像质粒那样在受体细胞中自主复制3.重组操作简便，筛选容易4.装载量大（45kb）且克隆片段具有一定的大小范围5.不能体内包装，不裂解受体细胞.

（4）人工染色体载体

人工染色体实际上是一种“穿梭”克隆载体：

含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（ori），还含有第二受体（如酵母菌）染色体DNA着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。

①细菌人工染色体（BAC）:

50-300kb,　主要用于基因文库构建——易于发生重组、缺乏稳定性、制备工艺繁琐

2酵母人工染色体（YAC）:

350-400kb，主要用于基因文库构建——克隆大型基因簇（genecluster）结构&

构建动植物基因文库

三、用于基因转移的受体菌或细胞

（1）受体（宿主）应具备的条件

1.限制性缺陷型——外切酶和内切酶活性缺陷（hsdR-）2.重组整合缺陷型——用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-，recB-，recC-）3.具有较高的转化效率4.具有与载体选择标记互补的表型5.感染寄生缺陷型——防止重组细菌扩散污染，生物武器除外。

（2）各种基因工程受体（宿主）的特性

A.大肠杆菌——遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定。

适用于外源DNA的扩增和克隆、基因文库的构建和外源基因的高效表达，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌。

产生结构复杂、种类繁多的内毒素。

B.枯草芽孢杆菌——遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素。

遗传欠稳定，载体受体系统欠完备。

适用于重组蛋白与多肽、特别是微生物来源的酶的高效分泌表达。

C.链霉菌——抗生素的主要生产者，相对操作简便，不产内毒素。

遗传不稳定，生长相对缓慢。

主要用于抗生素生产菌株的改良。

D.酵母菌——具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定。

内源性蛋白产物种类繁多且含量高。

适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌。

E.昆虫细胞（家蚕，杆状病毒表达系统）——具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定。

DNA重组操作系统欠完善。

适用于真核生物基因的高效表达。

F.哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO）——与人的亲缘关系近，表达系统完善，具有合适的糖基化修饰系统。

细胞培养条件苛刻，生长缓慢。

适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体。

G.植物细胞（拟南芥菜、烟叶）——农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用。

遗传操作繁琐。

适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良。

实验室常用的基因工程受体（宿主）：

大肠杆菌；

真菌：

酵母菌（毕赤酵母，汉森酵母，啤酒酵母）&

丝状真菌（黑曲霉、青霉）；

哺乳动物细胞CHO

（3）大肠杆菌转化常用方法

感受态（compentent）：

受体（宿主）细胞经过一些理化或生物学方法处理后，细胞膜的通透性发生暂时性的改变，成为能允许外源DNA进入的一种生理状态。

感受态细胞（compententcell）

①CaCl2法原理

Ca2+诱导的完整细胞的转化适用于革兰氏阴性细菌（如大肠杆菌等），1970年建立此技术，其原理是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，转化混合物中的DNA与其形成抗Dnase的羟基-钙磷酸复合物黏附于细胞表面，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态即为感受态。

具体大肠杆菌感受态细胞的制备及质粒转化详见ppt。

②电转化法③热激法

转化率的定义：

每微克DNA分子转化宿主菌能获得的转化子数。

例如，pUC18对大肠杆菌的转化率为108，即每微克pUC18中只有108个分子能进入受体细胞。

一微克pUC18共有3.4X1011个分子（6.02X1017/2686X660），也就是说，每3400个pUC18分子才有一个分子进入受体细胞。

另一方面，在实际操作过程中，转化一微克pUC18共需2ml感受态细胞，大约含有2X1010个大肠杆菌细胞，也就是说，每200个细胞只有一个细胞能接纳pUC18DNA。

不同转化方法转化率：

Ca2+诱导转化——106–107/mgDNA原生质体转化——105–106/mgDNA

λ-DNA转染——107-108/mgDNA电穿孔转化——106–109/mgDNA

转化子的筛选和鉴定（检）

由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子。

转化子筛选和鉴定流程

1、筛选—选择性平板筛选→2、重组子初步鉴定——显色、PCR、比大小、酶切、分子杂交、生物/免疫学活性→3、重组子确证—DNA序列分析→4、外源基因表达产物检测——仅当外源基因克隆于特定表达载体和宿主中时才需要。

