生物化学考研复习资料Word文档下载推荐.docx
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氧化法(过甲酸)和还原法(巯基乙醇和DTT)。
多肽链的部分裂解:
①酶裂解法②化学裂解法
二硫桥位置的确定:
对角线电泳
6.蛋白质的四个结构层次
重点是超二级结构、结构域。
超二级结构:
由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如αα、βαβ、βββ;
结构域(domain),又称motif(模块、基序)。
在二级结构及超二级结构的基础上,多肽链进一步卷曲折叠,组装成几个相对独立、近似球形的三维实体。
结构域是球状蛋白的折叠单位,多肽链折叠的最后一步是结构域间的缔合。
结构域间的裂缝,常是活性部位,也是反应物的出入口。
一般情况下,酶的活性部位位于两个结构域的裂缝中。
锌指:
DNA结合蛋白中,2个His、2个Cys结合一个Zn
亮氨酸拉链:
DNA结合蛋白中,由亮氨酸倒链形成的拉链式结构,
7.稳定蛋白质三维结构的力
非共价键:
1、氢键是维持蛋白质三维结构的主要作用力。
2、疏水作用(熵效应)在驱动蛋白质的折叠方面占有突出的地位。
共价键:
1、肽键2、二硫键:
对蛋白质的三维结构起到稳定作用,有些二硫键对于维持活性是必需的,有些是非必需的。
绝大多数情况下,二硫键是在多肽链的β转角附近形成的。
二硫键主要存在于分泌到细胞外的蛋白质中,如核糖核酸酶和胰岛素等。
8.二级结构的元件
α螺旋及其特征:
①多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基,(如Lys,或Asp,或Glu),则由于静电排斥,不能形成链内氢键,从而不能形成稳定的α—螺旋。
如多聚Lys、多聚Glu。
而当这些残基分散存在时,不影响α—螺旋稳定。
②Gly的Φ角和Ψ角可取较大范围,在肽中连续存在时,使形成α—螺旋所需的二面角的机率很小,不易形成α—螺旋。
丝心蛋白含50%Gly,不形成α—螺旋。
③R基大(如Ile)不易形成α—螺旋。
④Pro、脯氨酸中止α—螺旋。
⑤R基较小,且不带电荷的氨基酸利于α—螺旋的形成。
如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中自发卷曲成α—螺旋。
β-折叠及其特征:
从能量上看,反平β-折叠比平行的更稳定,前者的氢键NH---O几乎在一条直线上,此时氢键最强。
在纤维状蛋白质中β折叠的主要是反平行式的(更稳定),氢键主要是在肽链之间形式;
球状蛋白质中两种方式几乎同样广泛地存在,氢键既可在不同肽链间形成,也可在同一肽链的不同部分间形成。
9.胶原蛋白
由三股左手α-肽链缠绕成的右手三股螺旋。
富含Gly-x(Pro)-y(Hpy),Hyp(4-羟脯氨酸)不易被一般的蛋白酶水解。
胶原于水中煮沸即转变成明胶(动物胶)。
明胶是一种水溶性的多肽混合物。
10.别构效应
蛋白的别构部位与效应物的结合改变了蛋白质的构象,从而对活性部位产生的影响,别构效应具有协同性。
1、同促效应(发生部位相同):
正协同效应:
是S形配体结合曲线;
负协同效应:
不呈S形配体结合曲线。
2、异促效应(发生部位不同):
正效应物(激活剂);
负效应物(抑制剂)别构效应物是细胞代谢库的成分,其浓度的细微变化可立即调节代谢需求。
11.蛋白质的变性和折叠
体内蛋白质折叠:
体内蛋白质的折叠需要PDI(蛋白质二硫键异构酶)、PPIases(肽基脯氨酰异构酶)和分子伴侣。
脯氨酰异构化是体内许多蛋白质折叠的限速步骤。
12.血红蛋白的结构
血红蛋白的氧合曲线(与肌红蛋白比较):
血红蛋白由4个亚基组成,每个亚基都与肌红蛋白类似,含有一个血红素,都能结合一分子O2,四个亚基之间具有协同效应,第一个配基的结合能提高其它亚基对O2的亲和力。
