法舒地尔对脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤的保护作用Word格式文档下载.docx

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Correspondingauthor:

XieWeiping,Email:

wpxie@

【Abstract】Object:

Toinvestigatetheprotectiveeffectsoffasudil,aRhokinaseinhibitor,ontheinflammationoflipopolysaccharide（LPS）-inducedmiceacutelunginjury（ALI）secondarytosepsisandit’sprobablymechanisminmice.Methods:

C57BL/6micewererandomlyassignedtoControlgroup;

LPSgroup;

LPS+fasudil（10mg/kg）group;

LPS+Dexamethasone（Dex,5mg/kg）group.Mortalityratesofdifferenttimepointsofeachgroupwasassessedafterthemodelestablished.Miceweresacrificedat6hafterLPSinjection.Serum,bronchoalveolarlavagefluid

基金项目：

国家自然科学基金（81273571,81001427）；

江苏省人事厅六大人才高峰（2008074）；

江苏省科技厅科技支撑计划（BE2011801）；

江苏省呼吸病临床医学研究中心（BL2012012）

通讯作者（Correspondingauther）：

解卫平Email：

wpxie@

（BALF）andlungtissueswerecollected.ElisawasperformedtoanalyzethelevelofTNF-α、IL-1βandIL-10intheserum,analyzethecellcountingandtheproteincontentinBALF,stain

withhematoxylinandeosin;

testthewet-to-dry（W/D）weight;

measurethecontentofmyeloperoxidase（MPO）contentinlungtissue.Results:

Fasudilsignificantlyimprovedthemortalityratesandprolongedthesurvivaltimeofmice,reliefedofinflammatoryinjuryandedemaoflungtissue,decreasedMPOcontent.Moreover,fasudildownregulatedtheexpressionofTNF-α、IL-1βandupregulatedIL-10inserum.Conclusions:

FasudileffectivelyreducedtheLPS-inducedALI,controllingtheinflammatoryresponseinthepulmonarymayplayimportantrolesinthemechanismsinALI.

【KeyWords】:

acutelunginjury;

lipopolysaccharide;

fasudil

急性肺损伤（acutelunginjury，ALI）是临床疑难危重症之一，常与微生物感染、损伤等因素有关，临床治疗困难，病死率高。

革兰阴性细菌感染所致的败血症是引起ALI发生的最常见原因。

其机制可能与肺部炎症渗出、气体交换功能受损有关，各种信号通路参与其中，机制复杂，其确切机制尚不完全明了。

脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）作为革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，是感染性疾病的主要病原[1]，可激活大量的炎症细胞，诱导急性炎症，导致ALI发生。

Rho激酶是小分子GTP酶Rho家族的效应器之一，参与调控细胞的多种重要功能，如细胞骨架的维持，细胞粘附、增殖和迁移，细胞凋亡及基因转录等。

Rho/Rho激酶通过调制NF-κB的活性，调控多种炎症因子的合成释放，抑制组织器官炎症反应，是一种潜在的防治炎症相关性疾病的靶标[2]。

Meyer-Schwesinger等[3]研究发现，Rho激酶抑制剂通过抑制NF-κBp65信号通路，保护LPS所致的急性肾损伤小鼠；

Shao等[4]研究提示，选择性Rho激酶抑制剂法舒地尔（fasudil）可通过抑制TLR-4、NF-κBp65活化，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等水平发挥抗炎效应，减缓自身免疫性脑脊髓炎的进展。

Fasudil作为一种被广泛认可的选择性Rho激酶抑制剂，目前已被用于治疗脑血管痉挛[5]、脑卒中[6]和外伤性脊髓损伤[7]。

然而，尽管近年来已有研究表明fasudil对ALI有一定治疗作用，但其具体机制尚未完全阐明。

本实验以LPS建立小鼠ALI模型，通过检测BALF、血清中各类炎症因子水平探讨fasudil对小鼠ALI保护作用的相关机制。

1材料与方法

1.1动物和分组

健康雄性6-8周龄C57BL/6品系小鼠128只，体重18-22g，购自北京维通利华。

实验小鼠均分笼饲养在清洁环境中，保证足够的食物和水，实验室温度维持在25℃左右。

1.2材料

Fasudil购自天津红日药业股份有限公司，LPS（E.coli055:

