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本实验除了训练学生用聚丙烯酰胺凝胶电泳别离蛋白质外，还需要掌握将蛋白质转移到硝酸纤维素膜上的转移电泳技术，运用酶法显色蛋白质，通过实验使学生学会如何检测表达蛋白质这一分子生物学的重要技术。
二、根本原理
1.质粒DNA的别离与纯化的原理：
质粒是一类在细菌细胞内发现的独立于染色体外，能够自主复制的稳定的遗传单位。
迄今为止，从细菌中别离得到的质粒都是环型双链DNA分子，分子量范围从1kb到200kb。
质粒DNA可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下又会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。
在大多数情况下质粒DNA复制中的酶体系和细菌染色体复制时所用的酶是相同的。
有些质粒复制受宿主细胞复制作用的严格限制，因此每个细胞中只含一个或几个拷贝，称为严谨型质粒，有的质粒的复制受宿主细胞的控制不严，称为松弛型质粒，它们在每个细胞中的数目可达
10-200个拷贝。
当宿主细胞的蛋白质合成受到抑制时〔例如经氯霉素处理〕，细菌染色体虽不再增加，但松弛型质粒DNA可继续被复制，以至每个细胞内的拷贝数可以增至一千到几千。
质粒具有一定的生物功能，它们往往带有一些抗药标记，当质粒DNA用人为的方法转化进细菌时，转化后的细菌会表现出质粒基因所具有的新的生物表现型，例如，把一个含有抗药基因的质粒转入细菌后，原来无抗药性的细菌那么表现出抗药的新表型。
借助转化菌获得的新表型特征，可证实质粒已转入宿主细菌中，这样就可以作为转化菌的选择性标记。
质粒作为基因克隆载体分子的重要的条件是获得批量的纯化的质粒DNA分子。
目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，它们都包括三个根本的步骤：
细菌的生长和质粒的扩增；
菌体的收集裂解，质粒DNA的别离；
质粒DNA的纯化。
〔1〕细菌的生长和质粒的扩增
从琼脂培养基平板上挑取一个单菌落，接种到含适当抗生素的液体培养基中培养。
对于松弛型质粒〔如pUC系列〕来说，只要将培养物放到标准的LB或2YT培养基中生长到对数晚期，就可以大量提取质粒，而不必选择性地扩增质粒DNA。
但对于严谨型质粒〔如pBR322〕来说，那么需在得到局部生长的细菌培养物中参加氯霉素继续培养假设干小时，以便对质粒进行选择性扩增。
〔2〕菌体的收集、裂解和质粒DNA的别离
质粒别离的根本原理是利用宿主菌〔一般是大肠杆菌菌株〕DNA与质粒DNA之间的两种主要性质差异：
〔1〕大肠杆菌的染色体较一般的载体质粒DNA大得多。
〔2〕从细胞中提取得到的大肠杆菌DNA主体是变性的线性分子，而大多数质粒DNA是共价闭合的环状分子。
这里主要介绍碱裂解法的根本原理：
在细菌悬浮液中参加SDS〔十二烷基硫酸钠〕和NaOH使菌体裂解〔有时需要先使用溶菌酶水解细胞壁〕。
此处理可破坏碱基配对，故可使细菌的线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开。
当条件恢复正常时〔如参加酸性的NaAc或Kac中和碱性NaOH〕，质粒DNA链迅速得到准确配对，重新恢复成天然的超螺旋分子。
通过离心，可以使染色体DNA与变性蛋白质、RNA分子一起沉淀下来，而质粒超螺旋分子仍滞留于上清中。
〔3〕质粒DNA的提纯
对于小量制备的质粒DNA，经过苯酚抽提、RNA酶消化和酒精沉淀等简单步骤除去剩余蛋白质及RNA，到达纯化的目的。
质粒DNA分子具有三种构型：
共价闭合环形DNA〔cccDNA，SC构型〕、开环DNA〔OC构型〕和线性分子〔L构型〕。
在细菌体内，质粒DNA是以负超螺旋构型存在的。
在琼脂糖凝胶电泳中不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子量相同，但具有不同的电泳迁移率。
其中走在最前沿的是SC
DNA，其后依次是L
DNA和OC
DNA。
2.琼脂糖凝胶电泳的原理：
影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素主要有：
〔1〕DNA分子的大小
双链DNA分子在凝胶基质中迁移的速率与其碱基对数的常用对数成反比。
分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。
〔2〕琼脂糖浓度
给定大小的线状DNA片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中迁移速率不同。
在DNA电泳迁移速率的对数和凝胶浓度之间存在线性相关。