因此,它的氧合曲线是S型曲线。
协同效应可增加血红蛋白在肌肉中的卸氧量,使它能有效地输送氧气。
波耳效应:
增加CO2的浓度、降低pH能显著提高血红蛋白亚基间的协同效应,降低血红蛋白对O2的亲和力,促进O2的释放,反之,高浓度的O2也能促使血红蛋白释放H+和CO2。
血红蛋白是一个别构蛋白,BPG是它的效应物。
BPG(二磷酸甘油酸)通过与它的两个β亚基形成盐键稳定了血红蛋白的脱氧态的构象,因而降低脱氧血红蛋白的氧亲和力。
生理意义:
BPG进一步提高了血红蛋白的输氧效率。
在肺部,PO2超过100torr,因此,即使没有BPG,血红蛋白也能被饱和,在组织中,PO2低,BPG能降低血红蛋白的氧亲和
力,加大血红蛋白的卸氧量。
(1)高山适应和肺气肿的生理补偿变化;
BPG升高。
(2)血库储血时加入肌苷可防止BPG的降解。
协同效应、波耳效应、别构效应使血红蛋白的输氧能力达到最高效率。
13.血红蛋白分子病
镰刀状细胞贫血病、地中海贫血
14.免疫系统和免疫球蛋白
分为5类,IgA、M、D、E、G。
IgG是血液中最丰富的免疫球蛋白。
抗原:
是指进入异体机体后,能致敏淋巴细胞产生特异抗体,并能与抗体发生特异结合的物质(主要有蛋白质、核酸及其它高分子化合物)。
抗体:
是在对抗原刺激的免疫应答中,B淋巴细胞产生的一类糖蛋白,它是能与相应抗原特异性结合、产生免疫反应的球蛋白,称免疫球蛋白。
抗体多样性的分子机制。
15.基于抗体一抗原相互用的生化分析方法:
ELISA酶联免疫吸附测定、免疫印迹测定或称westernblotting
16.分离纯化的一般原则
17.分离纯化常用技术:
盐溶和盐折(硫酸铵)、超滤、层析原理和类型、电泳技术原理和类型。
1.2酶
1.酶作为催化剂的特点:
①易失活;
②催化效率高,用量少(细胞中含量低);
③高度专一性(与一般催化剂最主要的区别);
④酶活性受到调节和控制:
A、调节酶的浓度B、通过激素调节酶活性C、反馈抑制调节酶活性D、抑制和激活剂对酶活性的调节E、其他方式(别构调控,酶原激活等);
⑤改变反应速率,加速达到反应平衡但不改变化学反应平衡点;
⑥酶的催化活性离不开辅酶、辅基、金属离子。
2.酶的专一性:
“锁与钥匙”学说:
认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的,酶表面具有特定的形状。
酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样。
诱导契合假说:
当酶分子与底物分子接近时,酶蛋白受底物分子诱导,其构象发生有利于底物结合的变化,酶与底物在此基础上互补契合进行反应。
3.酶的活力测定和分离纯化
酶活力的测定:
①酶活力②酶活力单位③酶活力国际单位(IU单位)④测定酶活力时,为了保证测定的速率是初速率,通常底物浓度通常很大,使酶饱和;
底物消耗≤5%的速率为初速率。
⑤酶的比活力:
代表酶的纯度,用每mg蛋白质所含的酶活力单位数表示。
比活力=活力U/mg蛋白=总活力U/总蛋白mg。
⑥酶活力的测定方法:
A、分光光度法B、荧光法C、同位素测定方法D、电化学方法(pH测定法)
酶的分离和纯化:
①酶的分离纯化的进程主要包括:
浓缩、除杂。
②判断分离提纯方法的优劣,一般用两个指标衡量。
A、总活力的回收B、比活力提高倍数。
总活力=活力单位数/ml酶液×
总体积(ml)。
比活力=活力单位数/mg蛋白(氮)纯化倍数=每次比活力/第一次比活力。
回收率(产率)=每次总活力/第一次总活力×
100%。
③酶溶液浓度越低越易变性,切记不能保存酶的稀溶液。
常用的蛋白酶抑制剂:
PMSF(甲苯磺酰氟)、亮抑酶肽、抑蛋白酶肽。
④酶的提纯过程中,总蛋白减少,总活力减少,比活力增高。
4.酶的工作机制
为什么酶能够降低反应活化能?
