细胞工程Word格式.docx

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①饲养层的制备及分化抑制物的选择：

常用的饲养层是小鼠成纤维细胞无限系（STO）或小鼠原始胚胎成纤维细胞（PMEF）制备而成。

两种细胞可分泌成纤维细胞分化抑制因子LIF，以助ES细胞增殖，抑制细胞的凋亡和分化。

②早期胚胎及PGC的培养和ES细胞的分离传代：

将分离得到的早期胚胎或PGC置于饲养层或条件培养基上，在5%CO2、37~39℃条件下进行培养。

当胚胎内细胞团ICM增殖后或PGC出现ES样克隆后即可用胰酶EDTA消化，用吸管将其打散成单个细胞，然后移入新的饲养层进行传代。

③ES细胞的鉴定；

④建档保存。

问题1、细胞的分化潜能干细胞可分为哪几种类型？

各类干细胞有何特性。

答：

依据干细胞的分化潜能，可分为三种类型：

全能性干细胞、多能性干细胞、单能干细胞。

全能性干细胞具有形成完整个体的分化潜能；

多能性干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制；

单能（定向）细胞（也称专能或偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，多数的组织或器官干细胞属于这一类。

2、是胚胎干细胞？

常用的胚胎干细胞分离方法有哪些？

胚胎干细胞（Embryonicstemcell）是指受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团的细胞经分裂培养，即得到胚胎干细胞。

胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有分化为体内所有组织的能力。

它是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动物的所有组织和器官，括生殖细胞。

包括畸胎瘤细胞（teratocarcinomacells,EC）胚胎干细胞（embryonicstemcells,ES）原始生殖细胞（primordialgermcells,PGC或EG）。

常用的胚胎干细胞分离方法有：

A.来源于早期胚胎的内细胞团；

B.从原始生殖嵴分离培养；

C.利用体细胞核移植的方法建立；

D.利用细胞融合方法；

E.利用单个卵裂球制备胚胎干细胞；

F.来源于孤雌生殖胚胎；

G.利用基因转移技术从成纤维细胞诱导产生。

3、干细胞有何特性，如何验证胚胎干细胞的全能性？

胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有分化为体内所有组织的能力。

胚胎干细胞的鉴定：

①形态学检测：

细胞呈圆形、核大、胞浆少；

细胞排列紧密，呈集落形生长；

集落常呈岛状、巢状。

②遗传学检测：

为正常的二倍体核型；

③酶活性检测：

ES细胞内端粒酶和碱性磷酸酶活性高；

④细胞表面标志物检测：

ES细胞膜表面有特殊的标记：

如，OCT-4，SSEA-3,SSEA-4等；

⑤体内分化潜能：

植入裸鼠皮下，可诱发形成畸胎瘤；

可分化为三个胚层的细胞；

能参与嵌合体的形成；

⑥体外分化潜能：

可形成类胚体，可在体外诱导分化为三个胚层的细胞。

5、培养细胞形态分类

（一）体外细胞培养物的生长类型

体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。

粘附型细胞:

附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。

是大多数有机体细胞在体内生存和生长发育的基本存在方式。

有机体的绝大多数细胞必须粘附于一固相表面才能生存和生长。

细胞在体内、外的粘附方式存在差异：

体内——粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征；

体外——多数情况，细胞只有一个附着平面外形一般与体内时明显不同

按照培养细胞粘附生长时的主要形态，主要分两类：

上皮细胞型和成纤维细胞型，其它为不定型（游走型细胞、多形型细胞）。

上皮细胞型：

来源于外胚层，内胚层细胞，类似体内的上皮细胞，呈扁平不规则多角形，中有圆形核。

生长特点：

易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状，生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动

成纤维细胞型：

由中胚层间充质组织起源的组织，似体内成纤维细胞的形态，呈梭形或不规则三角形，胞质向外伸出2—3个长短不等的突起，中有卵圆形核

排列成放射状，漩涡状并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动。

游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起

悬浮型细胞:

不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。

特点：

在悬浮中生长良好，细胞圆形，单个或小细胞团。

优点：

生存空间大，提供数量大，传代方便（不需消化），易于收获，可获得稳定状态。

缺点：

观察不方便

，很多细胞不能悬浮生长（尤以正常细胞）。

问题：

体外培养细胞有哪些类型？

其生长特点有什么区别？

离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。

有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。

贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。

按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：

成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；

少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，如白细胞、淋巴细胞及某些肿瘤细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。

