第三章病毒的增殖Word文档格式.docx
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就某些病毒来说，胞膜也是病毒感染末期病毒子脱离细胞的最后一个屏障。
但在另一些病毒，例如大多数带有囊膜的病毒，胞膜都是病毒生物合成的一个最后阶段：
病毒子在胞膜上出芽成熟，已经改变了的胞膜成分变为病毒子的组成部分。
二、胞浆
胞浆是病毒成分的重要合成部位。
病毒蛋白质的合成以及绝大多数RNA病毒核酸复制，发生于胞浆内。
于DNA病毒，痘病毒的DNA也在胞浆内合成，痘病毒甚至可在去核细胞内合成病毒DNA和病毒蛋白质。
病毒子的装配也多数在胞浆内进行。
某些病毒还在胞浆内形成包涵体。
胞浆内含有的许多细胞器，在病毒增殖过程中起着一些重要作用如下：
1．线粒体：
线粒体参与细胞的能量代谢活动和蛋白质合成。
在病毒增殖过程中，线粒体可能是一个供能机构。
2．高尔基氏体：
高尔基氏体与细胞内物质的储存、聚集和转运有关。
参与细胞分泌颗粒、初级溶酶体等的形成，并可能与糖蛋白和粘多糖的合成有关。
3．核糖体：
许多核糖体由mRNA多核苷酸链连接起来，形成聚核蛋白体，成为细胞合成蛋白质的主要场所。
病毒多肽链也可能都是在核蛋白体上合成的，即使是在细胞核内增殖的病毒，例如腺病毒和疱疹病毒等。
4．溶酶体：
在某些病毒的感染过程中，病毒子被吞（饮）入细胞，存在于吞饮泡内，由于溶酶体与吞饮泡的膜融合，酶类释出，使病毒子降解，从而有助于病毒脱壳和释出核酸。
另外，在某些病毒感染时，溶酶体膜的通透性增高，溶酶体酶渗出于胞浆内，引起细胞自溶，这可能是病毒感染中细胞死亡的一个原因。
5．胞核：
许多病毒，包括大多数DNA病毒和少数RNA病毒，在胞核内合成核酸，与胞浆糖体上形成并转运到胞核内的病毒蛋白质装配成核衣壳。
某些病毒，例如疱疹病毒，再在核膜上出芽时获得囊膜。
这些在胞核内增殖的病毒还常在感染细胞核内形成包涵体。
流感病毒的RNA和病毒蛋白质看来都在胞核内合成，并迅速结合成螺旋样病毒核蛋白。
第二节病毒的增殖过程
动物病毒的增殖过程大致为：
病毒吸附于易感细胞表面；
穿入细胞内；
脱去衣壳和暴露核酸；
转录信使RNA、转译衣壳蛋白和复制子代核酸等一系列生物合成；
子代核酸和衣壳装配在一起，有时还要加一层囊膜才能达到成熟阶段；
最后从宿主细胞释放出来。
这些过程有些是同时进行的，有些是交叉进行的，不能截然分开。
据此，病毒增殖过程可分为吸附、侵入与脱壳、病毒成分的合成及装配与释放4个主要阶段，也有人分为6个阶段。
病毒的吸附、侵入和脱壳是病毒感染宿主细胞的开始阶段，即早期感染阶段。
吸附是对所有病毒均适合的术语，表示细胞和病毒的最初接触，而侵入和脱壳，则因各类动物病毒进入细胞时所发生的现象不同，是个不恰当的术语，有一种从未能证明过的积极主动的过程。
相反，病毒吸附后没有更多的活动，侵入是病毒表面和细胞表面受体间的物理—化学互补作用的结果。
病毒的侵入，意味着开始了病毒感染的细胞内阶段，在细胞膜的胞质侧面出现了病毒核酸或功能性病毒核蛋白。
虽然，有些病毒几乎整个病毒体必需穿过胞质膜而引起感染，但绝大多数病毒只需要一个病毒组成部分或单独的核酸进入。
例如有的病毒其完整的病毒子进入细胞质，可能并不导致有效的感染，反而使自身被消化。
多数情况下，病毒侵入与脱壳同时进行，而释放出核酸或功能性核蛋白。
