一种pH响应的荧光探针的合成与表征要点.docx

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一种pH响应的荧光探针的合成与表征要点

一种pH响应的荧光探针的合成与表征

摘　　要

苝是一类具有强烈荧光的芳香化合物，它具有优异的化学稳定性、光电性质，受到人们的广泛关注，以苝酰亚胺为发光中心，以PEO链为增溶基团，可以合成一种水溶性荧光染料。

本文具体内容如下：

在酰胺位上接入了具有水溶性的树状多肽PEO链的基础上，将苝酰亚胺的海湾位置上再引入响应基团，最终合成了一种新型pH响应荧光探针。

并通过紫外、荧光分光光度计测定这种化合物的光谱性能。

关键词：

苝酰亚胺；pH响应；荧光探针

Synthesisandcharacterizationofa pH-responsiblefluorescentprobe

Abstract

Peryleneisakindofcompoundwithastrongfluorescence,whichreceivedgreatattentionforitsremarkablechemicalstabilityandoptoelectronicproperties.Wecansynthesizeawater-solublefluorescentprobewithoutanyresponsivenesswhentheluminescencecenterisperyleneandThe PEO chain isamodifiedgroup.ThispapershowsthatafterinsertingthePEOchainintheamideposition,amodifiedgroupisinsertedintothegulfpositionandwefinallysynthesizea pH-responsiblefluorescentprobe.Inaddition,weusedUVandRFtocharacterizethespectralpropertiesof the compound.

KeyWords:

perylene;pH-responsible;fluorescentprobe

目　　录

１　前言

1.1　苝系荧光化合物……………………………………………………………………1

1.1.1　苝系荧光化合物概述………………………………………………………1

1.1.2　苝系荧光化合物应用………………………………………………………1

1.1.3　苝系荧光化合物的溶解性………………………………………………2

1.2　pH荧光探针的发展………………………………………………………………3

1.3　论文基本设计思路………………………………………………………………3

2　实验部分

2.1　引言……………………………………………………………………………………4

2.2　主要试剂及仪器……………………………………………………………………4

2.3　实验步骤……………………………………………………………………………5

2.4　结果讨论……………………………………………………………………………6

附图

参考文献

致谢

１　前言

1.1　苝系荧光化合物

1.1.1　苝系荧光化合物概述

苝系化合物是一类有强烈荧光的芳香烃化合物，具有大的共轭π体系，苝四羧酸二酰亚胺母体分子（PDI）可以看作是两个萘分子单元组合后又连着一个酰亚胺，萘单元通过sp2杂化键合形成的一个大平面芳香体，而大的芳香体连着酐单元即是3，4，9，10-苝四羧酸二酐（简称苝酐）。

图1-1苝酐的分子结构

苝具有一定的致癌性，又由于在酰亚胺区域引入取代基一般不会影响苝系物质的光物理性质，所以近年来的研究主要集中在取代的苝酰亚胺（PBI）上，该化合物毒性相对较小，分子结构如图所示，是一个封闭的发色团，其荧光量子产率也非常高（接近于1），是一个较为安全的母体荧光化合物。

图1-2苝酰亚胺的分子结构

1.1.2苝系荧光化合物应用

苝系化合物是一个大的缺电子体系，非常容易被还原，而难以被氧化，所以苝系化合物是一类光热稳定性和耐久性好、光谱吸收范围宽、光电转换效率高的有机半导体材料，在可见光的吸收带位于450-600nm的范围内，广泛应用于颜料和染料[1]、光电导材料、电致发光材料、太阳能电池材料、液晶材料[2]、激光染料等领域。

（1）有机颜料

苝系分子具有很好的分子共平面性及刚性，因此具有很高的化学稳定性，具有优异的耐热、耐光、耐候性，同时耐高温、耐溶剂、耐酸、碱。

苝系化合物较为古老，从1913年起就作为还原染料被人们的使用。

其作为高档有机颜料主要用于汽车涂料、金属表面涂料、粉末涂料、外墙涂料及合成纤维原浆着色及塑料着色等。

（2）生物荧光探针

苝系化合物从可见区到红外区的光有很强的吸收，是一类性能优异的分子荧光材料，被广泛应用于分子开关设计及离子识别中。

例如，苝酰亚胺的N取代基为脂肪族长链时，结构的特殊性使它能够插入细胞膜中，分子两端的亲脂性脂肪族长链分布于细胞膜两边的磷脂层中，苝母核则横穿细胞膜。

分子的荧光特性不受影响，同时苝酰亚胺也不会诱导磷脂的非特异性相互作用。

（3）太阳能电池

与无机太阳能电池相比，有机太阳能电池虽有转换效率较低，结构无序，体电阻高等问题，但是有机半导体材料重量轻、成本低、加工性好、能吸收可见光且易于制备大面积电池等优点，使其成为很有潜力的电池。