由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。

6、培养细胞的生长特点

（一）贴附：

贴附并伸展是贴壁型细胞体外培养时的基本生长特点。

（细讲以成纤维细胞为例P39）

（二）接触抑制:

一种由细胞接触而抑制细胞运动的现象。

可作为区别正常细胞与癌细胞（无接触抑制）标志之一

（三）密度抑制：

当细胞密度逐步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养的枯竭和代谢的影响，而分裂停止的现象。

四、培养细胞的生长和增殖过程

（一）组织培养细胞生命期

所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。

包括原代培养期、传代培养期及衰退期。

原代培养期：

也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1-4周。

细胞呈活跃移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。

传代期：

当细胞增殖达到一定密度后需要分离出一部分细胞和更新营养液，以继续细胞的生存的过程叫传代。

初代培养的细胞一经传代后便改称做细胞系。

在全生命期中此期的持续时间最长，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型。

衰退期：

此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。

细胞系的生长过程包括哪些主要阶段？

每一生长阶段各有什么特征？

进行正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，细胞系的生长过程都经历原代培养期、传代培养期和衰退期（或永生化）三个阶段。

1原代培养期也称初代培养期，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1～4周，此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。

原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动相似性较大，细胞相互依存性强。

如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率很低，即细胞独立生存性差。

2原代细胞生长一定时间后，如是贴附型细胞就会连接成片而铺满瓶底，这时需将原代细胞分开至多个新的培养瓶中，这个过程称为传代。

初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。

此期细胞增殖旺盛，可见细胞分裂相，并能维持二倍体核型。

传代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动发生较大改变。

一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。

3衰退期的细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；

细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。

在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生转化。

转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性。

细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。

（2）体外培养细胞一代生存期

所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。

每代细胞一般要经过三个生长阶段。

问题3、每代细胞的生长曲线包括哪几个主要时期？

各期细胞有何特点？

每代细胞从开始接种到分离再培养，一般要经过以下阶段：

潜伏期、指数（对数）生长期和停止期（平台期）。

①细胞接种培养初期，历经悬浮、贴壁及生长加速的阶段。

细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。

此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。

接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，贴壁出现标志悬浮期结束。

细胞贴附于支持物后，会发生一系列变化，然后还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。

细胞处在潜伏期时，可有生长活动，基本无增殖，少见分裂相。

潜伏期后，细胞分裂出现，并逐渐增多，标志细胞进入指数生长期。

②又称对数期。

此时细胞生长增殖旺盛，细胞成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。

细胞分裂相增多。

细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。

）

③在细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停止期。

此时细胞数量持平，故也称平台期。

停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，可继续存活一段时间。

该时期细胞形态轮廓增强，最后开始衰退死亡。

2、常用的组织细胞分离方法有哪几种？

答：

分散组织的方法有机械法分离和消化分离法两种；

根据组织种类和培养要求，宜采用相应的方法。

（1）.机械分离法：

A.离心分离法B.切割分离法C.机械分散法；

（2）.消化分离法：

A.胰蛋白酶消化法B.胶原酶消化法C.EDTA（螯合剂消化法

3、贴壁细胞传代时采用何种方法？

其技术关键是什么？

贴壁细胞传代时采用消化分离法，其技术关键是把握好传代时机，消化时间要适度，消化液浓度要适宜，传代的细胞接种数量可适当多一些，使细胞能尽快适应新环境而利于细胞生存和增殖，部分贴壁生长细胞不经消化处理直接进行吹打也可使细胞从壁上脱落下来，而进行传代。

4、什么是细胞系、细胞株、细胞融合？

细胞系（cellline）:

原代培养物经首次传代成功后即成细胞系。

如果细胞系不能继续传代或传代次数有限，称为有限细胞系，它由原代培养中的许多细胞系列组成；

如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系，即已建成的细胞系。

细胞株（cellstrain）：

通过筛选或克隆化，且有特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。

这些特性包括具有一定的标记染色体，对某种病毒的敏感性或抗性及具有特殊的抗原性等。

细胞融合（cellfusion）：

又称体细胞杂交（somatichybridiazation），是指两个或更多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。

