抗原特异性Th17细胞的分化与调节文档格式.docx

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ToassessthedifferentiationandregulationofantigenspecificTh17cellsinvitro.METHODS:

NaveCD4+TcellsfromOVATCRtransgenicmice（OVATCRTg）wereisolatedandcoculturedwithsplenocytesfromnormalBALB/cmiceunderdifferentcultureconditions.TheexpressionandproductionofIL17andothercytokineswereassessed.RESULTS:

OVApeptidealonemainlyinducedTh1typeresponses.AdditionofTGFβplusIL6inducedTh17response.Furthermore,additionofIL23tocellculturecouldpromotethedifferentiationofTh17cells.BlockingofIFNγandIL4byneutralizingmonoclonalantibodiesenhancedthepercentageofIL17producingcells.LPScouldpromotetheproductionofTh1cytokinesbuthadnosignificanteffectonIL17expression.CONCLUSION:

AntigenspecificTh17cellsaredistinctfromantigenspecificTh1andTh2cells.TGFβ,IL6andIL23arethefactorsresponsibleforpromotingthedifferentiationanddevelopmentofTh17subset,whereasIFNγandIL4haveinhibitoryeffects.

　　[Keywords]Th17cells;

Tcellsubset;

flowcytometry;

cytokine

　　按照CD4+T细胞分化和功能特征可以将其分为Th1和Th2细胞[1]。

Th1型细胞通过分泌干扰素γ（IFNγ）等细胞因子介导细胞免疫;

Th2型细胞通过分泌IL4等细胞因子介导体液免疫[2,3]。

Th1型免疫反应失调,出现组织损坏和慢性炎症,而Th2型免疫反应失调,则导致过敏和哮喘疾病的发生。

近年来,在类风湿关节炎、实验性自身免疫性脑脊髓炎等自身免疫病和过敏原特异性反应研究中发现一种特殊的辅助型T细胞。

这群CD4+T细胞同传统Th1和Th2细胞具有明显不同的特征:

主要分泌IL17,表达控制其分化的独特的转录因子——孤独受体,因此命名为Th17细胞。

目前对于此细胞亚群的研究主要集中于其在疾病的发生发展中的作用,而探讨影响抗原特异性Th17细胞的诱导和分化因素的报道较少。

为此,我们研究了体外培养体系中,初始抗原特异性TCRTgCD4+T细胞,经抗原刺激后,探讨影响Th17细胞的诱导、分化和调节的因素。

为深入研究CD4+T细胞免疫调节效应和探讨自体免疫性疾病等免疫学机制提供实验和科学依据。

　　1材料和方法

　　材料OVA抗原特异性转基因BALB/c小鼠,购自实验动物中心。

PerCP标记的抗CD4,收取单个核淋巴细胞,计数,用RPMI1640培养液（含100mL/L灭活胎牛血清、50g/L谷胺酰胺、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素、50mol/L2ME）调整细胞密度为3×

109/L。

　　细胞培养新鲜分离的小鼠单个核细胞与同背景BALB/c小鼠单个核细胞悬液按1∶4比例混合,在有/无OVA多肽（OVA323339,1mg/L）、相应细胞因子（TGFβ1μg/L、IL610μg/L、IL2310μg/L或抗细胞因子抗体αIFNγ5mg/L、αIL45mg/L）不同组合的情况下培养4d后,新鲜RPMI1640培养液中加入低剂量IL2继续培养2d,收集细胞,加入OVA多肽和αCD28（终浓度1mg/L）,刺激的第1h后,加入BFA继续培养4h,用于细胞内细胞因子染色。

　　ELISA检测培养4d的细胞,收集上清液,低剂量IL2悬浮细胞2d,调节细胞密度到3×

刺激孔加入OVA多肽和αCD28,每个样品于96孔培养板上置3个复孔,200μL/孔,37℃、50mL/LCO2培养48h后,收集培养上清液,检测细胞因子浓度,按照ELISA试剂盒说明书操作,酶联检测仪检测结果。

　　细胞染色首先进行细胞表面染色,简言之,细胞悬液,加入荧光标记的抗细胞表面特异性抗原的抗体,4℃避光反应30min,洗涤2次。

之后进行细胞内细胞因子染色,即将待测细胞用PBS洗涤2次后,加入40mL/L多聚甲醛,室温固定8min,洗涤,加入含有通透剂的缓冲液4℃过夜破膜,加入特异性的胞内标记mAb,4℃避光反应30min,洗涤2次,染色缓冲液重悬细胞,流式细胞术（FCM）进行检测。