〔3〕DNA的构象
超螺旋环状〔Ⅰ型〕、切口环状〔Ⅱ型〕和线状〔Ⅲ型〕DNA在琼脂糖凝胶中以不同速率迁移。
其相对迁移速率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，其次是电流强度、缓冲液离子强度和Ⅰ型超螺旋绞紧的程度或密度。
一些条件下，Ⅰ型DNA比Ⅲ型迁移得快；
在另一些条件下，顺序可能相反。
〔4〕所用的电压
低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。
电场强度升高时，高分子量片段的迁移率遂不成比例的增加。
所以，当电压增大时琼脂糖凝胶别离的有效范围反而减小。
要获得大于2kb
DNA片段的良好分辨率，所用电压不应高于5-8V/cm。
〔5〕电泳缓冲液
DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。
缺乏离子那么电导率降低，DNA或者不动或者迁移很慢。
高离子强度时〔如10×
buffer〕，电导率升高，使得应用适中的电压也会产生大量的热能，最严重时凝胶会熔化，DNA变性。
3.酶切及连接的原理：
迄今已发现了3000多种限制性内切酶。
传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。
II型酶在其识别位点之中或临近确实定位点特异地切开DNA链。
它们产生确定的限制片段，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。
II型限制性内切酶中最普遍的是象EcoR
I、Hind
III、BamHI和Not
I这样在识别序列中进行切割的酶。
这一类酶是构成商业化酶的主要局部。
大局部这类酶都以同二聚体的形式结合到
DNA上，因而识别的是对称序列；
但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。
一些酶识别连续的序列〔如EcoR
I识别GAATTC；
Hind
III识别AAGCTT;
BamHI识别G↓GATCC;
Not
I识别GC↓GGCCGC〕；
而另一些识别不连续的序列〔如Bgl
I识别GCCNNNNNGGC〕。
限制性内切酶酶切DNA后形成两种类型的末端：
（i）两条链断裂的位置是交错地，产生粘性末端，如EcoR
I酶切后产生末端；
（ii）两条链的断裂位置处在一个对称结构
的中心，产生平末端，如HaeIII酶切后产生DNA连接酶能够催化在两条DNA链之间形成磷酸二酯键，这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基〔-OH〕，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团〔-P〕。
4.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的原理：
外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增。
感受态指细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。
大肠杆菌的感受态可用CaCl2处理而诱导产生：
将正在生长的大肠杆菌细胞在0℃下参加到低渗的CaCl2溶液中，便会使细胞膜的透性发生改变，此时的细胞即呈现为感受态。
这一方法可以用于批量制备感受态细胞，其转化效率可到达5×
106-2×
107个转化克隆子/μg超螺旋质粒DNA。
制备好的大肠杆菌感受态细胞可在-70℃冻存。
在0℃下外源DNA可吸附到感受态细胞外表，短时间的热刺激〔42℃，90s〕诱导细胞吸收DNA。
转化了质粒DNA的大肠杆菌随后在培养基中37℃培养1hr，可使质粒DNA中编码抗生素抗性的基因得以表达，因此，转化了质粒DNA的大肠杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞那么无法生长。
5.重组质粒DNA的鉴定〔双酶切法和菌落PCR法〕的原理：
重组质粒DNA是利用限制性内切酶〔如BamH
I和Not
I〕分别酶切基因片段和质粒后，利用基因片段和质粒DNA一端带有相同的粘性末端连接起来的重组质粒，如果再利用相同的限制性内切酶识别重组基因片段两侧的酶切位点，通过酶切下的重组片段的大小与连接的基因片段大小是否相同判断质粒DNA是否为重组质粒。
单菌落或提取的质粒DNA也可以通过PCR方法鉴定正确克隆。
聚合酶链式反响〔Polymerase
Chain
Reaction，简称PCR〕是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法。