8、细胞融合的意义

理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。

这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义；

融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径；

体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统；

淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

9、细胞融合的常用方法

（一）仙台病毒法

（二）聚乙二醇（PEG）法

（三）电融合法

问题简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。

促细胞融合的方法有：

病毒融合剂诱发细胞融合，化学融合剂诱发细胞融合，电融合法。

细胞融合的基本技术：

细胞融合实际上包含多个过程,首先是两个亲本细胞并列，以后膜组织局部破坏，最终形成包围融合细胞的连续胞膜。

融合细胞表现的特征性变化，有膜成分和胞质成分的交流以及细胞内电导率的连续性。

问题简述筛选融合细胞的主要方法与原理（各种方法的原理？

）

利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，建立了多种选择选择系统，最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。

酶缺陷型：

将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；

未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。

因此存活下来的只有融合细胞。

11、细胞杂交瘤技术与单克隆抗体

（一）单克隆抗体

只针对某一抗原决定簇的抗体分子称为单克隆抗体。

单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗源免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。

因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术（hybridomatechnology）。

（二）杂交瘤细胞的制备

（1）骨髓瘤细胞选择及选择性培养基

骨髓瘤细胞本身不能分泌抗体

选择次黄嘌呤鸟嘌呤转磷酸核糖激酶缺陷型（HGPRT-）

胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）

HAT培养基：

次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）、胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidine，T）

（2）免疫小鼠

（3）脾细胞的制备

（4）细胞准备

（5）细胞融合

（6）融合后细胞培养

（7）抗体检测：

免疫荧光试验、放射免疫试验（RIA）、联免疫吸附试验（ELISA）

（8）单克隆抗体的大量制备：

体内法、培养法

单克隆抗体的应用

单克隆抗体具有高度的特异性与灵敏性，可以广泛地由于临床医学的疾病诊断，以提高疾病诊断的准确性；

利用单克隆抗体技术可以生产各种免疫疫苗，这不仅能大大降低生产成本，同时也增加了疫苗的安全性；

单克隆抗体还有可能用于某些肿瘤的治疗，是人类战胜癌症十分有望的潜在技术；

单克隆抗体技术还可广泛用于各种基础医学研究，从而推动现代医学的不断发展。

（三）人源单克隆抗体

主要困难

（1）缺乏合适的人骨髓瘤细胞株作为融合亲本。

现有的细胞株大多是融合率不高，杂交瘤抗体产生水平低，而且细胞不稳定，易丧失抗体分泌能力；

（2）获得抗原特异的人B淋巴细胞十分困难，因为对人来说，高度免疫获得抗原特异的B淋巴细胞的方法显然是不可行的；

（3）大量繁殖杂交瘤细胞以获得所需量的抗体，鼠类杂交瘤可通过小鼠腹腔接种杂交瘤细胞诱生腹水达到这一目的，但是人杂交瘤细胞在鼠类中诱生腹水是很困难的。

问题1、简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。

针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。

原理：

在体液免疫反应中，一个抗原分子上可能含有许多抗原决定簇（即表位），每个淋巴细胞都会产生针对一个抗原决定簇的特异性抗体，若能把此B细胞由脾脏中挑出来，单独培养成细胞株，则可得单一种类的抗体，只会对一种抗原决定簇反应，其专一性极高。

大量培养此细胞株，即可有质量一定、纯度均一的抗体，此即为单克隆抗体。

基本过程：

先免疫动物，分离脾细胞，准备骨髓瘤细胞的准备，细胞融合，筛选与克隆融合细胞，最后大量制备单克隆抗体。

方案：

免疫动物：

将处理好的A抗原多次注射到小鼠体内，每隔2天注射一次，第3~5天进行试采血检验血清中的抗体，同时采集淋巴细胞（大多为B细胞）。

细胞富集：

将抗原包被在培养板或其他基质上，然后与脾细胞结合，那些表面具有特异性抗体的B细胞与抗原结合使得B细胞黏附于培养板或基质上，轻轻洗涤除去不黏附的细胞，留下的细胞为具有特异性抗体的B细胞.