常规基因克隆则否。

转化子筛选方法：

抗药性筛选法；

营养缺陷型筛选法；

显色筛选法——lacZ’基因（蓝色反应）、链霉菌质粒pIJ702携带的melC基因（黑色反应）等；

DNA电泳检测【直接电泳检测法；

限制性酶切图谱法；

PCR扩增检测法】；

原位杂交法（高通量筛选）；

DNA序列分析——双脱氧末端终止测序法；

外源基因表达产物检测法【聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）；

酶联免疫吸附法—ELISA；

免疫印记（Westernblotting）；

蛋白质生物功能测定法（高通量筛选）—淀粉酶基因；

原位免疫沉淀法（高通量筛选）；

放射免疫原位杂交鉴定】

四、基因克隆

基因文库：

从特定生物个体中分离的全部基因，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。

根据构建方法的不同，基因文库分为：

基因组文库（含有全部基因）&

cDNA文库（含有全部蛋白质编码的结构基因）。

在高度分化的生物体中cDNA文库的信息量远小于基因组文库

基因克隆常用方法：

①鸟枪法

基本策略：

染色体DNA的切断：

超声波处理——片段长度均一，大小可控，平头末端；

全酶切——片段长度不均一，粘性末端便于连接，但有可能使目的基因断开，大小不可控；

部分酶切——片段长度可控，含有粘性末端，目的基因完整。

与载体连接：

如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择多拷贝克隆载体；

如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择表达型载体。

转化受体细胞——如果转化子采用菌落原位杂交法或限制性酶切图谱法筛选，则选择大肠杆菌作为受体细胞；

如果转化子采用基因产物功能检测法筛选，则选择能使目的基因表达的受体细胞。

筛选含有目的基因的目的重组子：

菌落原位杂交法、基因产物功能检测法（筛选模型的建立）。

②cDNA法

【cDNA第一链的合成→cDNA第二链的合成（自身引导法、置换合成法、引导合成法、）】/双链cDNA的克隆→离目的基因（完备分离程序、特异分离程序、差异分离程序）

③PCR法

使用PCR法克隆目的基因的前提条件是：

已知待扩增目的基因或DNA片段两侧的序列，根据该序列化学合成聚合反应必需的双引物

由TaqDNA聚合酶扩增的PCR产物中，其3’末端总是会带有一个非模板依赖型的突出碱基，而且这个碱基几乎总是A，因为TaqDNA聚合酶对dATP具有优先聚合活性。

由于该突出碱基的存在，克隆时即可以采取TdT末端加同聚尾的方法与载体拼接，也可以使用专门的T载体克隆。

④化学合成法（全基因合成）

基因文库的完备性是指：

在构建的基因文库中任一基因存在的概率，它与基因文库最低所含克隆数N之间的关系可用下式表示：

N=ln（1–P）/ln（1–f）

其中：

P=任一基因被克隆（或存在于基因文库中）的概率，f=克隆片段的平均大小/生物基因组的大小。

基因文库的构建程序

1.基因组DNA的制备：

2.基因组DNA的切割：

用于基因组文库构建的DNA片段的切割一般采用超声波处理和制性内限切酶部分酶切两种方法，其目的是：

第一，保证DNA片段之间存在部分重叠区；

第二，保证DNA片段大小均一。

连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体

3.载体和受体的选择：

出于压缩重组克隆的数量，用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的λ-DNA或考斯质粒；

对于大型基因组（如动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。

cDNA文库构建的载体通常选质粒；

用于基因文库构建的受体则根据载体使用大肠杆菌或酵母菌。

4.从基因文库中筛选目的基因：

可以采用特殊的正选择筛选程序（如抗药性筛选法、酵母双杂交技术等）直接筛选外，一般的基因组文库筛选均需多轮操作步骤。

原位杂交法。

第三章大肠杆菌基因工程

一、大肠杆菌表达（生产）系统的优缺点

大肠杆菌表达系统的优点

1.遗传背景清楚（4405个ORF），便于基因操作2.表达水平高，遗传较稳定

3.优良的工业性能：

繁殖迅速、培养简单、操作方便4.被美国FDA认定为安全的重组药物生产系统

大肠杆菌表达系统的缺点

1.缺乏翻译后修饰加工系统（不能表达糖基化蛋白、结构复杂的蛋白等）2.胞内缺乏高效的表达产物折叠机制（形成包涵体），分泌机制不完善3.细胞周质内含有种类繁多的内毒素

二、大肠杆菌系统高效表达原理

①大肠杆菌系统表达载体的基本元件

A、目的基因：

编码外源蛋白的结构基因B、转录元件：

启动子、终止子

C、翻译元件：

核糖体结合位点、翻译起始位点

D、克隆元件：

克隆位点、复制原点、标记基因

E、翻译后元件（非必须）：

信号肽、融合肽

②外源基因在大肠杆菌中高效表达原理

A、启动子（Promoter）

是DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能起始RNA合成的序列。

是基因表达最关键和最强的表达调控元件，启动子的强弱对表达水平有决定性影响。

（没有启动子，基因就不能转录）。

启动子有种属特异性（如真核的在原核宿主中无效），有组成型（组成型表达系统）和诱导型（诱导型表达系统）二大类。

原核基因启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成：

（1）Pribnow盒，位于转录起始位点上游5—10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，故又称为TATA盒或—10区。

（2）—35区，位于转录起始位点上游35bp处，故称—35区，一般由10个碱基组成。

常用原核基因启动子：

【lac（乳糖启动子）；

trp（色氨酸启动子）；

tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子——Ptac=Ptrp的-35区+Plac的-10区）；

T7启动子】——IPTG诱导；

PL和PR（λ噬菌体的左向和右向启动子）——温控（热诱导），30℃/37℃培养，42℃诱导。

T7启动子——最成功的启动子

A.强大的T7启动子完全专一受控于T7RNA聚合酶，

B.T7RNA聚合酶合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶的快5倍

C.由于大肠杆菌本身不含T7RNA聚合酶，需要将外源的T7RNA聚合酶引入宿主菌（采用DE3溶源菌，T7RNA聚合酶置于LacUV5启动