过渡态理论。
5.酶的调节机制
别构调节(非共价修饰,可逆):
酶分子的非催化部位与某些化含物可逆地非共价结合发生构象的改变,进而改变酶活性状态,称为酶的别构调节。
凡是能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物。
共价修饰(可逆):
共价修饰的基团主要是磷酸化、腺苷化、尿苷酰化及ADP-核糖基化等。
在修饰过程中,酶的活性在无活性(或低活性)与有活性(或高活性)两种状态中改变。
共价修饰的互变是由不同的酶催化的,属于酶活性的快速调节
酶原激活(不可逆):
某些活性酶的无活性前体蛋白(如果不是酶,则称某蛋白原),这种前体蛋白经过蛋白水解酶专一作用后,构象发生变化,形成酶的活性部位,变成活性蛋白。
活性中心的形成或暴露过程,具有不可逆性。
6.同工酶
同工酶:
是指催化相同的化学反应,但其蛋白质分子结构、理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶。
不同种生物有相同功能的酶不是同工酶。
同工酶具有相同或相似的活性中心,但其理化性质和免疫学性质不同。
1.3核苷酸和核酸
1.DNA的结构
B—DNA、A-DNA(右手双螺旋,RNA-RNA、RNA-DNA杂交分子具有这种结构。
A-DNA是否存在于细胞内还不确定。
大多数短DNA结晶时倾向于形成A型)、Z-DNA(Z-DNA在原核和真核生物中都存在。
Z-DNA在调节基因的表达或者遗传重组方面可能起重要的作用)
拓扑异构酶:
此酶能改变DNA拓扑异构体的L值。
①拓扑异构酶酶I(拧紧)②拓扑异构酶酶II(拧松)
2.RNA的结构
真核mRNA:
polyA、5’-帽子帽子
原核mRNA(多顺反子):
原核mRNA由先导区、插入序列、翻译区和末端序列组成。
没有5/帽子和3/polyA。
5’端先导区中,有SD序列。
SD序列和核糖体16S的rRNA的3’末端富含嘧啶碱基的序列互补,这种互补序列与mRNA对核糖体的识别有关。
tRNA的结构:
tRNA约占全部RNA的15%。
每种tRNA可运载一种特定的氨基酸,一种氨基酸可由一种或多种tRNA运载。
rRNA的结构:
rRNA占总RNA的80%左右、功能、真核原核剪切过程。
3.UV吸收
鉴定纯度:
纯DNA的A260/A280应为1.8(1.65-1.85),若大于1.8,表示污染了RNA。
纯RNA的A260/A280应为2.0。
若溶液中含有杂蛋白或苯酚,则A260/A280比值明显降低。
含量计算:
OD260=1,值相当于:
50ug/mL双螺旋DNA;
或:
40ug/mL单螺旋DNA(或RNA);
20ug/mL核苷酸。
增色效应与减色效应:
增色效应:
在DNA的变性过程中,摩尔吸光系数增大;
减色效应:
在DNA的复性过程中,摩尔吸光系数减小。
4.核酸杂交
杂交(DNA—DNA、DNA—RNA):
将不同来源的DNA混合加热,变性后,慢慢冷却使它复性。
若这些异源DNA之间,在某些区域有相同的序列,则复性时会形成杂交分子。
SouthernBloting、NothernBloting
5.DNA中的一些碱基会被甲基化修饰
DNA的甲基化:
A/C更容易甲基化,需要甲基化酶;
S-腺苷甲硫氨酸是甲基供体;
通过甲基化区分自身DNA和外源DNA;
标记错配碱基以进行修复;
真核生物甲基化在CpG序列中常见。
抑癌基因高甲基化减弱基因的表达、原癌基因低甲基化增强基因的表达。