在病毒脱壳后，再不能从感染细胞检出具有传染性的病毒，在电镜下也不能看到病毒子，直到新的子代病毒出现。
故将从脱壳开始直到子代病毒出现，这一阶段称为隐蔽期，这一期内主要进行着病毒成分的合成和装配。
一、病毒的吸附
（一）吸附过程
般认为病毒对宿主细胞的吸附可分为二个阶段。
1•第一阶段：
病毒最初的吸附呈可逆性结合状态，这种结合可发生在0〜37C的温
度范围内，而且似乎没有严格的特异性，是细胞和病毒子之间靠静电吸引而结合，故又称静电结合。
实验证明，动物病毒可与带电荷的表面，例如硅酸凝胶、磷酸钙凝胶和处理的纤维素结合，甚至还可与玻璃或金属器皿的表面相结合。
被抗体中和的病毒，也同样能够非特异地吸附细胞。
这种结合不仅取决于当时细胞和病毒子的浓度及其相互比率，而且也受周围物质的种类以及阳离子的离子强度和pH等条件的影响。
细胞和病毒在相当宽的pH范围内带负电荷，出现相互排斥现象，因此必须依靠阳离子以降低负电荷，促进吸引作用。
通常钙镁离子的效果最好，有的则单价阳离子促使其最高限度的吸附，如脊髓灰质炎病毒、新城疫病毒、流感病毒、腺病毒等。
病毒与细胞间的相互作用最适宜的pH幅度，可能相
当窄，有的则较宽。
例如B4型柯萨基病毒在pH3.0〜3.5与Hela细胞吸附最好，腺病毒7型在pH5.5〜8.5时最能吸附在红细胞上。
但从许多病毒和细胞配对来看，其相互作用的pH范围颇不一致，有的要求不严，有时却很苛刻。
这种静电结合结合的最有效例子是，霍乱弧菌的神经氨酸酶即受体破坏酶，可从细胞表面排除带负电的N-乙酰神经氨酸，以降低对流感病毒的亲和力。
静电结合，固然静电键是重要的。
然而，离子是否起盐桥的作用，还是在病毒与细胞间起着协助病毒或细胞糖蛋白上的蛋白或糖获得校正的互补作用，尚不清楚。
2．第二阶段：
呈不可逆结合状态。
这种结合具有温依性，结合程度与温度高低在一定范围内成正比，是病毒与细胞间的特异性结合，实质上就是病毒子与细胞膜上的特异的
病毒受体，即病毒子的蛋白质与细胞受体蛋白质的互补性结合，又称特异性结合。
应用抗细胞血清处理细胞，常可阻止细胞发生病毒感染，可能是封闭了细胞表面的结合部位而使病毒不能吸附的缘故。
相反，抗病毒抗体也可阻抑病毒对细胞的特异性吸附。
必须指出，可逆与不可逆的两阶段吸附过程，可能并非所有病毒的共同规律，某些病毒一旦吸附于敏感细胞，就再不能解脱，似乎没有可逆吸附阶段的存在。
（二）病毒的吸附频率各种病毒和其宿主细胞间相互作用的速度，差别很大。
例如有囊膜的披盖病毒实际上一接触时就完全被吸附到宿主的单层细胞上。
西方型马脑炎病毒在鸡胚成纤维细胞上，30分钟内的吸附率达85%。
无囊膜的二十面体病毒，如脊髓灰质炎病毒和腺病毒，在低温中吸附，其吸附比率较低，而许多有囊膜的病毒在低温中吸附似乎还是良好的。
当脊髓灰质炎病毒-Hela细胞的复合物被加温时，常出现最初联结的随机离解。
所有这些结果——速度、病毒结合的不同牢固度和温度的影响——都说明病毒和细胞开始的静电结合，其稳定性需要病毒体对细胞多价吸附。
病毒与细胞的结全，可能是在大约103〜104次相互碰撞中，有一次在培养液中离子作
用的协助下，使病毒子上某一点和细胞表面一点引起物理上的互补结合。
（三）病毒与细胞吸附的机构
1．病毒的吸附机构：
病毒的吸附机构，可能是特殊性病毒蛋白的伸展。
大多数有囊膜的病毒其囊膜上的糖蛋白纤突是吸附机构，如正粘和副粘病毒、弹状病毒、披膜病毒、冠状病毒以及嵌沙病毒含有这样的纤突；