1.1.3　苝系荧光化合溶解性

由于苝酰亚胺类化合物具有大的平面环状共轭体系，分子间π-π相互作用非常强，具有很大的晶格能，其溶解性很差。

经过科学家们一系列的研究表明，经过化学修饰后的苝酰亚胺类化合物的溶解性能得到很大程度的提高。

而且，在日常的生活中，常常需要将染料溶于水中使用。

因此，合成苝酰亚胺类水溶性衍生物是很有必要的研究工作。

通常增加苝酰亚胺的溶解性可以通过以下两方面对苝酐核的化学位置进行修饰，使共平面性降低，破坏结晶，增加溶解能力。

第一方面：

在苝核上引入亲水性的基团；第二方面：

在苝核上连接上带有电荷的基团，从而将电荷转移至苝核，以抑制苝平面间π-π堆积[3]作用。

针对以上两方面，对于如何提高苝酰亚胺衍生物溶解性，学者们的方法通常有两种：

其一是Langhals教授提出的，在酰亚胺的氮原子上引入增溶性的基团[4]，以喹啉、咪唑或吡啶为溶剂，以醋酸锌为催化剂，苝四羧酸二酐和伯胺，在惰性气体的保护下回流。

虽然这种方法得到的化合物在溶解性方面得到显著改善，但是荧光量子产率却没有太大变化。

近年来主要通过第二种方法：

就是Seybold教授首次提出的在海湾处引入取代基，即在苝四羧酸二酐和苝四羧酸二酰亚胺的1,7或1,6,7,12位上引入增溶性取代基团的方法。

（见图1-2、1-3）

1.2　pH荧光探针的发展

pH荧光探针是随pH变化而荧光性质随之变化的一类物质。

通过pH探针在某特定pH值范围内荧光强度的增强或者减弱可以实现对pH的定性测量。

另一种方法是“比例计量型（ratiometric）”检测。

随着pH的变化,探针分子由于发生质子化/去质子化过程而导致激发（或发射）波长发生明显移动,对激发（或发射）光谱的比例变化能够实现对pH值的定量检测,这称之为“比例计量”,这类探针为比例计量型荧光探针。

比例计量型检测方法要求探针至少在两个激发（或发射）波长对被分析物（如H+）有不同的敏感度。

例如,对于某一特定的pH荧光探针,一个选定的激发（或发射）波长的荧光强度相对于另一个激发（或发射）波长可增强或降低。

这些信号之间的比例通过校准可以指示pH值。

比例计量方法的优点在于其与光学路径长度、探针浓度、光漂白和探针从细胞内流失等参数无关,因为这两个信号数据是从完全相同的环境中得到的,所以能够更好地做到定量检测和识别。

[8]

1.3　论文基本设计思路

综上所述，苝酰亚胺具有较大的平面共轭结构，这不仅仅赋予其优异的光电性能和化学稳定性，而且作为智能探针发光中心，具有较宽的吸收光谱范围、强光学稳定性和较高的荧光量子产率。

在苝酰亚胺酰胺位置上接入了PEO链之后，通过继续在海湾位置进行修饰引入识别基团，达到对pH的响应。

故本文主要工作是合成带有修饰（响应）基团的化合物并将修饰（响应）基团接入到苝酰亚胺的海湾位置上。

2　　实验部分

2.1　引言

最近，我们合成了一种苝酰亚胺探针（APBI），是一种两亲性并与生物素配体相连的探针[9]。

APBI是在苝酰亚胺的两个酰胺位置接上水溶性PEO链，这使得探针具有高度水溶性和非常低的细胞毒性[10]。

为了后续修饰基团的接入，我们还在其海湾位置上接入了两个溴原子（命名APBI-dBr）。

以此为基本原料之一，可以在海湾位置接上修饰基团使之成为具有pH响应的荧光探针。

修饰基团的合成路线如下：

使对羧基苯硼酸与N,N-二异丙基乙二胺发生酰胺化反应，得到的缩合产物与APBI-dBr进行Suzuki反应。

从而接上修饰基团。

2.2　主要试剂及仪器

2.2.1　主要试剂：

N,N-二异丙基乙二胺分析纯北京百灵威科技有限公司

对羧基苯硼酸分析纯北京百灵威科技有限公司

EDCI分析纯上海共价化学科技有限公司

1-羟基苯并三唑（HOBt）分析纯上海共价化学科技有限公司

DMF分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司

二氯甲烷分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司

无水乙醇分析纯天津市华东试剂厂

柱层层析硅胶工业品天津市海洋化工厂

三乙胺分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司

APBI-dBr自制

甲苯分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司

无水碳酸钾分析纯天津市福晨化学试剂厂

无水硫酸钠分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司

Pd（PPh3）4自制

2.2.2　试剂的纯化

DMF：

加入适量氢化钙，搅拌24h之后减压蒸出

甲苯：

加热回流1h后蒸出

2.2.3　测试仪器

1）核磁

1H-NMR测试在Bruker600MHzNMR波谱仪上进行。

2）紫外光谱

采用岛津UV-2550型紫外可见分光光度计。

3）荧光光谱

采用岛津RF-5301PC荧光分光光度计对样品进行测定.

