两种特异性引物聚合酶链反应乙型肝炎病毒基因分型法的Word文档下载推荐.docx
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第一轮扩增
BF
5’-ACGGGGCGCACCTCTCTTTA-3’
1519~1538
HBAS-4V
5’-ATAGGGGCATTTGGTGGTCT-3’
2316~2297
PF
5’-TTATGCCTGCTAGGTTYTATCC-3’
2635~2656
S4R
5’-AGAAGATGAGGCATAGCAGC-3’
434~415
第二轮扩增
MixA
HB
5’-ACCGTGAACGCCCACMGGAA-3’
1617~1636
BJA-RV
5’-TTCTTTATACGGGTCAATGTCCATG-3’
1924~1900
DF
5’-GCAGAATCTTTCCACCAG-3’
2853~2870
C1F
5’-TCACTCCRCCACACGGCAA-3’
3047-3065
C2F
5’-CACCGAACATGGAGARCACA-3’
147~166
PR
5’-TTGGTGAGTGATTGGAGGTTG-3’
341~321
MixB
AF1a
5’-GCCTACTAGATTCTATCCTACCCAC-3’
2645~2669
AF2
5’-GCCTACTAGATTTTATCCTAACAGC-3’
BA1R
5’-CTCGCGGAGATTGACGAGATGT-3’
111~132
MixC
BA
5’-GTGTCGAGRAGATCTCGAATA-3’
1998~1978
BJ
5’-TGATCTTTAGGCCCATGTTAGT-3’
2192~2171
Y：
C或T，M：
A或C，R：
A或G
aAF1和AF2为简并引物
2．质粒
含B1亚型的基因组质粒由日本传染病研究所Abe教授馈赠；
含A基因型和C2亚型的基因组质粒由广州南方医院侯金林教授馈赠[9]；
含D基因型的基因组质粒由澳大利亚Victorian传染病参比实验室Locarnini教授馈赠[10]，均于-20℃保存备用。
3.血清样本：
共计113份慢性乙型肝炎患者血清或HBVDNA标本用于本研究。
其中96份随机选取自本室血清库，均为HBVDNA阳性，其中深圳61份，河北邯郸35份。
另有17份新疆地区少数民族慢性乙型肝炎患者HBVDNA标本由北京佑安医院李卓提供。
所有标本于-20℃保存备用。
4．DNA提取和扩增
使用RNAgents®
TotalRNAIsolationSystem核酸提取试剂盒（购自Promega公司），从50l血清中提取病毒DNA，沉淀物溶于20l灭菌双蒸水中。
新方法第一轮PCR扩增体系为：
10×
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，BF（10M）1l，HBAS-4V（10M）1l，PF（10M）0.6l，S4R（10M）0.6l，TaqDNA聚合酶1.5U（购自广州东盛生物科技有限公司），HBVDNA5l，灭菌双蒸水9.1l，共20l。
循环参数：
95℃预变性10min；
95℃30s，58℃30s；
72℃1min，扩增40个循环；
72℃，7min。
第二轮PCR扩增体系MixA为：
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，HB（10M）0.6l，BJA-RV（10M）0.6l，DF（10M）0.6l，C1F（10M）0.6l，C2F（10M）0.6l，PR（10M）0.6l，TaqDNA聚合酶1.0U，第一轮扩增产物1l，灭菌双蒸水12.8l，共20l；
MixB为：
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，A1F（10M）0.6l，A2F（10M）0.6l，BA1R（10M）0.6l，TaqDNA聚合酶1.0U，第一轮扩增产物1l，灭菌双蒸水14.6l，共20l；
MixC为：
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，HB（10M）0.6l，BA（10M）0.6l，BJ（10M）0.6l，TaqDNA聚合酶1.0U，第一轮扩增产物1l，灭菌双蒸水14.6l，共20l。
循环参数同第一轮扩增。
Natio方法扩增体系和循环参数参考文献[6]进行。
第一轮PCR扩增体系为：