B5）、地塞米松（dexamethasone，Dex）购自Sigma公司，髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）测定试剂盒购自Hycultbiotech公司，小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10ELISA测定试剂盒购于R&

D公司。

1.3小鼠急性肺损伤模型的构建

取小鼠48只，以4%水合氯醛1g/kg腹腔注射麻醉，随机平均分成以下4组，每组12只：

Control组（生理盐水0.2ml腹腔注射），LPS组（LPS30mg/kg腹腔注射），fasudil+LPS组（LPS腹腔注射前1h给予fasudil10mg/kg），Dex+LPS组（LPS腹腔注射前1h给予Dex5mg/kg）。

注射LPS或生理盐水后6h麻醉动物，摘眼球取血并处死动物，收集BALF和肺组织，测定各项指标。

1.4小鼠生存率评估

为观察fasudil对急性肺损伤的保护效果，取小鼠80只，同上分为4组，每组20只，注射LPS或生理盐水后记录各组小鼠的精神状态和生存情况，每8h观察一次，共观察72h，计算生存率并绘制生存曲线。

1.5ELISA检测血清TNF-α、IL-1β、IL-10炎症因子水平

小鼠摘眼球取血后37℃静置0.5h，3500rpm，4℃离心10min，收集上层血清用以检测各种炎症因子水平。

参照试剂盒说明书，分别将标准品和血清样本加入相应孔中（100μl/孔），封板胶纸封住反应孔，37℃温箱孵育90min；

洗板5次，除空白孔外均加入生物素化抗体工作液（100μl/孔），37℃温箱孵育60min；

洗板5次后加入酶结合物工作液（100μl/孔），37℃避光孵育30min；

洗板5次后加入显色底物100μl/孔，37℃避光孵育15min，加入终止液100μl/孔，混匀后即刻测量OD450值。

1.6BALF炎症细胞总数、分类计数及蛋白含量测定

固定小鼠，切开颈部正中皮肤及肌肉，暴露颈部气管。

行气管插管，用0.4mL生理盐水灌洗肺组织3次，合并3次收集BALF。

3500rpm，4℃离心10min，沉淀以1ml红细胞裂解液重悬沉淀去除红细胞，3500rpm，4℃二次离心10min，100μl生理盐水重悬沉淀行白细胞计数，Wright-Giemsa染色后行细胞分类计数。

留取上清用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其中的蛋白含量，比较各组小鼠炎性渗出的严重程度。

1.7肺组织病理学观察及评分

动物处死后，解剖观察肺大体标本。

取小鼠左肺下叶新鲜组织，4%多聚甲醛固定24h，酒精梯度脱水、脱蜡后石蜡包埋，制作厚度为4μm的切片，HE染色后光镜下观察肺组织病理改变。

参照Mikawa等[8]方法，肺损伤通过肺组织充血、水肿、间质炎症改变及炎症细胞浸润程度4个范畴进行评判，根据每个范畴的严重程度分为0级（正常）、1级（轻度）、2级（中度）、3级（中度）、4级（极重）4个等级，通过对4个范畴的评分加成计算总的肺损伤评分。

1.8肺组织湿/干重量比（W/D）

小鼠固定后开胸，取左肺叶用生理盐水冲洗2次，滤纸吸干表面血水后称此叶肺组织的湿重，置70℃恒温箱烘烤72h至干重恒定，称干重后计算湿/干重量比。

W/D代表肺组织含水量，用于评定肺水肿的严重程度。

1.9肺组织MPO含量测定

取约100mg肺组织置于预冷的1mlPBS（pH=7.4）中匀浆，再以12000g，4℃离心10min取上清，参照MPOELISA试剂盒说明书检测肺组织中MPO的含量。