2.3实验步骤

2.3.1合成路线

图2-3合成路线图

反应条件a：

EDCI冰浴活化40min，常温

反应条件b：

Pd（PPh3）4，K2CO3，N2保护，80℃。

2.3.2化合物III的合成

向50mL二口反应瓶中加入对羧基苯硼酸（化合物I）0.1g，少量DMF溶解，冰浴条件下加入EDCI92.8mg，冰浴活化40min。

加入69.8mgN,N-二异丙基乙二胺（化合物II）、74mgHOBt，搅拌，室温下反应12h后停止。

取样，以DCM：

乙醇=40:

3作为展开剂点板，第一个点即为所要产物III。

后处理：

1、将DMF抽干，用水和DCM萃取、分液，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥、过滤并旋干。

2、过硅胶柱：

用DCM：

乙醇=25:

1作淋洗剂，且每100mL淋洗剂中加入10滴三乙胺。

发现得到的产品不纯，爬大板（DCM：

乙醇=40：

3，80mL中加入9滴三乙胺），分离并旋干得到浅黄色粘稠液体，即为化合物III，附录中附有核磁图可验证。

2.3.3化合物IV的合成

称取APBI-130.7mg，化合物III27mg，加入到50mL二口烧瓶中，加入14mL新蒸甲苯，溶解，加入0.7mL无水乙醇，0.7mL2mol/L的K2CO3溶液，抽换气三次用N2保护，加入1.5mgPd（PPh3）4，抽换气三次，N2保护，加热到80℃开始反应，反应时间约11h。

后处理：

1、用水和DCM萃取分液，合并有机相，加入无水硫酸钠干燥2h，过滤旋干并真空干燥。

2、过硅胶柱，在配制硅胶的时候在DCM中加入少量三乙胺，搅拌处理；淋洗剂为DCM：

乙醇=20:

1，每100mL加入8滴三乙胺，旋干后得深红色固体。

2.4结果讨论

2.4.1产物的合成

1）合成路线

合成路线中共计两步反应。

第一步是常见的酰胺化反应，EDCI的作用是除去反应产生的水使平衡向正方向移动，并且EDCI是该反应的催化剂；HOBt目的是防止异构化，可在硅胶柱中除去。

所以EDCI与HOBt需加过量。

第二步反应是一个Suzuki反应，Suzuki反应对官能团的耐受性非常好，反应物可以带着-CHO、-COCH3、-COOC2H5、-OCH3、-CN、-NO2、-F等官能团进行反应而不受影响。

故在分子设计的时候选用对羧基苯硼酸，是因为考虑到下一步进行Suzuki反应的诸多优点。

2）修饰基团的选择

由于苝酰亚胺具有稳定的共平面结构，π-π作用很强且具有较大的晶格能，所以其溶解性很差，极大地限制了它的应用尤其是在生物体中的应用。

在苝酰亚胺的两个酰胺位置接上水溶性PEO链，生成APBI，这使得探针具有高度水溶性和低的细胞毒性，可以增强它应用的范围。

增大了在水中的溶解性之后我们可以考虑在pH响应方面的问题。

由于氨基N上有孤对电子，易与质子结合，因此在不同的pH环境下结构不同，荧光活性不同。

为了使结构有真正的改变而不是N和质子的结合达到简单的可逆平衡，必须通过分子设计使质子和N的结合尽量稳定，即增大胺的碱性使N结合质子的能力尽可能强。

脂肪族一级、二级、三级胺碱性的强弱，是电子效应与溶剂化效应二者综合的结果，从诱导效应看，胺的N原子上的烷基取代越多，碱性越强；从溶剂化效应来看，烷基取代越多则意味着胺的N原子上氢就越少，与水结合形成氢键越弱，溶剂化程度越小。