　　FCM分析应用FCM进行检测。

首先设门于淋巴细胞,再以CD4++双标记细胞群开窗,CellQuest收集10000个细胞,FlowJo软件分析FCM结果。

　　统计学处理所获数据用x±

s表示,显着性检验采用t检验分析。

　　2结果

　　TGFβ和IL6诱导抗原特异性Th17细胞的分化小鼠和BALB/c小鼠单个核细胞悬液,在OVA多肽和相应细胞因子存在的条件下培养,刺激后检测细胞因子的表达。

ELISA结果表明,单独抗原刺激以及加入TGFβ或者IL6后,对IL17的产生都无明显作用,但TGFβ和IL6二者协同则可以明显促进抗原特异性IL17的产生（）。

流式结果表明,单独OVA刺激主要诱导Th1型细胞因子产生。

单独加入TGFβ后,IL17+T细胞百分率由%降低到%。

单独加入IL6后,IL17+T细胞百分率无明显变化,IFNγ+T细胞百分率从%降低到%。

在TGFβ和IL6协同诱导下,即Th17极化培养条件下,IL17+T细胞的百分率明显升高,由%升高到%,同时IFNγ+T细胞百分率由%降低到%。

　　图1TGFβ和IL6诱导抗原特异性Th17细胞的分化

　　Fig1TGFβplusIL6inducedthedifferentiationofTh17cells

　　□Unstimulated;

■Stimulated.A:

ELISAforIL17;

B:

FlowcytometryplotsweregatedonCD4++Tcells.　vscomparedtoOVApeptidealone.

　　IL23促进TGFβ和IL6诱导的抗原特异性Th17细胞的分化进一步分析了IL23对Th17分化的影响,培养条件中加入IL23和/或TGFβ,ELISA结果表明,IL17的产生无明显变化,但IL23却能明显地促进TGFβ和IL6诱导的抗原特异性IL17的产生。

胞内染色结果与之相似。

与单纯抗原刺激相比,加入IL23后,抗原特异性的T细胞中,IL17+T细胞的百分率由%下降到%;

IL23与TGFβ协同作用,IL17+T细胞的百分率由%下降到%。

在Th17极化培养条件中加入IL23,刺激之后IL17+T细胞的百分率由%升高到%,同时IFNγ+T细胞由%降低到%。

　　IFNγ和IL4抑制抗原特异性Th17细胞的分化制备脾脏单个核细胞混合悬液,在Th17极化条件下培养,加入或不加入αIFNγ和/或αIL4。

ELISA检测培养4d的细胞上清,结果表明,阻断了IFNγ之后,上清中IFNγ的表达下降,而IL17的表达水平明显增高。

阻断了IL4之后,上清中IL4的表达下降,IFNγ的表达增高,而IL17的表达水平降低。

当同时阻断了IFNγ和IL4后,IL17的表达最高,差异具有统计学意义。

2次培养刺激以后,IL17表达水平的变化与一次培养相似。

胞内染色结果表明,Th17极化培养条件下加入αIFNγ后,IL17+T细胞百分率由%上升到%,IFNγ+T细胞百分率由%下降到%。

加入αIL4后,IL17+T细胞百分率由%下降到%,而IFNγ+T细胞百分率由%上升到%。

同时加入αIFNγ和αIL4后,IL17+T细胞百分率由%上升到%。

　　图2IL23促进TGFβ和IL6诱导的抗原特异性Th17细胞的分化

　　Fig2IL23enhancedTh17differentiationinducedbyTGFβplusIL6

　　LPS对于抗原特异性Th17细胞的分化无明显促进作用单个核混合细胞悬液在Th17极化条件下加或不加LPS培养后,ELISA检测2次刺激后细胞培养上清中的细胞因子含量。

结果表明,中性培养环境中加入LPS后,细胞培养上清中IFNγ的含量升高,差异有统计学意义。

而在Th17极化培养条件中加入LPS以后,对IL17的产生无促进作用。

FCM检测结果与ELISA结果一致。

OVA多肽培养同时加入LPS后,IL17+T细胞百分率无明显变化,分别为%和%,IFNγ+细胞百分率由%明显升高到%。

Th17极化环境中加入LPS后,IL17+T细胞百分率由%变为%,IFNγ+细胞百分率无明显变化,分别为%和%。

　　图3IFNγ和IL4抑制抗原特异性Th17细胞的分化

　　Fig3IFNγandIL4inhibitthedifferentiationofantigenspecificTh17cells

ELISAforIL17,IFNγandIL4for4dculturesupernatants;

ELISAforIL17forsecondaryculturesupernatants;

C:

FlowcytometryplotsweregatedonCD4++Tcells.,　vsprimedwithoutantibody.

