甲型H1N1流感病毒实验室检测技术方案doc文档格式.docx
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所有样本操作均应在生物安全柜（BSC）内进行。
遵循生物安全三级个人防护。
2、对采集自属于感染甲型H1N1流感病毒疑似病例的患者的临床标本进行的病毒分离培养工作，应在BSL-3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。
（二）健康监测
1、所有人员均应自测发热及其他症状。
2、感染甲型H1N1流感病毒的症状包括咳嗽、喉咙痛、呕吐、腹泻、头痛、流鼻涕和肌肉疼痛。
如有不适，应立即向上级报告。
3、如有人员在无防护情况下暴露于甲型H1N1流感确诊病例的临床标本或活病毒，应考虑在暴露后的7天时间里使用奥司他韦或扎那米韦进行抗病毒药物预防。
五、附表和附件
附表1疑似人感染甲型H1N1感染病例标本采样单
附表2疑似人感染甲型H1N1感染病例标本送检单
附件3：
real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程（2009版）（中文）
附件4：
real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程（2009版）（英文）
附件5：
RT-PCR方法检测甲型流感病毒
附件6：
甲型H1N1流感病毒鸡胚分离方法
附件7：
甲型H1N1流感病毒MDCK细胞分离方法
附表1
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本采样单
姓名
性别
年龄
职业※
现住址
发病日期
标本#
种类
标本量
（g或ml）
采集
日期
备注
※选项：
参照传染病报告卡。
#选项：
A鼻咽拭子、B鼻咽吸取物、C鼻腔冲洗液、D鼻腔吸取物、E气管吸取物、F其他（如为其他，请在表格中注明）
采集人员：
采集单位（盖章）：
附表2
疑似人感染甲型H1N1流感病毒病例标本送检单
标本量*
参照传染病报告卡
*标本量：
如果同一份标本有多个包装请注明。
填表人员：
送样时间：
单位（盖章）：
附件3
real-timeRT-PCR方法检测甲型H1N1流感操作规程
中文翻译版（请同时参考英文原版）
请注意：
体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
本规程中的体系仅供参考。
美国CDC实时RTPCR（rRTPCR）检测猪流感操作规程（2009版）
本规程所有权归属疾病控制中心，紧急状态时授权各公共卫生实验室使用。
本规程不用作商业活动或赢利目的。
一、概述
（一）前提
本规程基于对rRT-PCR方法的基本掌握。
（二）实验原理
实时荧光定量RTPCR（rRTPCR）法检测猪流感的方案是用一组寡核苷酸引物和双重标记的TaqMan®
探针，对呼吸道样本或体外培养的猪流感病毒进行定性检测鉴定。
InfA引物和探针为检测出甲型流感病毒而设计，swInfA引物和探针可特异性地检测出所有的猪甲型流感病毒，swH1引物和探针可特异性检测猪流感病毒H1亚型。
本实验用于检测甲型流感阳性的疑似猪甲型流感感染病例的呼吸道样本。
（三）使用条件
一步法定量RT-PCR96孔板热循环系统。
（四）生物安全要求
样本处理应在相应的生物安全实验室完成。
（五）样本要求
1、呼吸道样本
支气管肺泡灌洗液，气管抽吸物，痰，鼻咽或口咽洗液或拭子。
拭子样本所用的拭子顶端应为人造材质（如聚脂或涤纶）、柄为铝制或塑料。
不推荐使用棉头木柄的拭子。
藻酸钙拭子采样不可取。
2、排除标准
1）未在2－4°
C（≤4天）或-70°
C及以下保存的样本
2）以上未列的其它不当样本
（六）核酸提取
RT-PCR扩增效能依赖于样本模板RNA的质与量。
RNA提取操作需经过检验核酸的纯度合格之后，再用于样本实验。
商业化的操作程序中包括QIAamp®
病毒RNA提取试剂盒，RNeasy®
小试剂盒（QIAGEN公司），罗氏MagNAPureCompactRNA分离试剂盒,MagNAPureLCRNA分离试剂盒II,和罗氏MagNA总核酸纯化试剂盒，在推荐的操作程序下，可提取高纯度的RNA。
（七）免责声明：
提到的厂家名仅用作举例，并不表示疾控中心认可。
二、实验材料
（一）试剂
1、一步法荧光定量RT-PCR探针试剂盒；
2、分子级无菌蒸馏水（无RNA酶和DNA酶）；
3、正反向引物（40μM）；
4、双重标记探针（10μM）；
5、阳性对照。
（二）供给
1、实验室标记笔；
2、微量离心管格栅，96孔0.2mlPCR反应管；
3、20μl和200μl可调节移液器及滤芯枪头；
4、0.2mlPCR反应管盘；
5、光学反应盖板；
6、无菌,无核酸酶的1.5ml微量离心管；
7、一次性无粉手套。
（三）仪器设备
1.微量离心机；
2.漩涡振荡器；
3.实时荧光定量PCR检测系统，含96孔的热循环反应板。
三、操作程序
（一）准备工作
1.避免样品污染