而有些有囊膜的病毒，如痘病毒和疱疹病毒，缺
乏可见的纤突，可能由于太短，在电镜下难以辨别。
对于无囊膜的病毒子其吸附机构可能是病毒伸展的蛋白纤维，或病毒结合点可能是病毒子表面个别的结构蛋白，或几个镶嵌的衣壳蛋白，如腺病毒二十面体颗粒的每个顶角壳粒伸出末端呈小球状的纤维，是由二或三种相同的线状聚合多肽加上一个可能是不同多肽的球状蛋白末端组成，这种病毒子对细胞的牢固结合，推测需要同一病毒子上的几个纤维协同结合于细胞膜的受体上。
而没有突起的病毒，对细胞的吸附，是一个推测中的问题。
如小RNA病毒，吸附机构可能是衣壳上的某种多肽，从疏松结合的颗粒转变到紧密结合，可能是包含在膜内移动，导致多于一个的结合点接触于适当的表面结构。
Crowell对小RNA病毒研究认为，衣壳是由分子量不同的VPi、VP2、VP3和VP4四
种多肽组成，前三者主要形成衣壳的外层，VP4界于外层与核酸之间。
前三者各自形成片
层结构，并在顶角形成25?
深度的“峡谷”（Canyan），与相应受体互补，称之为病毒吸附部位（VirionAttachmentSite,VAS），参与该部位组成的病毒多肽（Virinpolypeptide,
VP）即病毒吸附蛋白（VirionAttachmentProtein,VAP），又由于组成"
峡谷”的三种
多肽位置的不同，而VP2常以五聚体形式位于顶角，故认为VP2与该病毒的VAP有关。
VAS不仅与吸附有关，还与病毒核酸的释放有关。
用3mol/L尿素（pH9）于37C处理CVB3
（柯萨基病毒3型），最先丢失VP4使病毒子变成“A”颗粒，而“A”颗粒丢失VP2后则变成“B”颗粒并释放RNA。
这与受体作用下的隐蔽期内病毒颗粒发生的改变是一致的。
由此可见，VAS与病毒子的解聚密切相关。
2．病毒受体：
病毒受体是指细胞膜上能识别VAS，并与VAS结合的结构。
（1）病毒受体的形成从进化论的观点来看，由于病毒长期适应于细胞内寄生，使
其逐渐具备了对细胞膜上某些固有成分的相应结合机构。
这样，细胞的这些成分就成了病毒吸附的对象——受体。
（2）病毒受体的结构近年来，由于对VAS研究的深入，Rossman假设了这样一种
病毒受体，它具有五重对称，突出于细胞膜，能与VAS的“峡谷”形成紧密结合。
这种假设已从分离到的病毒受体得到了证实。
如CVB的受体为50KD的糖蛋白，人类鼻病毒（HRV）的受体为90KD的糖蛋白，二者均为聚合形成具有五重对称的五聚体。
受体在细胞表面的分布是多拷贝的，多数病毒在每个易感染细胞上大约有104-5个受体，这也说明病毒与细胞的接合是多价的。
（3）病毒受体的化学性质病毒受体的化学本质大多数是糖蛋白，偶尔也有的是糖
脂，还有些是单纯蛋白。
例如鼠肝炎病毒、鼻病毒、腺病毒的受体是糖蛋白，仙台病毒的受体是一种神经节苷酯，水泡性口炎病毒的受体是一种糖脂，多瘤病毒的受体是单纯的蛋白质。
另外有些病毒的受体是与细胞功能密切相关的。
例如狂犬病毒受体为神经细胞上的乙酰胆碱受体，EB病毒受体为B细胞表面的C3受体，牛痘病毒受体为表皮生长因子受体。
（4）病毒受体的特异性病毒吸附到宿主细胞特异的受体上，其识别机制大致可分
三类：
即①自身一自身（self-self）；
②锁一钥匙（lock-key）；
③连接子介导（Linker）。
受体的特异性主要表现在种系特异性，组织特异性，病毒特异性，致病作用特异性四个方面。