6.核酸的分离提纯
DNA的分离三种方法:
①用盐抽提,用苯酚和氯仿除去蛋白质。
②用广谱蛋白酶在SDS存在下保温消化cell悬液,再用苯酚和氯仿去蛋白,用RNase除去少量RNA。
③用氯化铯密度梯度离心法分离纯化DNA。
RNA的分离:
①所有器皿与溶液都要经过处理除去RNase;
②在破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase失活;
③在实验反应体系中加入RNase的抑制剂(如DEPC)。
常用的分离方法:
①用胍盐/氯化铯密度梯度离心;
②用酸性胍盐/苯酚/氯仿抽提mRNA所采用Oligo(dT)亲和层析法过柱。
7.核酸含量的测定
紫外分光光度法、定磷法、定糖法
8.核酸的凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳:
①迁移率:
超螺旋DNA>
线型DNA>
开环DNA。
②用于分析RNA时,须加入蛋白质变性剂,如甲醛等。
(使RNase变性)。
③EB染色。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(分辨率高):
一般直接用来分析RNA,可分析相对分子质量小于100bp的DNA片段和RNA。
9.核酸的扩增(PCR)
polymerasechainreaction、基本步骤、注意事项、影响特异性的因素、PCR的主要用途、几种重要的PCR衍生技术
10.核酸的限制性酶切
II型酶的限制和修饰活性分开,蛋白质结构是单一成分,辅助因子Mg2+,位点为反向重复序列。
同裂酶:
来源不同的限制酶(名称自然不同),识别同样的核苷酸靶序列,产生同样的切割,形成同样的末端。
星号活力:
在一定条件下(低离子强度,碱性pH,或50%甘油),限制酶的特异性降低。
结果,它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。
1.4糖和糖生物学
1.单糖
单糖的环状结构:
在溶液中,含有4个以上碳原子的单糖主要以环状结构。
在溶液中,糖的链状结构和环状结构之间可以相互转变,最后达到一个动态平衡,称为变旋现象。
只有链状结构才具有下述的氧化还原反应:
(1)Molish反应(鉴定单糖的存在)
(2)Seliwannoff反应(区分酮糖与醛糖)、能被弱氧化剂(如Fehling试剂、Benedict试剂)氧化的糖称为还原性糖)、糖脎反应(单糖在加热条件下与过量苯肼反应产物称为糖脎)
所有的单糖都是还原性糖。
人体不能消化L-葡萄糖。
2.寡糖
还原性寡糖:
麦芽糖、乳糖、纤维二糖
非还原性寡糖:
蔗糖、海藻糖、棉籽糖
3.多糖和杂多糖
直链淀粉:
α-(1-4)糖苷键依次相连成长而不分开的葡萄糖多聚物。
遇碘显兰色。
支链淀粉:
在直链的基础上每隔20-25个葡萄糖残基就形成一个(1-6)支链。
遇碘显紫色。
淀粉酶:
α-淀粉酶可以催化淀粉分子中任何部位的α-1,4-糖苷键水解,产物主要是糊精和麦芽糖;
β-淀粉酶从链的还原端开始,每次从淀粉分子中水解两个葡萄糖基,产物为极限糊精和麦芽糖
糖原:
结构更紧密,更适应其贮藏功能,这是动物将其作为能量贮藏形式的一个重要原因,另一个原因是它含有大量的非原性端,可以被迅速动员水解。
糖元遇碘显红褐色。
4.糖蛋白
糖蛋白中糖链的结构:
N-糖苷键型(N-连接)和O-糖苷键型(O-连接)
1.5脂类和生物膜
1.脂肪酸及其衍生物