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，P1（10M）0.6l，S1-2（10M）0.6l，TaqDNA聚合酶1U（购自广州东盛生物科技有限公司），HBVDNA5l，灭菌双蒸水11.2l，共20l。
95℃20s，55℃20s；
第二轮PCR扩增体系分两个Mix，MixA为：
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，B2（10M）0.6l，BA1R（10M）0.6l,BB1R（10M）0.6l,BC1R（10M）0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U，第一轮扩增产物1l，灭菌双蒸水14l，共20l；
MixB为10×
Buffer（Mg2+15mM）2l，dNTPs（10mM）0.4l，B2R（10M）0.6l，BD1（10M）0.6l,BE1（10M）0.6l,BF1（10M）0.6l,TaqDNA聚合酶1.0U，第一轮扩增产物1l，灭菌双蒸水14l，共20l；
95℃20s，58℃20s；
72℃30s，扩增20个循环；
95℃20s，60℃20s；
5.HBVDNA定量检测
HBV核酸扩增（PCR）荧光定量检测试剂盒购自深圳匹基生物工程有限公司，采用Bio-Rad公司的iCycler荧光定量PCR仪进行HBVDNA定量检测。
6.两种方法的灵敏度比较
6.1用含A、D基因型和B1亚型基因组的质粒进行系列稀释，分别检测两种方法对相关基因型的灵敏度。
并将含B1亚型基因组的质粒与含C2亚型基因组的质粒分别按以下浓度混合（表2），模拟B/C混合型样本，以评价两种方法对B/C混合型样本的检测灵敏度。
表2含B1亚型的基因组质粒与含C2亚型的基因组质粒不同混合浓度
标本号
1
2
3
4
5
6
7
8
B1:
C2浓度（拷贝/ml）
104:
108
105:
108:
107
106
105
104
103
C2浓度比例
1:
10000
1000
10:
100:
1000:
10000:
100000:
6.2评价两种方法对临床血清标本的灵敏度。
随机选取68份HBVDNA浓度为102～109拷贝/ml血清标本（其中深圳市52份，邯郸市16份），分别用两种方法检测血清标本中HBV基因型及基因亚型。
新疆地区17份标本因无原始血清，未能做DNA定量。
7.两种方法的特异度比较
7.1分别用两种方法的单套型特异性及亚型特异性引物（即HB/BJA-RV、C1F/C2F/PR、DF/PR、AF1/AF2/BA1R、HB/BA、HB/BJ、B2/BA1R、B2/BB2R、B2/BC1R、B2R/BD1）对含A、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒以及经X区和PerC/C区测序证实为B2亚型的血清样本和经PreS区测序证实为C1亚型的血清样本进行检测，以评价两种方法的单套型特异性引物对各型样本的特异度。
7.2用Natio方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R和MixB:
B2R/BD1/BE1/BF1对不同浓度（108-103拷贝/ml）的含D基因型的质粒进行检测，并用引物B2R/BE1对浓度为107拷贝/ml的含D基因型的质粒进行检测，以评价Natio方法对D型样本的特异度。
7.3DNA测序
因为核酸测序是HBV基因型检测的金标准，所以随机选取两种方法分型结果不一致的标本进行核酸测序验证。
对D基因型的样本，用测序引物SF[6]和PR3进行第二轮PreS区的扩增后，将纯化后的扩增产物直接测序；
用B亚型分型引物HB、BA和BJ进行第二轮部分X区和PreC/C区的扩增后，将纯化后的扩增产物直接测序，进行B基因亚型的鉴定；
对混合型样本分别用各基因型和亚型特异性引物进行第二轮扩增（由于C2亚型的扩增片段较短，不足以进行测序分析，因此，采用具有C2亚型特异性的引物C2F和下游通用引物PR3进行第二轮PreS区和S区的扩增后，将纯化后的扩增产物直接测序）。
PCR产物经UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒（购自上海生工生物工程技术服务有限公司）纯化，测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。
SF和PR3引物的序列如下：
SF（正义链）：
5’tcaccatatacatgggaacaaga3’（nt:
2817~2839）；
PR3（反义链）：