而许多情况下，受体特异性就决定了病毒的宿主范围和病毒嗜性（组织嗜性和细胞嗜性）。
还值得一提的是有些细胞虽然有病毒受体，但对该病毒仍然是不易感的。
这说明，细
胞上存在着某一病毒的受体是否一定会造成该细胞的感染还决定于其它一些因素。
如细胞缺乏翻译该病毒信息的能力。
病毒受体除作为病毒吸附部位以外，还可能有促进病毒感染的作用。
当病毒与受体结
合后，病毒核衣壳的结构单位发生改变。
由于易受细胞蛋白质的作用而可能有利于病毒的脱壳。
3•影响病毒与受体结合的因素：
病毒与受体间的结合，主要靠一些非共价键起作用，
包括静电引力、范德华力、氢键、离子键等。
其中起主要作用的力是静电引力，因而电荷是病毒与受体反应的主要影响因素。
根据Lonberg-Holm和Joklik研究结果，病毒与受体反应，可用数学公式：
也ektcVo
描述，其Vo、Vt为游离病毒在0和t分钟时的浓度，k为吸附常数，t是单位时间（分钟），C是细胞浓度。
由此可见，病毒与受体反应可受以下几个方面的因素影响。
（1）受体方面的因素
1细胞浓度。
每个细胞上病毒受体的数量是相对稳定的，多在104-5个。
根据
Lonberg-Holm的实验结果，细胞浓度多选择在5xio7/ml为宜。
2细胞生长时相。
Morishima等在实验中发现，快速生长期细胞对病毒的吸附率是非分裂期细胞的10倍，且受体的表达还受到外界因素刺激的调节。
（2）病毒方面的因素
①病毒颗粒的浓度。
一旦宿主细胞数目确定后，则病毒受体数也就相对固定下来，因
而病毒只能在受体数目范围内发生反应。
病毒子的浓度以5xio11/ml为宜，这样便可为每
个细胞提供104个病毒子，以利其充分结合。
②各种病毒抑制剂。
抑制剂的存在与否，也可影响病毒与受体的反应。
如中和抗体的
存在，则可明显抑制VAS与受体的结合；
或者用蛋白水解酶处理病毒，则会破坏VAS结构，使之失去与受体结合的能力。
（3）其它因素主要是指环境因子。
1温度。
温度过高或过低均不利于病毒与受体的结合。
2酸碱度。
不同病毒对酸碱度的要求不同，而最适pH的范围一般在pH4.0〜8.5。
3离子的种类和浓度。
一些阳离子（如Ca++、Mg++）对病毒与受体反应有促进作用。
4环境的粘滞度及巯基化合物的存在与否，都可能影响病毒与受体反应。
4．病毒受体的研究方法：
病毒受体研究同其它受体研究一样，常用饱和分析法、竞争分析法。
研究中必需具备一个特异性强、亲和力高的探针。
这个探针可以是高纯度的病毒成分，也可能是与受体结合的抗体。
这里的抗体包括抗受体的抗体和抗配体抗体的抗独特型抗体（Anti-IdiotypicAntibody,Ab2），其中某些Ab2具有模拟抗原的作用。
研究病毒与受体的结合、病毒的纯化要求较高的条件，还涉及到病毒的亲和力、稳定性及适用性。
而受体的提取则更困难一些。
一则宿主细胞成分复杂，二是缺乏理想的溶剂，它既要使受体从细胞上解离下来，而又不破坏其生物学活性，三是缺乏良好的可溶性受体的鉴定方法。
这些阻碍了病毒受体研究的进展。
现行病毒受体探针制备方法如下：
1）抗细胞血清Axler和Crowell等用Hela细胞免疫家兔，经吸收试验后，成功
地分离到了针对CVB（柯萨奇病毒）受体的特异性抗体，并用该抗体阻断了CVB对Hela
细胞的吸附。
还可利用这种抗体做各种标记，以进一步研究细胞上受体的情况。
（2）抗受体法虽然受体提取很困难，但也有不少学者在不断探索。