由于fluorogenic5’核酸酶测定的敏感性，应特别注意假阳性产生。
推荐以下预防污染的方法：
1）实验准备与核酸提取使用独立区域；
2）实验准备与核酸提取使用专用设备（如移液器，微量离心机）和耗材（如微量离心管，吸头）；
3）实验开始后穿清洁工作服，并使用新的一次性无粉手套；
4）不同样本操作之间，以及怀疑可能污染的情况下均更换手套；
5）试剂和反应管的盖子应尽量关闭。
2、仪器准备
工作台、移液管、离心机必须清洁，用去污剂净化，例如5%的漂白剂、“DNAzapTM”或者“RNaseAWAY®
”来减小核酸交叉污染的风险。
3、试剂准备
注意：
在试验过程中，保持所有的试剂在冰架上保持低温。
1）引物和探针
（1）分装好的冰冻的引物和探针进行融化（已融的探针避光2-8℃可保存多达3个月，不要对探针反复冻融）；
（2）涡旋振荡引物和探针；
（3）瞬时离心引物和探针，之后置于冰架上。
2）RealtimeRT-PCR的试剂
（1）将MasterMix和酶置于冰架上；
（2）融化2×
的ReactionMix；
（3）颠倒混合2×
（4）瞬时离心2×
的ReactionMix和酶，置于冰架上。
4、对RT-PCR的每一步过程均进行检测
1）每个样品的RNA提取物通过分别的引物和探针进行检测：
InfA,swFluA,SwineH1（swH1）和RNaseP（RP）。
RNaseP引物和探针是以人的RNaseP基因为靶基因的，因此对于人的核酸可以作为内部阳性对照。
2）对于每一个过程中包括的所有引物和探针，均设立无模板对照（NTC）和阳性模板对照（PTC）。
3）人类样本对照（HSC）提供了次级阴性对照，以便确认核酸提取过程和试剂的完整性。
5、建立反应
反应检测混合物充分混合后加入到96孔板中。
然后在适当的实验反应和对照中，加入水和提取的核酸或者阳性模板对照（PTC）。
1）为每一个引物和探针标记一个1.5ml的微量离心管；
2）对每一个建立的反应确定反应数（N）。
考虑到NTC、PTC、HSC反应和吸量误差，制备过量的反应混合物是必要的。
具体如下：
（1）如果包括对照，样品的数量（n）为1到14，那么N=n+1；
（2）如果包括对照，样品的数量（n）大于15，那么N=n+2。
3）MasterMix:
计算加到每个引物/探针反应混合物中的各个试剂的量。
计算如下：
*体系建立请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
4）加入水之后，通过上下吹打混匀反应混合物，不要涡旋振荡。
5）离心5s使混合物聚集管底，然后将管子置于冰架上；
6）准备板状的反应管子或者96孔板，置于冰架上；
7）每一个mastermix吸取20μl到每一孔中，每排按顺序进行，如下图：
实验建立举例：
实验样本举例：
在任何样本被加入之前，应该首先加入阴性模板对照（NTC）（第1列），用来检验mastermix中的污染。
HSC应该在待测样本之后加入（第11列），用来检验在样本准备或者加入过程中的交叉污染。
阳性模板对照（PTC）应该在所有样品和阴性模板对照（NTC）之后被加入。
8）在将培养板移到核酸处理区域之前，在试验设定区域，在反应板的第一列将NTC反应进行。
如上所述。
9）吸取5μl的nucleasefreewater到NTC孔，将NTC孔盖上。
10）将反应板盖上，移到核酸处理区域。
11）将含有样品的管子涡旋振荡5s，瞬时离心5s；
12）将提取的核酸样本置于冰架上；
13）如上所述，样品应该按列加入，吸取5μl的第一种样本到所有标记这种样品的孔中（例如，样本“S1”如上表格所示）。
不同样本之间需更换枪头操作。
14）加完样本的孔要盖住，这将会帮助防止样品的交叉污染，并且能够使操作人员记录其加样的具体进程；
15）为了避免交叉污染，必要时更换手套；
16）对剩下的样本，重复步骤13-15；
17）加入5μl的HSC样品加到HSC孔中（第11列）。
将HSC孔盖盖。
18）最后，加5μl阳性模板对照RNA到所有PTC孔中，将PTC孔盖上。
19）如果使用8个管子的条状板子，每一条都要做标签标记，来指明每一个样品的位置（不要在反应管子的顶部标记！
）。
瞬时离心条状管子10－15s，然后置于冰架上。
如果使用培养板，4℃，500g离心30s，置于冰架上。
6、RT-PCR扩增条件
反应体系为25ul，反应条件如下：
注：
在55度这一步骤中要收集荧光信号（FAM）。
*具体扩增条件请参照所使用试剂盒供应商所提供的使用说明。
7、解释说明/检验
1）探针/引物的阴性对照反应中得到的荧光增长曲线不应该超过阈值线。
如果一个或者多个引物和探针的阴性反应出现了假阳性，则样品可能已经被污染。
那么整个实验过程是无效的，严格的按照步骤规则重新实验。
2）在37个循环处或者37个循环之前，所有的临床样本的RP反应曲线都应该超过阈值线，这表明从人类RNaseP基因扩增到足够量的RNA，也表明了样本质量合格。
然而，可能有些样本会由于初始临床样本中的细胞数量较少而无法出现阳性结果。
同时，从动物/禽类体内或者经细胞培养得到的样本，经常会RP反应没有结果或者结果很弱。