5’catagcagcaggatgaagagga3’（nt:
423~402）。
其余引物见表一。
7.4测序结果的计算机分析
首先用NCBI中的病毒基因分型系统（登录http:
//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）对测序结果进行初步的基因分型，然后用MEGA4.0软件构建进化树（Neighbourjoining法）进行基因型和亚型的分析，同时作Bootstrap（1000replicates）分析，以确定所建进化树的可靠性。
结果
1.两种方法的灵敏度比较
1.1对系列稀释的质粒检测灵敏度比较
将A、B1和D质粒进行倍比稀释（108~102拷贝/ml），然后用两种方法分别对其进行检测。
结果显示，两种方法均可分别检测到103拷贝/ml的A、B1和D质粒。
1.2对B1质粒和C2质粒混合样本检测结果比较
如图1所示，1~8道为新方法对不同浓度比例的B/C混合型样本的检测结果，9~16道为Natio方法对不同浓度比例的B/C混合型样本的检测结果（B/C混合型浓度表见表2）。
2~6道的B1:
C2质粒浓度比例在1:
1000~1000:
1之间，说明在B/C混合型样本中，只要B型或C型浓度所占比例在1‰以上，就能被新方法检测到；
而如第12道所示，当B1:
C2浓度比为10:
1时，Natio方法对C型的检出效率就明显下降，而如第13道所示，B1:
C2浓度比为100:
1时，Naito方法就完全检测不到C型的存在了。
提示在模拟B/C混合型样本的检测中，新方法对B/C混合型样本检测的灵敏度优于Natio方法。
另外，如第1道和第9道所示，当B1:
C2浓度比为1:
10000时，新方法检测结果提示该样本中的优势毒株为C2亚型，只有少量的B型；
而Naito方法检测结果仍为B/C混合型，无法提示样本中优势毒株的基因型。
图1不同浓度B1和C2质粒混合物检测效果示意图
注：
1~8道为新方法的扩增产物，样本分别为不同比例的B1:
C2质粒混合物；
9~16道为Natio方法的扩增产物，样本分别为不同比例的B1:
C2质粒混合物。
B1和C2质粒的配比见表2。
1.3对临床血清样本检测的灵敏度比较
随机选取68份完成HBVDNA定量的血清样本，分别用两种方法检测其基因型，结果如表3所示，两种方法均可检测HBVDNA浓度范围为102~109拷贝/ml（其中2份<
5×
102拷贝/ml）的血清样本。
两种方法均具有较高的灵敏度。
2．两种方法的特异度比较
2.1两种方法的单套引物的特异度比较
我们已经证实新方法对各型样本的特异度都很好[8]，在本文中我们又分别用两种方法的单套型特异性引物，即新方法的HB/BJA-RV、C1F/C2F/PR、DF/PR、AF1/AF2/BA1R、HB/BA、HB/BJ和Naito方法的B2/BA1R、B2/BB1R、B2/BC1R、B2R/BD1来分别检测含A、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒以及经X区和PerC/C区测序证实为B2亚型的血清样本和经PreS区测序证实为C1亚型的血清样本，结果再次证实新方法的各套单引物均具有较高特异度，即各特异性引物只能扩增出其对应的基因型或者亚型的样本。
而对于Natio方法，B2/BA1R能扩增出A、B1、B2、C1、C2型的样本；
B2/BB1R能扩增出A、B1、B2、C1、C2、D型的样本；
B2/BC1R能扩增出A、C1、C2、D型的样本；
B2R/BD1能扩增出A、D型的样本，单引物的特异度不足。
2.2Natio方法对含D基因型的质粒的特异度评价
用Naito方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R对不同浓度（108~103拷贝/ml）的含D基因型的质粒进行检测，发现检测结果均为B/C混合型（如图2（a））。
如图2（b）所示，用Naito方法的引物MixB:
B2R/BD1/BE1/BF1对不同浓度（107~103拷贝/ml）的含D基因型的质粒进行检测，发现当D型质粒浓度为103拷贝/ml时，检测结果为D型；
当D型质粒浓度为106~104拷贝/ml时，检测结果为D/E混合型；
当D型质粒浓度为107拷贝/ml或更高时，检测结果为E型。
用引物B2R/BE1对浓度为107拷贝/ml的的含D基因型的质粒进行检测，结果也为E型。
提示Naito方法对HBVD基因型样本的特异度有待提高，当检测含D基因型的样本时，会误判为B/C/D混合型或者B/C/D/E混合型。
（a）
（b）