Mapoles通过病毒-受体复合物，建立了提取受体的方法。
因此，可通过制备抗受体抗体，并以此作为研究受体的高度特异性、高度亲和力的探针。
而且还可以通过杂交瘤技术获得单克隆抗体，这不仅可使特异性增强，还可长期稳定获得均一的抗体。
（3）抗病毒抗体的抗独特型抗体法由于抗独特型抗体的分子模拟作用为受体研究闯出了一条新路，加上病毒衣壳蛋白相对容易纯化，有些学者采用抗病毒抗体的独特型抗体来研究病毒受体。
Nepom等1982年用此方法研究了哺乳动物呼肠孤病毒受体，Ardman等1985年也用该法研究了白血病病毒受体，均获得成功。
（4）分子克隆及多肽合成技术通过对VAP（病毒吸附蛋白）的分子生物学研究，
可用分子克隆及多肽合成技术，制备出高度特异的VAP，也可作为研究病毒受体的极好探
针。
5．研究病毒受体的意义：
归纳起来有以下几个方面的意义。
（1）不仅能阐明病毒感
染时的宿主范围、组织或细胞嗜性，而且可从分子水平阐明病毒的吸附机理和传播方式，这无疑对阐明病毒的致病机理奠定了分子基础；
（2）依据病毒受体可对病毒进行分类；
（3）在病毒性疾病的预防上，为疫苗的生产提供依据。
通过揭示病毒VAS（病毒吸附部位）的特殊组成和结构，以便制备更有效的疫苗、亚单位疫苗或分子疫苗，并考虑针对病毒受体
的特异性免疫，为受体疫苗开辟新的途径；
4）指导设计抗病毒的新型药物。
二、病毒的侵入与脱壳病毒子一旦牢固地结合到敏感细胞表面以后，感染的第二步是部分或全部的病毒子侵入细胞内，并且开始合成病毒的特异性蛋白或mRNA。
动物、植物和细菌的细胞被病毒感染的方式各有其特殊性，因为它们的细胞壁本质各不相同。
植物细胞有纤维素组成的坚硬细胞壁，病毒必须将细胞壁损伤后才能侵入。
细菌有一层不太坚实的细胞壁，一部分噬菌体（双股DNA）依靠尾端的溶菌酶将细菌细胞壁溶一小孔，将尾管刺入，注入头部的核酸，而衣壳留在外面。
动物细胞没有细胞壁，病毒的侵入与植物和细菌病毒不同。
对于多数病毒来说，侵入和脱壳两个步骤同时进行，对于动物病毒其侵入和脱壳过程如下。
（一）侵入
是指吸附于细胞上的病毒粒子部分或全部进入细胞内的过程。
1．吞饮作用：
无囊膜的病毒多采用这一方式侵入细胞，或称为“病毒胞吞饮作用
（Viropexis）”，其过程可能与吞噬现象相似。
这可能是吸附病毒的那一部分细胞膜与邻近细胞膜部分之间出现了电位差，ATP酶活化，致使细胞膜发生折叠，吞陷病毒粒子，形成吞饮泡而向细胞浆内转移。
2．膜融合作用：
这是有囊膜的病毒侵入的主要方式。
是病毒的脂蛋白囊膜与细胞膜吸附结合，结果病毒囊膜与细胞膜发生融合，使裸露的核衣壳直接侵入胞浆。
3．直接侵入：
某些无囊膜的病毒，吸附于细胞受体后不形成吞饮泡而直接穿越细胞膜到达细胞浆。
4．裸露的核酸或核蛋白侵入：
病毒粒子与细胞膜上的受体结合，由细胞表面的酶类作用，使衣壳开始解体，随后病毒核酸被吞噬或直接通过细胞膜而进入细胞内。
残留的衣壳成分继续附着于细胞上，可能抑制其它病毒粒子的吸附。
（二）脱壳病毒的脱壳，包括脱囊膜和脱衣壳两个过程。
在没有囊膜的病毒，则只有脱衣壳的过程。
1．脱囊膜：
多数囊膜病毒在侵入细胞的同时，通过膜融合作用脱囊膜，而将核衣壳释放入细胞浆内，如副粘病毒、疱疹病毒等。
而痘病毒的囊膜则在吞饮泡内脱落，吞饮泡裂解，释放核芯于胞浆内。