类二十烷酸(类花生酸):
包括前列腺素类,凝血恶烷类和白细胞三烯类,是花生四烯酸的衍生物。
花生四烯酸可由亚油酸在体内合成。
前列腺素类:
前列腺素类是花生四烯的衍生物。
阿司匹林抑制前列腺素合成酶的环加氧酶活性,从而抑制前列腺素的合成。
2.磷脂
甘油磷脂、鞘氨醇磷脂。
3.结合脂
糖脂:
脑苷脂(中性糖鞘脂类)、神经节苷酯(酸性糖鞘脂类);
脂蛋白:
血浆脂蛋白。
鞘糖脂中,单糖、双糖或寡糖通过O-糖苷键与神经酰胺相连,重要的鞘糖脂有脑苷脂、硫脑苷脂和神经节苷脂。
血浆脂蛋白包括:
(1)乳糜微粒,运输甘油三酯和胆固醇脂,从小肠到组织肌肉和
脂肪组织。
(2)极低密度脂蛋白VLDL,在肝脏中生成,将脂类运输到组织中,当VLDL被运输到全身组织时,被分解为三酰甘油、脱辅基蛋白和磷脂,最后,VLDL被转变为低密度脂蛋白。
(3)低密度脂蛋白LDL,把胆固醇运输到组织,经过一系列复杂的过程,LDL与LDL受体结合并被细胞吞食。
(4)高密度脂蛋白HDL,也是在肝脏中生成,可能负责清除细胞膜上过量的胆固醇。
4.固醇类化合物
固醇类:
含有环戊烷多氢菲母核的一类醇、酸及其衍生物。
包括:
固醇、固醇衍生物。
胆固醇:
胆固醇是生物膜的重要成分,羟基极性端分布于膜的亲水界面,母核及侧链深入膜双层,控制膜的流动性,阻止磷脂在相变温度以下时转变成结晶状态,保证膜在低温时的流动性及正常功能。
胆固醇是合成胆汁酸、类固醇激素、维生素D等生理活性物质的前体。
类固醇激素:
(1)肾上腺皮质激素
(2)性激素
5.生物膜
流动镶嵌模型:
流动性和不对称性
变相温度以上,降低膜的流动性;
变相温度以下,保持膜的流动性。
生理条件下,胆固醇含量越高,膜的流动性越低。
在生理条件下增加胆固醇的含量会降低膜的流动性。
膜蛋白在膜上的定位:
外周膜蛋白、内在膜蛋白
糖类:
全部分布在膜的非细胞质一侧。
影响流动性的三个重要因素:
脂肪酸碳链长短、脂肪酸的饱和程度、胆固醇的含量;
膜脂的流动性主要决定于磷脂分子。
6.物质转运
初级主动运输、二级主动运输
2.动态生化-生物能学和代谢
2.1糖酵解途径和已糖的分解代谢
1.糖酵解途径
糖酵解:
葡萄糖分解为丙酮酸并伴随着生成ATP的过程。
存在于所有生物。
在真核细胞中,其反应部位在胞液中。
是第一个被阐明的代谢途径
(1)葡萄糖磷酸化形成G-6-P:
此反应基本不可逆,调节位点。
催化此反应的激酶有,已糖激酶和葡萄糖激酶。
己糖激酶是酵解途径中第一个调节酶,被产物G-6-P强烈地别构抑制。
己糖激酶是一种调节酶,ADP和反应产物葡萄糖-6-磷酸是该酶的变构抑制剂。
(2)G-6-P异构化为F-6-P
(3)F-6-P磷酸化,生成F-1.6-P:
酵解中的关键步骤。
磷酸果糖激酶是糖酵解的限速酶。
肝中的磷酸果糖激酶受ATP的抑制,H+对该酶有抑制作用。
通过阻止糖酵解的继续进行,从而防止乳酸的继续形成,避免酸中毒。
(4)F-1.6-P裂解成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮(DHAP):
该反应在热力学上不利,但是,由于具有非常大的△G0负值的F-1.6-2P的形成及后续甘油醛-3-磷酸氧化的放能性质,促使反应正向进行。
同时在生理环境中,3-磷酸甘油醛不断转化成丙酮酸,驱动反应向右进行。
该反应由醛缩酶催化。
(5)磷酸二羟丙酮(DHAP)异构化成3-磷酸甘油醛
(6)3-磷酸甘油醛氧化成1.3—二磷酸甘油酸