1.10统计学分析

使用SPSS13.0软件进行统计学分析。

定量资料以均数±

标准差（

±

S），多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用q检验。

应用Kaplan-Meier曲线计算生存率，应用Log-rank检验比较不同组的生存曲线。

定义P<

0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1小鼠的一般情况

Control组小鼠活泼好动，呼吸均匀，毛发有光泽。

LPS组小鼠精神差，活动明显减少，眼角有脓性渗出，部分伴腹泻及鼻出血，呼吸加速，双腿蜷缩，反应迟钝，毛发凌乱。

LPS+fasudil组及LPS+Dex组小鼠的一般精神状态明显好于LPS组。

2.2小鼠生存率

造模后，根据时间推移统计每组小鼠的生存情况，记录每只小鼠的生存时间，绘制生存分析曲线。

结果如图所示（图1），动物死亡主要发生在24-72h，72h后则死亡较少。

同时行Log-rank方法比较不同组之间的生存率有无差异，结果表明Control组动物无死亡，LPS组较Control组生存率明显减低（P<

0.05），fasudil和Dex可显著提升LPS诱导的ALI小鼠生存率（P<

0.05）。

2.3血清TNF-α、IL-1β、IL-10表达

LPS组血清TNF-α和IL-1β水平较Control组显著升高（P<

0.05），fasudil及Dex可显著下调血清中TNF-α和IL-1β水平，差异有统计学意义（P<

LPS+Dex组TNF-α水平与Control组比较无统计学意义，但LPS+fasudil与Control组比较仍有统计学差异（P<

LPS+fasudil组及LPS+Dex组血清IL-1β水平与Control组比较有统计学差异。

LPS组血清IL-10水平较Control组显著升高（P<

0.05），LPS+fasudil及LPS+Dex组IL-10水平较LPS组也显著升高，差异具有统计学意义（P<

0.05，图2）。

2.4BALF中炎症细胞总数、分类计数及蛋白含量的变化

与Control组相比，LPS组BALF细胞总数、中性粒细胞数、蛋白含量显著升高（P<

0.05）；

LPS+fasudil和LPS+Dex组BALF细胞总数、中性粒细胞数、蛋白含量则显著降低（P<

LPS+fasudil组及LPS+Dex组BALF细胞总数、中性粒细胞数、蛋白含量虽较LPS组有所降低，但与Control组相比仍有统计学差异（P<

0.05，图3）。

2.5肺组织病理学改变

小鼠肺组织HE染色后，Control组肺组织偶有少量炎症细胞浸润（图4A、4B），LPS组小鼠肺泡结构紊乱，肺泡毛细血管渗出、出血，肺间质及肺泡腔内有大量炎症细胞浸润，肺泡壁增厚，部分肺泡萎陷（图4C、4D）。

LPS+Fasudil组（图4E、4F）及LPS+Dex组（图4G、4H）小鼠肺间质及肺泡出血渗出较LPS组减轻。

肺组织病理学评分提示（图4I），LPS组分值较Control组明显升高（P<

0.05），LPS+Fasudil组及LPS+Dex组分值较LPS组明显降低（P<

0.05），差异具有统计学意义，而LPS+Fasudil组及LPS+Dex组分值与Control组相比仍有统计学差异（P<

2.6肺W/D比

结果显示（图5A），与Control组相比，LPS组W/D比值显著升高（P<

LPS+Fasudil和LPS+Dex组肺W/D比值则显著低于LPS组（P<

LPS+Fasudil组及LPS+Dex组与Control组相比无明显差异（P>

2.7肺组织MPO含量的变化

造模6h后LPS组中小鼠肺组织MPO的含量显著高于Control组（P<

0.05），LPS+Fasudil和LPS+Dex组MPO含量均较LPS组显著降低（P<

0.05，图5B）。

3讨论

败血症是感染所致的系统性炎症反应，可导致多器官功能衰竭，肺组织是最重要的靶器官之一，引起肺泡上皮细胞和毛细血管内皮细胞损伤，弥漫、广泛的肺间质充血水肿、炎症细胞浸润、ALI、低氧血症甚至急性呼吸衰竭。