骨髓癌细胞的准备；

细胞融合：

用PEG诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞间进行融合，操作在10min内完成；

融合后马上以HAT培养，能活下来的大多为B细胞与骨髓瘤细胞融合形成的杂交瘤细胞。

未融合的骨髓瘤及骨髓瘤细胞间相互融合的细胞在HAT中因DNA合成抑制而死亡。

未融合的B细胞及B细胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。

使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；

并对单个细胞生长出的群落，再次以ELISA筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。

用体内法大量制备单克隆抗体：

可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得3～5mL左右。

2、HAT的选择原理是什么？

1.HAT系统为次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷（T）的缩写。

2.它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。

3.细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：

一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成；

另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。

一种是HGPRT酶（次黄嘌呤磷酸核糖转移酶），另一种酶是TK酶（胸腺嘧啶核苷激酶）。

4.它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。

H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。

在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。

5.因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。

但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞相融合，则杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。

6.如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。

7.如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；

4、简述单克隆抗体在临床诊疗中的应用。

理论研究，构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。

利用单克隆抗体可进行表位分析：

利用单克隆抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系，因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。

诊断试剂中的应用，针对HIV、乙肝等疾病的单克隆抗体，测定妊娠的hCG单克隆抗体、测定排卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。

疾病治疗上的应用，单克隆抗体有可能作为体内应用的单克隆靶向制剂的载体。

12、转基因动物与生物反应器

转基因动物（transgeneticanimal）：

指借助基因工程技术将外源基因导入受体动物染色体内，外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。

（一）基本过程

外源目的基因的制备→外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞→选择获得携有目的基因的细胞→选择合适的体外培养系统和宿主动物→转基因细胞胚胎发育及鉴定→筛选所得的转基因动物品系

（二）目的基因的制备

（1）目的基因的来源：

采用限制性内切酶，从生物组织中获取目的基因；

通过mRNA合成cDNA；

人工合成的DNA片段；

聚合酶链式反应（PCR）扩增特定基因片段。

（2）目的基因的克隆

通过载体在适当的宿主中克隆：

选择载体→目的基因与载体的连接→重组体导入受体细胞,通过PCR反应克隆目的基因

（3）目的基因的转移：

电穿孔法、显微注射法、裸露DNA直接注射、磷酸钙—DNA共沉淀法、脂质载体包埋法、病毒介导的生物学方法。

电穿孔法实现外源基因的转移：

利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，从而使外源DNA转移至细胞中。

此法简单、效率较高，广泛应用于培养细胞的基因转移。

显微注射转基因技术：

利用显微操作技术转移外源基因的方法。

此法转入基因长度可达数百kb；

并能随机地整合在受体细胞染色体DNA上，因此应用范围广。

但是这种整合有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或定点突变。

磷酸钙—DNA共沉淀法基因转移技术：

这种方法是受二价金属离子能促进细胞吸收外源DNA的启发而发展起来的。

当核酸以磷酸钙—DNA共沉淀物的形式在时，细胞摄取DNA的能力显著加强。

但转移效率较低，仅有1%~5%的外源DNA可以进入受体细胞核中，大约仅有1%的DNA可以在细胞中稳定表达。

脂质载体包埋法：

将需要转移的外源DNA或RNA包裹于脂质体内，由于脂质体具有磷脂双层结构，与细胞膜类似，因此可以与受体细胞膜融合，从而将外源DNA转入宿主细胞。

这种方法转基因效率高。

（三）转基因动物的方法：

反转录病毒法、基因显微注射法、胚胎干细胞移植法

基因的显微注射法：

借助光学显微镜的放大作用，利用显微操作仪，直接把DNA注射到动物早期胚胎、胚胎干细胞、体细胞或卵母细胞中，然后生产动物个体的技术。

经过显微注射DNA发育而成的动物中，有少数整合了被注射的DNA分子，成为转基因动物。

DNA显微注射法的基本程序

通过激素疗法使小鼠超数排卵，开始时注射雌性妊娠血清，48小时后再注射人绒毛膜促进腺激素，这时小鼠便会超数排卵，一般情况下5-10个，超数排卵为35个；

与雄性小鼠交配，然后杀掉小鼠，从其输卵管内取出受精卵；

将经纯化的转基因样品迅速注射入受精卵中变大的雄性原核内；

将25-40个注射了转基因的受精卵移植入代孕小鼠体内；

受精卵发育成胚胎，并繁殖成转基因小鼠子代；

从小鼠子代体内取出DNA样品，进行杂交，鉴定转基因的整合与否及位点；

子代小鼠间进行再交配，繁殖，观察转基因是否遗传及表达。

1超排卵

制定排卵程序：