如果在所有临床样本中检测RNaseP都阴性，则说明：
（1）从临床材料中对核酸的不适当的提取导致RNA的损失或者来自临床标本的RT-PCR抑制剂的残留污染；
（2）没有足够的人类细胞以备检测；
（3）方法建立和实施不当；
（4）试剂和仪器原因。
3）在40个循环之内，HSC组中InfA，swFluA，swH1探针的荧光增长曲线不应该超过阈值线。
如果任何其中任何一个流感特异性探针的增长曲线超过了阈值线，那么有以下解释：
（1）可能由于RNA提取试剂污染。
在实验前确保RNA提取试剂无误。
（2）RNA提取过程或建立反应加样过程发生交叉污染。
严格遵照操作程序的要求进行重复实验。
（3）在40个循环之前，PTC反应的InfA,swInfA,swH1和RP反应应出现阳性结果。
如果没产生预期的阳性结果则视为无效，应严格遵照操作程序进行重复实验。
确定PTC反应失败原因，订正并记录错误原因及更改方案。
不再使用没产生预期结果的PTC试剂。
（4）当所有对照都满足要求后，如果InfA反应增长曲线与阀值线在40个循环内有交叉时，则样本被视为A型流感病毒阳性。
如果A型流感病毒反应呈阳性，那么UnivSW和/或SWH1也可能呈阳性。
如果样本InfA和特异亚型反应（swInfA和swH1）的反正增长曲线与阈值线在40个循环内有交叉，则视该样本为猪流感病毒A/H1阳性。
如果样本只有InfA和一个亚型的反应阳性或只有InfA阳性，请联系CDC做进一步指导。
（5）在所有对照都满足要求的前提下，如果在40个循环内，待测样本的所有InfA反应阴性则视该样本为阴性。
8、限制规定
1）实验员在实际操作之前应进行操作程序和试验结果分析的培训，熟练掌握后方可进行试验。
2）当样本量不足可能会产生假阴性结果，造成的原因可能是不当的收集，运输或处理。
3）如果反应中存在过量的DNA/RNA模板时也可能出现假阴性。
如果某样本的RP反应被抑制，则可以将提取的RNA进行2倍或更大倍数的稀释（例如1：
10或1：
100）来重复试验。
9、备注
引物和探针参见英文版P7。
附件4
real-timeRT-PCR方法检测鉴定甲型H1N1流感操作规程
（英文版）
下载网址：
http:
//www.who.int/csr/resources/publications/swineflu/realtimeptpcr/en/index.html
附件5
基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒
一、目的
对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。
二、引物
NIC引物
引物名称
碱基组成
目的片段大小
FluA
FluA-M-F30
TTCTAACCGAGGTCGAAACG
235bp
甲型流感病毒M基因通用检测引物
FluA-M-R264
ACAAAGCGTCTACGCTGCAG
H1HA
H1F1147
AAGAGCACACATAATGCCAT
527bp
H1N1亚型检测通用引物
H1R1673
CCATTRGARCACATCCAG
HuH1HA
H1HAF768
ACTACTGGACTCTGCTGGAAC
327bp
人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物
H1HAR1094
CAATGAAACCGGCAATGGCTCC
SWH1HA-1
SW-H1F786
AATAACATTAGAAGCAACTGG
153bp
此次甲型H1N1亚型流感病毒引物
SW-H1R920
AGGCTGGTGTTTATRGCACC
RnaseP
RnasePF
AGATTTGGACCTGCGAGCG
约80bp
与real-timePCR中RnaseP引物一致
RnasePR
GAGCGGCTGTCTCCACAAGT
三、材料及仪器
1、RNA提取试剂盒QIAGenRNeasyMiniKit（catalog#74104）
2、β－巯基乙醇（SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115）
3、70%乙醇
4、RT-PCRKit：
QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）
5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalog#N2111）
6、检测引物
7、Axygen1.5mL离心管，货号：
MCT-150-C
8、Axygen0.2mLPCR管，货号：
PCR-02-C
9、Axygen10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头
10、10μL，100μL，200μL，1000μL加样器
11、可调转速14K离心机：
12、旋涡混合器：
13、生物安全柜：
二级生物安全柜
14、PCR仪：
15、琼脂糖：