为了达到pH响应且可逆的目标，我们要让碱性增强，而氢键的形成对于碱性增强是有利的但是破坏氢键不易，可逆性不好，所以最终选择三级胺。

2.4.2光谱性能的表征

称取化合物IV共计1mg，溶于6.18mL0.1mol/L盐酸溶液中，配成浓度为1×10-4的溶液。

再将浓度稀释成1×10-5进行测定，测定时用0.1mol/LNaOH调pH值。

图2-4产物IV的水溶液在不同pH下紫外光谱图

如图2-4，pH在3.5-6.5时，吸光度和最大吸收波长均基本保持不变，而当pH增加到7.0时，紫外吸收峰发生了变化，这是叔胺基团发生质子化和去质子化所导致的。

图2-5产物IV的水溶液在不同pH下荧光光谱图

如图2-5是化合物IV在494nm激发波长下不同pH的荧光光谱，最大荧光强度出现在608nm处，其值为362a.u.，荧光强度最小值为9.0a.u.（pH=7.0），增强倍数为40倍。

从图2-5曲线可以看出，探针在pH值增大到6.5以后会有明显的降低，因此，pH在6.5-7.0范围内,对pH的响应非常灵敏。

附　　图

1、化合物III的1H-NMR图

结　　论

1、在苝酰亚胺（PDI）酰胺位接上PEO链增强了水溶性之后，其作为探针的发光中心对pH的响应成为了可能。

通过在两个海湾位置引入三级胺，我们得到了最终化合物。

光谱实验证实，该化合物具有对pH响应的荧光活性。

2、从光谱实验分析可知，该荧光探针在pH=6.5-7.0对pH有很强的依赖性，随着pH的升高荧光强度逐渐降低。

但具体的突变点还需更详细表征来确定。

参考文献

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concisesynthesisandcharacterizationasnearinfraredfluorescentdyes[J].TetrahedronLett,2005,46（26）:

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[2]　　KimJY,ChungIJ,KimYC,etal.Mbilityofelectronsandholesinaliquidcrystallinepe-rylenediimidethinfilmwithtimeofflighttechnique[J].ChemPhysLett,2004,398（4/5/6）:

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[3]　　赵英杰.几种基于苝系衍生物荧光探针的构建及性质研究[D].山东：

山东师范大学硕士学位论文.2008.

[4]　　H.Langhals.Heterocycles.1995,40,477.

[5]　　FranciscoGalindo,*M.IsabelBurguete,LauraVigara,SantiagoV.Luis,*NurulKabir,JelenaGavrilovic,andDavidA.Russell*Angew.Chem.Int.Ed.2005,44,6504-6508.

[6]　　GareisT,HuberC,WolfbeisOS,DaubJ.Phenol/phenolate-dependenton/offswitchingoflum-inescenceof4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacenes.Chem.Commun.1997,18:

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[7]　　BaruahM,QinW,BasaricN,DeBorggraeveWM,BoensN.BODIPY-BasedHydroxyarylde-rivativesasFluorescentpHProbes.J.Org.Chem.2005,70:

4152-4157.

[8]　　孙辉.pH荧光探针的构筑.[D].南京大学.2011

[9]　　薄福丽.荧光增强型苝类探针的设计合成及表征.[D].河北大学.2013

[10]　MerrillEW.Poly（ethyleneglycol）Chemistry:

BiotechnicalandBiomedicalApplications（Ed.:

J.M.Harris）.PlenumPressNewYork1992.

致谢

本论文是在我的导师高保祥教授的悉心指导和帮助下完成的，在整个研究过程中，高老师用其极为渊博的理论知识和丰富的实践经验，最大程度地给予了我启发与帮助。

不论是论文的选题，还是实验过程的安排亦或是实验中的操作细节，老师都尽了最大努力。

本论文能够顺利完成，要感谢高老师对我的支持和教导。

高老师渊博的知识、对待科学的严谨态度、对真理的不懈追求和谦虚谨慎的人格使我收获颇丰，他忘我的工作精神更是让我反思良多，这将不断激励我，让我奋勇向前，去追逐梦与理想。

所以首先向高老师表示最衷心的感谢和最诚挚的敬意！

另外，还要特别感谢段文凤师姐，师姐在整个实验过程中都给予了我无条件的帮助与陪伴，总能悉心解答我各种各样的问题，不仅使本论文能够按时、顺利完成，还让我学到了很多之前不具备的实验方面的知识和技巧，让我的科研水平得到了质的飞跃。

再次向师姐表示最由衷的感谢！

感谢乔严君、王佳、高微、席亚楠师姐，伊学刚师兄对我的关心和帮助！

感谢钟世龙、于朝蓬、赵鑫鑫、崔腾波、宋佳、王金金同学对我的协助！

最后，我要感谢我的家人，一直以来他们都无条件地支持我、鼓励我，他们的付出是无声的但我都看在眼里，同时还要感谢我所有的朋友对我的无私付出。

是你们大家让我有了现在具备的诸多品质，让我不畏前险、让我积极进取，谢谢你们！