纸层析法分离氨基酸实验报告Word文档格式.docx

纸层析法分离氨基酸实验报告Word文档格式.docx

《纸层析法分离氨基酸实验报告Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《纸层析法分离氨基酸实验报告Word文档格式.docx（6页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

chromatography）是生物化学上分离、判定氨基酸混合物常见技术,可用于蛋白质氨基酸成份定性判定和定量测定;

也是定性或定量测定多肽、核酸碱基、糖、有机酸、维生素、抗菌素等物质一个分离分析工具。

纸层析法是用滤纸作为惰性支持物分配层析法,其中滤纸纤维素上吸附水是固定相,展层用有机溶溶剂是流动相。

在环境分析测试中,有时用纸层析法分离试样组分,它用于部分精度不高分析,如3,4-苯并芘。

但不如GC、HPLC应用普遍。

做叶绿体色素分离时用到,将叶片碾碎,浸出绿色液体,将液体与层析液（石油醚）混合,将滤纸一段进入混合液体,四种色素在层析液中溶解度不一样,在滤纸上留下4条色素带。

由此观查出多种色素相对含量和种类。

纸层析法通常见于叶绿体中色素分离,叶绿体中色素关键包含胡萝卜素、叶黄素、叶绿素a、叶绿素b,它们在层析液中溶解度不一样,溶解度大随层析液在滤纸上扩散地快,反之则慢;

含量较多者色素带也较宽。

最终在滤纸上留下4条色素带,所以利用纸层析法能清楚地将叶绿体中色素分离。

氨基酸

氨基酸是组成蛋白质基础单位,广泛用于食品、医药、添加剂及化妆品行业。

伴随生物工程技术产业发展逐步成为2l世纪全球关键产业之一,氨基酸需求量越来越大,品种变更越来越快,工艺改革越来越新。

现在全世界氨基酸每年产量为100万吨,而需求总量是800万吨。

中国自20世纪60年代起,氨基酸应用在食品工业占61,,在饮料工业占30,,医药、日用化工、农业、冶金、环境保护、轻工、生物工程技术等方面占用百分比逐年增加。

氨基酸在人类生活很多方面都有着应用:

（1）在食品行业应用

（2）在医药工业应用

（3）在饲料添加剂行业应用

（4）在化妆品行业应用

（5）在农业上应用

（6）在其她行业应用

氨基酸工业还有着宽广发展前景:

（1）传统氨基酸生产方法

（2）利用基因工程手段生产氨基酸

（3）大力发展药用中间体,具体为:

①氨基酸及其衍生物逐步成为药用中间体

②非天然氨基酸是合成活性药品关键原料

③生产高附加值非天然氨基酸

二、试验目

1.掌握分配层析原理,学习氨基酸纸层析法操作技术（包含点样、平衡、展层、显色、判定及定量）。

2.学习未知样品氨基酸成份（水解、层析及判定）分析方法。

三、试验原理

1.纸层析是以滤纸为惰性支持物分配层析。

滤纸纤维上羟基含有亲水性,吸附一层水作为固定相,有机溶剂为流动相。

当有机相流经固定相时,物质在两相间不停分配而得到分离。

2.溶质在滤纸上移动速度用比移值Rf值表示:

3.Rf=原点到层析斑点中心距离/原点到溶剂前沿距离

4.在一定条件下某种物质Rf值是常数。

Rf值大小与物质结构、性质、溶剂系统、层析滤纸质量和层析温度等原因相关。

本试验利用纸层析法分离氨基酸。

四、试验试剂和器材

试验试剂:

1.氨基酸标准液（1mg/mL）

亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸标准液。

2.80%甲酸

3.0.1%茚三酮丙酮溶液

4.氨基酸混合液（每种氨基酸500mg/mL）

5.正丁醇

试验器材:

1.新华滤纸

2.培养皿

3.电热鼓风干燥箱

4.吹风机

5.毛细管

6.针、线、尺。

7.钟罩（高约430mm,直径约290mm,具磨口塞）

五、操作步骤

标准氨基酸纸上层析

单向上行层析

氨基酸Rf值测定

1.滤纸:

选择国产新华1号滤纸,6cm×

7cm。

在距滤纸2cm处划线,用铅笔在线上标上四个点作为点样位子（留出缝线空间）。

2.点样:

①点样要适宜,样品点太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清;

②用毛细管吸收氨基酸样品,与滤纸垂直方向轻轻碰触点样处中心,这时样品就自动流出;

③点样扩散直径控制在0.5cm之内,点样过程中必需在第一滴样品干后再点第二滴,为使样品加速干燥,可用吹风机吹干,但要注意温度不可过高,以免氨基酸破坏,影响定量结果;

④将点好样品滤纸两侧比齐,用线缝好,揉成筒状。

注意缝线处纸两边不要接触。

避免因为毛细管现象使溶剂沿两边移动尤其快而造成溶剂前沿不齐,影响Rf值。

3.将揉成圆筒状滤纸放入培养皿内（注意滤纸不要碰皿壁）,当溶剂展层至距离纸上沿约1cm时,取出滤纸,立刻用铅笔标出溶剂前沿位置。

4.显色:

待展层基础结束后,置65℃鼓风箱中10-20min,鼓风保温,滤纸上即显出紫红色/黄色斑点。

5.Rf值计算:

用尺测量显色斑点中心与原点（点样中心）之间距离和原点到溶剂前沿距离,求出此值,即得氨基酸Rf值。

计算出3种氨基酸在酸系统中Rf值,判定待测样组成。

酸溶剂系统:

正丁醇:

80%甲酸:

水=15:

3:

2（体积比）,茚三酮2ml。

温度25℃,时间1h。

六、试验结果

亮氨酸

甘氨酸

脯氨酸

待测氨基酸

原点到层析斑点中心距离

6.05

2.90

3.49

2.61

3.74

6.47

原点到溶剂前沿距离

7.24

Rf

0.84

0.40

0.48

0.36

0.52

0.89

判定待测氨基酸

理论Rf

0.79

0.30

七、注意事项

1.点样过程中必需在第一滴样品干后再点第二滴;

2.为使样品加速干燥,可用吹风机吹干,但要注意温度不可过高,以免氨基酸破坏,影响定量结果;

3.将揉成圆筒状滤纸放入培养皿内时,注意滤纸不要碰皿壁;

4.使用溶剂系统需新鲜配制,并要摇匀;

5.点样要适宜,样品点太浓,斑点易扩散或拉长,以致分离不清;

6.使用茚三酮显色法,必需在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少许含氮物质。

显色时它也展现紫色斑点。

污染了层析结果,所以操作时应戴橡皮手套或指套。

同时也要预防空气中氨;

7.展层展开时切勿是样品点浸入溶剂中。

八、思索题

1.为何在展层时有时用一个溶剂系统,而有时用两种溶剂系统？

答:

这是依据Nernst在1891年提出分配定律:

一个溶质在两种给定互不相溶溶剂中分配时,在一定温度下达成平衡后,溶质在两相中浓度比为一常数,即分配系数（Kd）。

Kd=Ca/CbCa和Cb是互不相溶两相,即A相和B相浓度。

这里两相能够使固相、液相和气相。

意思就是溶质在A和B两种溶剂组成混合溶剂里分配时,分配比是恒定。

2.酸性溶剂系统（或碱性溶剂系统）对氨基酸极性基团解离有何影响?

酸性溶液中,有利于氨基酸碱式电离,氨基结合质子,整个分子带正电荷;

反之,碱性溶液中有利于羧基酸式电离,氨基酸分子整体带负电荷。

3.酸性溶剂系统（或碱性溶剂系统）对碱性氨基酸（赖、精、组）和酸性氨基酸（天冬、谷）Rf值有什么影响?

酸性溶剂系统对碱性氨基酸溶解性加强,在层析过程中易溶于流动相。

所以跑得比较快,所以Rf值增大。

反之,碱性性溶剂系统中酸性氨基酸Rf值增大。

4.什么是分配系数？

分配系数是指一定温度下,处于平衡状态时,组分在固定相中浓度和在流动相中浓度之比,以K表示。

九、讨论

经过此次利用纸层析法分离氨基酸试验,使我较为熟练掌握了利用纸层析法分离氨基酸具体步骤及方法,而且了解了其工作原理,这对于以后学习是有很大帮助。

经查阅资料得,亮氨酸理论Rf值为0.79（酸相）,脯氨酸理论Rf值为0.48（酸相）,甘氨酸理论Rf值为0.30（酸相）。

经过比对滤纸上单一氨基酸层析位置、计算出其试验Rf值并查阅资料得悉,滤纸上待测氨基酸种类及具体位置,较为粗略地分离了亮氨酸、脯氨酸及甘氨酸这三种氨基酸。

总体来讲,此次试验三种氨基酸试验Rf值偏小,。

经过分析后,得出几点影响试验结果原因,以下:

1.点样过程中未在第一滴样品干后再点第二滴;

2.虽用玻璃罩将滤纸罩住,但还是会有些许空气中氨在其中,影响试验结果;

3.将揉成圆筒状滤纸放入培养皿内时,滤纸不小心触碰到皿壁,出现虹吸现象;

4.使用新鲜配制溶剂系统时,并未完全摇匀;

5.使用茚三酮显色法,必需在整个层析操作中避免手直接接触层析纸,因为手上常常有少许含氮物质。

污染了层析结果,所以操作时应戴橡皮手套或指套,但试验操作过程中,并未戴橡皮手套或指套,在制作滤纸筒时手不小心触碰到滤纸内侧面,造成手上物质沾染到滤纸内侧,影响了试验结果;

总而言之,此次试验误差关键是因为操作误差造成,,所以在以后学习试验过程中,会愈加着重注意试验前对试验器材完好程度检验以及试验操作规范性,严格要求自己,努力做到愈加好!