(7)1.3—二磷酸甘油酸转化成3—磷酸甘油酸和ATP:
由磷酸甘油酸激酶催化。
这是酵解过程中的第一次底物水平磷酸化反应,也是酵解过程中第一次产生ATP的反应。
(8)3—磷酸甘油酸转化成2—磷酸甘油酸
(9)2—磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸
(10)磷酸烯醇式丙酮酸生成ATP和丙酮酸:
不可逆,调节位点。
由丙酮酸激酶催化,丙酮酸激酶是酵解途径的第三个调节酶,这是酵解途径中的第二次底物水平磷酸化反应,磷酸烯醇式丙酮酸将磷酰基转移给ADP,生成ATP和丙酮酸
2.丙酮酸的去路
有氧条件:
乙酰辅酶A(三羧酸循环)
无氧条件:
乳酸发酵、生成乙醇
高等动物糖酵解-乳酸发酵途径的生理意义:
缺氧条件下迅速为生命活动提供能量的途径,尤其对肌肉收缩更为重要。
是机体某些组织获能或主要获能的方式,如视网膜、神经、癌组织等。
成熟红细胞几乎完全依赖糖酵解供应能量。
乙醇发酵:
一些酵母和其它微生物在无氧条件下,丙酮酸先后经丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的催化作用,脱羧还原为乙醇。
(脊椎动物缺乏丙酮酸脱羧酶)TPP是丙酮酸脱羧酶的辅酶
3.糖酵解途径的调节
1)磷酸果糖激酶:
糖酵解途径最重要的调控点,受高浓度ATP/柠檬酸抑制。
2)丙酮酸激酶:
变构抑制剂:
ATP、丙氨酸(肝);
变构激活剂:
果糖-1,6-双磷酸。
3)己糖激酶、葡萄糖激酶
4.糖酵解与癌症和进化
肿瘤组织糖酵解速度比正常组织快还是慢?
为什么?
糖酵解与进化:
糖酵解途径被认为是生物最古老最原始获取能量的一种方式。
在进化过程中,大多数较高等生物,虽然进化为利用有氧条件进行生物氧化获取大量的自由能,但仍保留了这种原始方式。
糖酵解的十步反应,不但成为生物体共同经历的葡萄糖的分解代谢前期途径,以及供氧不足时的供能途径,而且在哺乳动物一些组织细胞中,葡萄糖酵解途径是唯一的供能途径。
5.戊糖磷酸途径
以葡萄糖-6-磷酸开始,在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶催化下形成6-磷酸葡萄糖酸,进而代谢生成磷酸戊糖作为中间代谢产物,故将此过程称为戊糖磷酸途径。
生理意义:
产生NADPH和核糖-5-磷酸。
也是植物光合作用从CO2合成葡萄糖的部分途径。
NADPH的主要功能:
作为供氢体参与体内多种生物合成反应;
是谷胱甘肽还原酶的辅酶;
参加肝脏生物转化反应;
参与体内嗜中性粒细胞及巨噬细胞在吞噬细菌后产生超氧阴离子的反应,有杀菌作用。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症:
简称G6PD缺乏症,又称蚕豆病(溶血性贫血症)。
是一种遗传病。
红细胞在一些因素的诱发下溶解,血红蛋白释放到血液中,引起黄疸和肾功能障碍。
诱发因素包括:
进食蚕豆、抗疟疾药物、磺胺类抗生素以及接触一些除草剂。
6.四种贫血病比较:
1)镰刀状细胞贫血病:
血红蛋白单个氨基酸分子突变导致血红蛋白纤维状沉淀。
2)地中海贫血病:
缺失一个或多个编码血红蛋白链的基因;
基因突变导致转录不正常.
3)溶血性贫血病:
缺乏葡萄糖-6-磷酸脱氢酶导致红细胞缺乏NADPH而容易破裂
4)巨幼红细胞贫血(恶性贫血):
VitB12是甲基丙二酸单酰CoA变位酶的辅酶。
VitB12在动植物中