培养细胞常用染色与固定方法Word文档格式.docx

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再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。

混匀。

过滤后即成母液。

可长久保存。

用蒸馏水以1:

20稀释即成工作液，可用

很长时间。

每次染色前宜过滤，去除氧化膜。

（2）伊红染液：

伊红有醇溶性与水溶性之分。

将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或

蒸

馏水即成工作液。

2.染色程序

（1）用10％甲醛（福尔马林）固定培养物30min，或以丙酮固定15min。

（2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。

（3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。

此时核呈紫红色。

（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。

如果时间允许，最好用自来水（呈弱

碱性）长时间浸泡。

也可入1％NaHCO3溶液。

此过程须不断用显微镜监视，以掌

握碱化时间。

（5）蒸馏水洗1min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。

固贴附于载玻片上。

在载玻片上

涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。

能促进细胞黏附的物质

主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。

1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min，间或振荡。

2、用自来水冲洗5min。

3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。

4、烤箱干燥（至此即可用于普通染色）。

5、多聚L-赖氨酸（1:

10溶于去离子水）浸泡5min，振荡。

6、入60℃烤箱1h，或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交

细胞化学）。

三、培养物的常用固定方法

固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织

和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防

止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在

以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。

同时，固定还可使细胞的各部分

易于着色，适于观察、长期保存和分析。

1.固定组织、细胞的基本原则

尽可能选用新鲜培养物；

根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方

法。

2.培养物的准备和固定前处理

各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培

养物都可作固定材料。

对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集

细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；

对盖片单层培养物来说，将盖片从培

养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，

备固定用。

3.常用固定液

常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。

主

要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化

汞、氯化镉、四氧化锇（锇酸）。

另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固

定液，称混合固定液。

如Mueller固定液、Flemming固定液、FAA固定液、Carnoy

固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。

不同的固定液对

细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。

因此，选择合适的固定液是达

到固定目的的基础。

（1）4％甲醛-PBS:

甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。

在很多

情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。

4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙

醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用

苏木精和其他合成染料染色。

甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存

多用甲醛。

甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作

固定剂具有显著的优点。

用40％甲醛水溶液:

PBS=1:

9配方制备甲醛固定液。

（2）丙酮：

丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮（4℃）固定细胞内酶效果较佳。

（3）乙醇：

乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细胞等

效果优良。

无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好固定

液。

乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。

作为固定用乙醇的适宜浓

度为70％～100％。

乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。

（4）醋酸：

常用0.3％～5％浓度的醋酸作固定剂。

醋酸能和水及乙醇、甲醇溶合，

醋酸不固定蛋白质，但能固定核酸。

醋酸的穿透力很大，它对细胞的膨胀作用显

著，这是由于它破坏了某些蛋白质分子的结合，所以，常用醋酸来减少其他固定

剂引起的细胞收缩。

细胞学技术中，它能防止细胞收缩，并能较好地保存染色体，

还能把染色质沉淀成为可染色的块状体。

（5）苦味酸：

苦味酸是黄色结晶体，强酸，可溶于水、乙醇、苯和二甲苯，在水

中的溶解度可因水温变化而变化。

苦味酸可以沉淀白蛋白、核蛋白、球蛋白、组

蛋白和核酸。

苦味酸的穿透力很慢，单独使用时，造成组织严重收缩。

它和其他

药物混合配制时，可以作为蛋白质的沉淀剂，同时可避免组织收缩、硬化，而且

易于染色。

所以在很多混合固定液中被广泛采用。

作固定用的最适浓度为1％。

（6）锇酸（四氧化锇）：

锇酸是一种强氧化剂，不能同乙醇和甲醛混合使用。

它的

挥发性很强，挥发出来的气体能固定结膜，对眼睛很有害，所以操作时应特别注

意。

四氧化锇是保存细胞结构的最好固定剂之一，配制时先在棕色试剂瓶中盛入

50～100ml0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0～7.4），再将装有1g锇酸的安培瓶放人

PBS中，以玻棒击碎安培瓶，摇荡使锇酸溶解，备用。

常用的固定液浓度为1％～

2％。

（7）戊二醛：

戊二醛对组织的渗透率高，与蛋白质反应快，能较好地保存蛋白质，

对微管和膜性结构保存亦比较好，并能较好地保存糖原。

常用的戊二醛固定液配

制方法列于表12-1。

表14-1常用的戊二醛固定液配制方法

Ph7.2的0.1mol/L磷酸缓冲液（ml）9696929088

25%戊二醛水溶液（ml）4681012

戊二醛的终浓度1%1.5%2%2.5%3%

（8）甲醇／醋酸固定液：

甲醇：

醋酸为3:

1的固定液是应用最广的一种培养细胞

固定剂。

甲醇穿透力好，醋酸固定蛋白效果好，两者结合，能使固定细胞形态不

变。

不仅最适用于固定染色体，而且固定的染色体适于Giemsa染色（注意：

此固

定液宜现用现配）。

（9）FAA固定液：

此固定液适用于固定盖片单层培养的细胞，固定效果好。

配制方法：

90ml80％酒精中加5ml冰乙酸和5m140％甲醛。

（10）Carnoy固定液：

Carnoy固定液是较好的非水溶性固定液，是显示细胞化学

成分（如粘多糖等）时常用的固定剂，固定、保真效果好，但穿透力差，适于固定

培养的单层细胞。

60ml纯酒精加30ml氯仿和10ml冰乙酸。

（11）Bouin固定液：

用于固定双盖片法培养的标本，固定30分钟后，用70％酒

精褪去苦味酸黄色，如不立即染色，可将标本保存在70％酒精中。

本试剂适于

固定组织细胞的糖原。

先将75ml饱和苦味酸（100ml水中加1.2～1.4g）过滤，加入25ml福

尔马林（40％甲醛，有沉淀时禁用），最后加入5ml冰醋酸，混和后存于4℃冰箱

中备用。

冰醋酸最好在临用前加入。

该固定液对组织细胞穿透力较强，固定效果

较好，保存的细胞结构完好。

但因偏酸（pH为3～3.5），对抗原有一定损害。

（12）4％多聚甲醛-PBS固定液：

多聚甲醛为白色固体，在50ml蒸馏水中加入4g

多聚甲醛，加热至60～70℃时，边搅拌边逐滴加入2mol/LNaOH，至液体清晰透

明。

用1mol/LHCl调节pH至7.4，冷却后加入0.01mol/LPBS液至100ml，4℃保

存。

本试剂适于固定肾纤维蛋白和细胞骨架蛋白。