　　图4LPS对于抗原特异性Th17细胞分化的作用

　　Fig4EffectsofLPSonantigenspecificTh17differentiation

ELISAforIL17andIFNγ;

FlowcytometryplotsweregatedonCD4++Tcells.　vsprimedwithoutLPS.

　　3讨论

　　长期以来,人们一般认为CD4+T细胞被活化、增殖,最终将分化为效应Th1和Th2细胞。

随着对自身免疫病研究的深入,人们发现很多现象不能用已知的Th1/Th2模式来解释。

直至发现了一种新的细胞亚群——Th17细胞。

有关Th17细胞在炎症和自身免疫性疾病发生发展中的重要作用,最直接的证据是将EAE患病小鼠的Th17细胞被动转输正常小鼠后,健康小鼠被诱导出严重的EAE。

　　目前对于Th17细胞诱导分化的研究基于多克隆刺激的基础上。

Th17细胞的分化受许多细胞因子的调控。

在小鼠的体外实验模型中,TGFβ和IL6联合作用可以诱导Th17的分化;

IL1β和TNFα能够促进TGFβ和IL6诱导的Th17细胞的分化;

IL12家族成员IL23能够促进Th17细胞的扩增和维持,但是,在体外,单独的IL23不能诱导Th17的分化,只能作用于记忆CD4+T细胞,产生IL17。

Th1细胞和Th2细胞产生的细胞因子IFNγ和IL4抑制多克隆刺激下Th17细胞的分化。

　　本实验中,利用T细胞受体转基因小鼠（）,探讨细胞因子对Th17细胞分化的作用,结果表明,TGFβ和IL6对抗原特异性Th17的分化起协同作用,细胞培养上清中IL17的分泌水平约1200ng/L,而IL23能够促进由TGFβ和IL6诱导的Th17细胞的分化,使IL17的分泌水平达到5000ng/L。

IL23单独作用或者与TGFβ协同作用对抗原特异性Th17细胞因子的产生无促进作用。

这一结果与目前文献报道的多克隆刺激下的结果一致。

有关人Th17细胞研究结果表明,部分Th17细胞同时分泌IFNγ,而动物实验中,Th1和Th17是截然不同的细胞亚群[10],本次实验也证明了这一点。

另外,加入IFNγ和IL4的中和性抗体之后,抗原特异性的Th17细胞的比例增高,细胞培养上清中IL17的分泌水平达到6000ng/L,进一步说明了IFNγ和IL4对抗原特异性的Th17细胞有抑制作用。

　　众所周知,脂多糖通过与免疫细胞的TLR4结合促进Th1细胞的分化[10]。

有文献报道,LPS可以刺激DC分泌多种促炎因子,在提供外源性TGFβ的情况下,antiCD3和antiCD28刺激后初始CD4+T细胞分化为Th17细胞[11]。

本实验结果表明,在中性环境下,LPS能够促进IFNγ的表达,但是在Th17极化的培养环境下,LPS对IL17以及IFNγ的表达并无促进作用。

其原因可能与以下几点有关:

本实验采用OVA多肽特异性刺激,刺激条件与多克隆刺激不同;

LPS对IFNγ的产生有促进作用,可能在一定程度上抑制了Th17细胞的分化;

Th17极化条件下,提供的外源性细胞因子相对减弱了LPS的作用。

但其详细的机制有待进一步研究。

　　综上所述,本研究结果证明了初始抗原特异性CD4+T细胞可以分化为Th17细胞,这一过程受到多种细胞因子的调控。

本实验探讨了Th17细胞分化最佳的诱导条件,为进一步研究Th17细胞的生物学活性和功能,以及其在临床疾病中的作用提供了理论依据。

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