BiowestAgaroseDistributedbyGeneTech（Shanghai）CompanyLimitedLotNo.101685
16、核酸染料：
17、电泳液：
5×
TBE电泳缓冲液catNo.9009032718．电泳槽、电泳仪
四、实验步骤
（一）RNA提取
1、根据标本数量分装RLT液：
从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。
2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。
3、每管分别加入5μLβ-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL70%的乙醇，充分混匀。
4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。
取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。
5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。
6、于滤柱中加入700μLWashBufferRW1液，12000rpm，离心15s。
7、从QIAGENRNeasyMiniKit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μLWashBufferRPE液，12000rpm，离心15s。
8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μLWashBufferRPE液，13000~14000rpm，离心2min。
9、将滤柱移到一个干净的1.5mLeppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-freeWater，室温静置1~3min。
10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。
BufferRPE使用之间加44mL无水乙醇。
（二）反应体系配制
1、实验设计：
检测标本RNA
质控参数：
阴性对照：
无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。
）
阳性对照：
已知病毒RNA
2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）
1）按下表加入试剂：
PCR反应体系
组分
体积（μL）
RNaseFreeWater
RT-PCRBuffer
11.9×
n
10mMdNTPMixture
1×
EnzymeMix
RNaseInhibitor
0.1×
上游引物
0.5×
下游引物
Total
20×
对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。
考虑到阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。
2）将上述反应液混匀，分装到0.2mLPCR小管中，每管20μL，分别做好标记。
3）加RNA模板（在核酸提取区）
将上述分装好的PCR小管分别加入模板。
首先加入阴性对照管（5μL无菌水），然后分别加标本RNA（每管5μL），最后加入阳性对照RNA（每管5μL）。
3、RT-PCR反应
将上述加好模板的反应管混匀，短暂离心后放入PCR仪进行RT-PCR
扩增，反应程序如下：
温度（oC）
时间
循环数
60℃
1min
1
42℃
10min
50℃
30min
95℃
15min
94℃
30s
35
52℃
72℃
7min
4℃
保存
4、RT-PCR产物检测
1）2.0％琼脂糖凝胶制备：
称取2.0gAgarose，倒入耐热玻璃瓶内，再加入电泳液（1×
TBE）100mL，轻轻混匀后加热，使Agarose完全熔化。
待Agarose胶温度降至50～60℃左右，加入核酸染料，轻轻混匀（不要产生气泡）。
待胶温度降至50℃左右时，将其倒入制胶板，插好电泳梳子。
待胶完全凝固（约30～60min）之后，将梳子拔出。
2）将制备好的电泳胶放入电泳槽（带梳子孔的一端在阴极），倒入电泳液（1×
TBE）浸过胶面即可。
3）PCR产物各取10μL，加入2μL上样缓冲液（6×
LoadingBuffer），混匀后加入电泳胶孔内（先加Marker（DL－2000）5μL，然后依次加标本PCR产物，再加阴性对照，最后加阳性对照产物）。
4）电泳电压100V，约30～40min后看结果。
5）将电泳胶放入凝胶成像系统观察结果并照相。
5、结果判断
在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，各引物所代表意义如下：
PCR引物
待检样品1
待检样品2
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