典型的
PCR由高温变性、低温退火和适温延伸等三步反响组成一个循环周期，通过屡次循环反响，使目的DNA得以迅速扩增。
其主要步骤是：
将待扩增的DNA置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别在目的片段两侧与DNA两条链互补结合；
DNA聚合酶在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，沿模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。
具体地说，PCR反响系统有寡核苷酸引物，反响缓冲液，热稳定DNA聚合酶〔Taq酶〕，脱氧核苷三磷酸底物和靶序列〔即模板〕等五局部组成，缺一不可。
PCR技术能在试管中建立反响，经数小时之后，就能将极微量的某一特定的目的DNA片段扩增106倍以上，而无需经过烦琐的基因克隆程序便可获得足够数量的精确的DNA拷贝。
它操作简单，易于掌握，结果也较为可靠，为基因的分析和研究提供了一种强有力的手段，对整个生命科学的研究与开展都有深远的影响。
因此，PCR技术产生的时间虽不长，却以惊人的速度广泛地应用于分子生物学的各个领域。
它可用于基因的别离、克隆和核苷酸序列分析、突变体和重组体的构建、基因表达调控的研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及法医鉴定等诸多方面。
6.GFP蛋白的诱导表达的原理：
IPTG〔异丙基硫代β-L半乳糖苷〕是一种常见的诱导基因表达的诱导剂，结构类似乳糖。
GFP基因连接到pET-28a的多克隆位点〔MCS〕，GFP基因的表达受其上游T7启动子和操纵基因O位点以及结合到这些顺式作用元件的蛋白因子的控制。
LacI基因编码调节蛋白，可以四聚体的形式结合到操纵基因O位点上，关闭GFP基因的表达。
IPTG可与四聚体调节蛋白结合，从而改变调节蛋白的构象，使调节蛋白不再与O位点结合。
接着BL21编码的T7
RNA聚合酶结合到T7启动子位点，从而启动GFP基因的表达。
7.Western-blotting的原理：
蛋白质印迹〔Western-blotting〕是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，利用抗原-抗体反响原理，以一抗作为探针，与目的蛋白作用并连接，再用带有标记的二抗与一抗作用，最后显色，显色位置即为目的蛋白。
这种以高强力形成印迹的方法被称为Western-blotting技术。
作为抗原的物质：
天然蛋白、重组蛋白、偶联多肽等。
抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。
一种抗原决定簇刺激机体，由一个
B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体〔Monclone
antibody〕有多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体，机体内产生的抗体就是多克隆抗体。
多克隆抗体由于其可识别多个抗原表位，制备时间短，本钱低的原因广泛应用于研究和诊断方面。
第一抗体就是能和非抗体性抗原特异性结合的蛋白。
种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。
第二抗体是能和抗体集合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。
二抗是利用抗体是大分子蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物免疫系统产生的免疫球蛋白，即一抗充当抗原刺激机体产生的抗体。
二抗上带有可以被检测的标记，如荧光、放射性、化学发光或显色集团。
His标签是蛋白质重组技术中经常用到的一种标签，其序列为六个组氨酸，其特点是分子量小、根本不改变蛋白质的生物结构、蛋白质的溶解性，在目的蛋白质检测和纯化方面极为方便。
His标签抗体可以用于检测和His标签融合蛋白的表达、细胞内定位，以及定性或定量检测His融合表达蛋白等。
免疫印迹的实验包括5个步骤：
〔1〕
固定：
蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳〔PAGE〕并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
〔2〕封闭〔blocked〕：
保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上，并与蛋白质反响。