图2Naito方法对D型质粒的扩增产物电泳图
（a）为Naito方法的引物MixA:
B2/BA1R/BB1R/BC1R对含D基因型的质粒的检测结果，1道~6道分别为108~103拷贝/ml的D型质粒的检测结果，7道为阴性对照。
（b）为Naito方法的引物MixA:
B2R/BD1/BE1/BF1及引物B2R/BE1对含D基因型的质粒的检测结果，1道为引物B2R/BE1对107拷贝/ml的D型质粒的检测结果，2道~6道分别为107~103拷贝/ml的D型质粒的检测结果，7道为阴性对照。
2.3对113份血清或HBVDNA样本的检测及测序验证结果
分别用两种方法对来自深圳市、河北邯郸市、新疆乌鲁木齐市的113份血清或HBVDNA样本进行检测，两种方法检测结果的总符合率为83.2%（94/113），不一致率为16.8%（19/113），检测结果见表3：
表3两种方法对113份样本的检测结果
结果一致（共94例，83.2%）
检测结果不一致（共19例，16.8%）
单型别（89/94，94.7%）
混合型
（5/94，5.3%）
单型别（9/19，47.4%）
混合型（10/19，52.6%）
B
（21/94）
22.3%
C
（61/94）
64.9%
D
（7/94）
7.4%
B/C
（4/94）
4.3%
B/C/D
（1/94）
1.1%
（9/19）
47.4%
（6/19）
31.6%
C/D
（3/19）
15.8%
（1/19）
5.3%
新方法
B*
C1
C2
B/C2
B/C1/D
D#
B/C2#
C2/D
B/C2/D
Natio方法
B
B/C/D/E
B/D/E
B/D
例数
21
53
#部分样本进行了PCR产物直接测序验证，结果与新方法一致；
*新方法检测的B基因型毒株全部为Ba基因亚型。
在两种方法检测结果不一致的样本中随机选取7份样本，其中4份新方法鉴定为D，而Natio法鉴定结果分别为B型、B/C/D混合型、B/C/D/E混合型及B/D/E混合型；
3份新方法鉴定为B/C2混合型，而Natio法鉴定结果分别为B型（2份）和C型（1份）。
对这7份样本以PCR产物直接测序法进行验证，与新方法分型结果一致。
图3应用PreS区核苷酸序列进化树分析HBV基因型和亚型
本研究共7份测序标本，但其中3株为B2和C2混合型，因此，图内所示为10份，其他为参比株。
讨论
本研究通过检测含HBVA、D基因型和B1、C2基因亚型的质粒，以及113例来自深圳、邯郸、新疆地区的血清样本，对两种不同的型特异性引物PCR分型法进行了评价，结果证明我室建立的新方法灵敏度与Naito方法一致，而特异度显著优于Natio方法。
另外，我们的引物设计考虑到我国HBV基因型的分布特点，即目前我国大部分地区的优势基因型主要是B型和C型，新疆等地的少数民族人群中为D型，本着经济适用的原则，把检测B型、C1、C2亚型及D型的引物放入一个试管中检测，这样仅通过两轮PCR反应就能检测出我国绝大部分样本的基因型，且能同时分出C1和C2亚型；
对于B1亚型流行的日本地区，可用我室的新方法鉴定为B型后，再以第一轮PCR产物为模板，用引物HB/BA/BJ鉴定B亚型。
对于A型流行的地中海地区，可用我室的新方法做第一轮PCR扩增后，再分别用HB/BJA-RV/DF/C1F/C2F/PR和AF1/AF2/BA1R两套引物做第二轮PCR扩增。
因此，新方法不仅适合于对国内的样本进行大批量的流行病学筛查，也适合对日本、西亚等地区做初步的流行病学筛查。
两种方法的不同检测结果导致了深圳和新疆的基因型/亚型的分布出现较大偏差（详见表4）。
深圳地区混合型样本用新方法检测比用Natio法检测结果高8.2%，是由于Naito法对B/C混合型中C型检测灵敏度不高，所以对B/C混合型的样本，可能会误判为B基因型，因此Naito法检测深圳地区结果B基因型比例较高，而混合型比例较低。
用新方法对新疆地区的样本的筛查表明，新疆地区尤其是少数民族居民的D基因型比例可能大大高于以往的报道，本研究在17例新疆样本中检测到15例D型，占88.2%，推测新疆地区可能是以D基因型为优势基因型。
而Naito法检测结果D型比例只有41.2%，明显低于新方法检测结果，提示Naito方法对HBVD基因型样本的特异度有待提高，当检测含D基因型的样本时，会误判为B/C/D混合型或者B/C/D/E混合型。
邯郸地区由于基因型/亚型分布较单一（绝大部分为C2亚型），两种方法的检测结果未有较大差异。
本研究提示曾经用Nai
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