ALI的特征之一是大量液体渗出至肺泡腔，使肺泡-毛细血管屏障功能受损，导致肺泡水肿、气体交换效率降低[9]。

为确定ALI/ARDS（急性呼吸窘迫综合征）小鼠肺水肿的严重程度及肺组织通透性，本实验测定了肺W/D比值及BALF中总蛋白含量。

结果显示，给予fasudil预保护后，肺W/D比值及BALF中总蛋白含量显著降低，提示fasudil可有效减轻肺水肿、阻止蛋白水肿液渗出到肺组织，从而缓解ALI/ARDS症状。

迄今，ALI/ARDS的发病机制尚未十分明确，目前观点认为由先天性免疫应答介导的炎症机制占主导作用。

中性粒细胞浸润是急性肺损伤时肺内炎症的主要标志，它通过释放蛋白酶、过氧化物等细胞毒性物质及大量炎症因子，损伤毛细血管内皮及肺泡上皮细胞，活化周围邻近的中性粒细胞，引起级联放大的炎症反应。

Dex作为一种常用的非特异性抗炎药物，能显著抑制急性肺损伤患者的局部及全身炎症反应，改善患者的临床症状及长期预后，但其副作用较大，因此有必要开发新型替代激素治疗以防治全身不良反应的有效化合物。

本研究发现，fasudil是一种较有潜力的治疗ALI的化合物，可减轻LPS引起的肺组织损伤及肺内中性粒细胞等炎症细胞浸润，从而阻断瀑布样炎症级联反应的正反馈通路。

中性粒细胞是机体抵御病原微生物入侵的第一道防线，可迅速抵达感染发生部位，它是ALI肺组织中主要的细胞类型，MPO作为中性粒细胞的标志性酶，其活性反映了中性粒细胞在肺组织中的聚集情况[10,11]，在ALI时显著升高。

多数控制ALI炎症反应的药物可降低MPO含量，本实验应用fasudil预保护能显著下调小鼠肺部MPO含量，提示fasudil可通过抑制多核中性白细胞聚集，缓解LPS介导的肺损伤。

LPS通过细胞表面Toll样受体-4（TLR-4）启动下游信号级联反应，诱导细胞因子的基因表达，过度表达的促炎细胞因子又可加速败血症发展。

内毒素刺激数分钟内合成释放的TNF-α、IL-1β是最重要的早期促炎细胞因子。

IL-10是TH2细胞源性抗炎细胞因子，可有效抑制和终止炎性反应，抑制炎症细胞因子TNF-α、IL-1β等的释放，抑制免疫炎症反应，提高机体的抗感染能力。

本文结果显示，fasudil可显著下调LPS诱导的小鼠血清中TNF-α、IL-1β表达，上调抗炎细胞因子IL-10表达，继而维持促炎因子与抗炎因子的相对平衡，利于ALI患者的预后和转归。

Rho激酶作为调控细胞多种重要功能的关键元件，参与了炎症相关的信号通路如NF-κB的活化及T细胞增殖。

Fasudil作为一种Rho激酶抑制剂，已被证实可降低早期炎症反应中促炎细胞因子及粘附分子（ICAM-1）水平、抑制肺组织中大量中性粒细胞聚集。

研究表明，Rho激酶在LPS所致的AP-1活化中扮演了重要作用，Rho激酶抑制剂fasudil可通过抑制AP-1活化而保护LPS所致的ALI小鼠[12]，Rho激酶抑制剂通过下调Rho激酶2活性、减少细胞因子产生及白细胞浸润，缓解LPS所致的小鼠肾损伤[3]；

同时在心肌[13]及肝脏缺血再灌注损伤[14]，组织纤维化[15]，在脑缺血[16]及肺动脉高压[17]等疾病中，Rho激酶抑制剂也发挥了重要的保护作用。

本研究发现，fasudil可减轻小鼠ALI炎症反应，改善小鼠精神状态、延长小鼠生存时间，Rho/Rho激酶可能参与了ALI的发生发展等病理生理过程。

综上所述，Rho激酶抑制剂fasudil可以改善LPS诱导的急性肺损伤小鼠的全身症状、精神状态，抑制ALI时肺组织水肿、炎症细胞浸润、调控炎症介质释放、调节促炎及抗炎因子的平衡。

fasudil可能是未来治疗ALI的候选药物。

但其对ALI更具体的作用机制还需更进一步探讨研究。

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