〔3〕初级抗体〔第一抗体〕是特异性的。
〔4〕第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
〔5〕被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反响。
三、实验材料、仪器及试剂
1．实验材料
含pEGFP－N3大肠杆菌液和含pET-28a
DNA的大肠杆菌液，DH5α，BL21，pET-28a重组质粒DNA，正向引物：
5’-ggg
CAT
ATg
gTg
AgC
AAg
ggC
gAg
g-3’，反向引物：
CTC
TTA
CTT
gTA
CAg
g-3’，第一抗体〔兔源His标签抗体〕，第二抗体〔羊抗兔Ig多克隆抗体〕。
2．使用仪器
恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、掌中宝离心机、小型混合器，冰箱，
移液枪、核酸电泳仪、小型混合器、冰箱、蓝盾可见光透射仪、水浴锅、移液器、电泳槽、电泳仪、振荡器、蓝盾可见光透射仪、凝胶成像仪、高压灭菌锅、离心机、PCR仪、1.5ml离心管、蛋白质电泳槽，蛋白质电转移槽一套〔百晶公司〕，硝酸纤维素滤膜，直径为20cm和10cm的培养皿各一个，剪刀、镊子、刀片，普通滤纸。
3．试剂
BamH
I（10U/μL）
（TaKaRa公司），Not
I（10U/μL）（TaKaRa公司），T4
ligase、1%琼脂糖凝胶，
LB〔Luria-Bertain〕液体和固体培养基
四、实验步骤
1.质粒DNA的别离与纯化：
DH5α
离心管中，13000rpm离心1min。
〔2〕重复1。
〔3〕弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。
〔4〕菌体沉淀重悬浮于100μL溶液Ⅰ中（需剧烈振荡），室温下放置10min。
〔5〕参加新配制的溶液Ⅱ200μL〔SDS与NaOH等量混匀〕，盖紧管口，快速温和颠倒离心管5次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5min。
〔6〕参加150μL预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡3次，使沉淀混匀，冰浴中15分钟，13000rpm离心10min。
〔7〕吸取400μL上清液移入干净离心管中，参加800μl等体积的氯仿/异戊醇（24：
1），振荡混匀，静置10min〔可重复〕。
〔8〕将水相300μL移入干净离心管中，参加800μl等体积的氯仿/异戊醇（24：
1）振荡混匀，13000rpm离心2min。
〔9〕
将水相移入干净离心管中，参加2
倍体积的无水乙醇，振荡混匀后，置于室温下10min，然后13000rpm离心10min。
〔10〕弃上清。
〔11〕吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，室温枯燥。
〔12〕将沉淀溶于30μL
ddH2O中，取溶解的质粒液18μL进行参加酶切体系，剩余的12μL
保存在-20℃冰箱中。
〔13〕同样的流程和方法将pET-28a的质粒也提出来，保存在-20℃冰箱中。
2.
酶切及连接
按如下双酶切体系〔30μL〕混合：
反响物
pEGFP-N3〔μL〕
pET-28a〔μL〕
质粒
18
I
2
10×
buffer
K
3
ddH2O
5
5〔1〕37℃水浴酶切2-3h。
〔2〕配制1.0%〔M/V〕普通琼脂糖凝胶30ml。
〔3〕适当放置冷却，60℃左右倒于电泳胶板上，插好梳子。
〔4〕待凝胶凝固好以后，拨下梳子。
〔5〕酶切样品中参加5μl上样缓冲液〔含GeneFinder〕混匀，全部上样。
〔6〕1×
TBE
Buffer，80V（3-4V/cm）下电泳30min。
观察结果，并且拍照。
μL的体积参加PN。
〔8〕
50℃水浴放置10min，期间不断温和上下翻动离心管至胶完全融解。
〔9〕将上一步得到的溶液参加到一个吸附柱中，吸附柱再放入收集管，静置3min再在13000rpm离心60s，弃掉废液。
〔10〕参加750μL漂洗液PW，13000rpm离心60s，弃掉废液，重复一次。
〔11〕取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间位置参加适量洗脱缓冲液EB
30μL，洗脱缓冲液先室温放置2min，13000rpm离心1min，然后将离心的溶液重新加回离心吸附柱中，13000rpm离心1min。
按照以下连接体系进行，16℃或室温下连接过夜。
反响物
体积/μL
回收纯化的pET-28a质粒
gfp基因片段
12
T4连接酶
1
缓冲液〔10×
〕
23.
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
3．
1感受态细胞的制备
（CaCl2法）
〔1〕将活化的DH5α或BL21培养液转入2mL离心管中，冰上放置10min，然后于4℃下4000rpm离心5min。
的CaCl2溶液600μL轻轻悬浮细胞，冰上放置20min,
4℃下4000rpm离心5min。
〔3〕弃去上清，参加300μL预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，即成感受态细胞悬液，可-80℃长期保存。
〔1〕取2个无菌离心管，分别参加100μL
DH5α感受态细胞悬液，第1管加5μl无菌水，第2管参加质粒DNA溶液5μl，轻轻摇匀，冰上放置30min。
〔2〕42℃水浴中热激90s，热激后迅速置于冰上冷却5min。
〔3〕分别向管中参加100μL
LB液体培养基,混匀后在37℃振荡培养30min。
〔4〕从管1中取50μL涂布于含抗生素和不含抗生素的平板上,从管2中取50μL涂布于含抗生素的平板上。
正面向上放置约10分钟,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养20小时。
凝胶成像系统采集图片。
管1
管2
50μL
50μL50μL
重组质粒
4.重组质粒DNA的鉴定〔菌落PCR法〕
〔1〕挑取菌落
随机挑取1个菌落。
首先使用无菌枪头挑取菌落，在已准备好的含有卡那抗菌素，分好区的固体培养基中轻划一下〔为保菌种〕，然后将余下菌置于离心管中〔作为PCR反响模板〕。
〔2〕PCR反响体系〔20μl〕
体积/
dNTP〔10mM〕
左引物
右引物
Taq酶〔5U/μL〕
MgCl2（25mM）
Buffer
13.3〔3〕PCR循环：
95℃
5min予变性
〔95℃30s；
58℃30s；
72℃60s〕30cycles
72℃
10min延伸
〔4〕PCR产物的检测
PCR产物参加5μl溴酚蓝-GeneFinder混合液，分别按编号参加DNA琼脂糖凝胶电泳的加样孔，使用1%琼脂糖电泳别离。
〔5〕用荧光激发器看结果采集照片。
5.
GFP蛋白的诱导表达
〔1〕取3组培养好的含重组质粒DNA的大肠杆菌液2ml与2ml离心管中，参加IPTG3μL，分别诱导0h，1h，2h。
〔2〕分别取1.5ml，10000rpm离心5min，去除上清，收集沉淀，再重复一次收集沉淀。
〔3〕观察蛋白表达：
用紫外线照射菌体沉淀及培养平板，可以看到绿色荧光。
分别对均匀涂布的平板以及表达蛋白的样品管照相，保存照片。
6.
Western-blotting
蛋白质电泳
〔1〕洗净电泳用的玻璃板，晾干，按仪器使用说明装好。
〔2〕配12％别离胶8mL,分别取：
30％丙烯酰胺3.2mL，
2.08mL，
〔别离胶缓冲液〕
10％SDS8μL，
TEMED
10μL，
双蒸水
混匀后加
10％过硫酸铵30μL
混匀，灌胶。
〔3〕灌好别离胶，上面用双蒸水封好。
〔4〕待别离胶凝固后（凝胶时间半小时左右），配6％浓缩胶〔2.3ml〕：
30％丙烯酰胺0.45mL，
0.6mL，
〔浓缩胶缓冲液〕
μL，
2μL，
1.2mL，混匀后加
10％过硫酸铵20μL。
混匀。
〔5〕吸净上面的水，灌入浓缩胶，插入梳子，凝固半小时以上。
〔6〕待胶凝固后，拔出梳子，参加电泳缓冲Buffer。
〔7〕沉淀用200μL
1×
SDS上样缓冲液悬浮，煮3分钟，12000rpm离心5min，取上清。
〔8〕按顺序上样，同时上标准相对分子质量的蛋白质样品。
上样顺序为:
Marker〔5μL〕，样品〔15μL〕，Marker，样品。
〔9〕开始电泳时用80V，待样品全部进入胶后增大到160V。
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