另外还发现，吞饮泡内的病毒粒子可能通过吞饮泡与溶酶体的融合而转入溶酶体内，在溶酶体内部酸性反应的启动下，病毒囊膜与溶酶体膜融合。
这一融合过程的发生极为迅速，以致核衣壳还来不及被溶酶体内的水解酶所破坏，而即被排挤到细胞浆中。
2．脱衣壳：
就是衣壳的脱落和核酸逸出的过程，除个别病毒的脱壳是在细胞表面发
生外（如肠道病毒），多数病毒的脱壳主要发生在细胞浆或细胞核内，吞饮泡和溶酶体可能
起着将完整核衣壳送入这些部位的作用。
也有人认为，核衣壳的裂解也发生在吞饮泡中，这种说法尚待进一步证实。
因在吞饮泡内存在着由溶酶体分泌的高浓度的水解酶，包括核酸酶，病毒核酸在此种环境下可能迅速被灭活。
病毒脱壳必须有酶的参与。
脱囊膜过程主要依靠水解酶的作用，脱衣壳过程则需借助病毒特异的“脱壳酶”。
这些酶主要来自细胞，但其形成和特异性，可能接受病毒遗传信息的命令或影响。
三、病毒成分的合成病毒脱壳后，再不能从感染细胞内（上）发现病毒粒子。
从侵入的病毒粒子消失开始，到新的子代病毒粒子出现为止，这一段时间称为“隐蔽期”（晦暗期）。
隐蔽期的长短随病毒种类而不同。
痘苗病毒为10小时，脊髓灰质炎病毒为2〜4小时。
“隐蔽期”实际上是
病毒增殖过程中最主要的阶段。
此时，病毒的遗传信息向细胞传达，细胞在病毒遗传信息的控制下合成病毒的各种组成成分及其所需的酶类，包括病毒核酸转录或复制时所需的聚合酶。
最后是由新合成的病毒成分装配成完整的病毒粒子。
病毒核酸自衣壳内脱出之后，必然迅速与细胞成分结合，因为只有这样，才有可能发生随后一系列的信息传递和生物合成过程。
已有证据，RNA病毒的RNA分子在由病毒粒
子或核衣壳内释出后，迅速与细胞蛋白质结合而形成所谓的信息体（informosome），病
毒RNA从而可以直接利用细胞器，并避免细胞内核酸酶的分解作用。
但也有人认为，这种信息体只是提取过程中的人为结构，并不真正出现于细胞内的病毒感染过程中。
关于病毒核酸转录和复制的聚合酶（转录酶和复制酶）可能由病毒编码，但也可能由病毒诱导而由宿主细胞编码。
如痘病毒、正粘病毒、副粘病毒、弹状病毒、呼肠孤病毒和反录病毒等的病毒粒子内，本身就含有聚合酶或者结合有聚合酶，其他病毒则似乎依靠细胞的聚合酶。
一）病毒成分的合成过程
病毒核酸的复制和病毒蛋白质的合成，可以人为地分为下列几个连续阶段。
1．mRNA的转录：
是以病毒的核酸为模板来合成mRNA的过程。
对于DNA病毒，
这一过程由依赖DNA的RNA聚合酶所催化；
对于RNA病毒，双链RNA病毒和部分单链RNA病毒也呈这种转录方式，由依赖于RNA的RNA聚合酶所催化，某些单链RNA病毒，病毒RNA可以直接转化为mRNA或者是病毒RNA直接呈现mRNA的作用，如脊髓灰质炎病毒。
多数病毒的mRNA还须经过加工，如在5-端连上“帽”结构和在3-端加上聚腺嘌呤核苷酸（poly-A）等以后，才能呈现功能。
腺病毒和SV40的基因还有外显子（Exon）和内含子（Intron）之分，转录后有剪接过程，将内含子剪除，将外显子连接起来，使mRNA产生功能。
DNA病毒的转录过程大多发生于细胞核内，mRNA在经过加工后离开胞核，并结合于胞浆内的核蛋白体上。
但痘病毒在胞浆内增殖，病毒粒子内含有转录酶和ploy（A）聚
合酶，由DNA转录的mRNA随即附着于核蛋白体。
乳多空病毒和腺病毒的DNA可与宿主细胞的DNA整合，随后由整合的DNA长链转录产生一个连续性的“杂交”RNA分子，后者再行分裂。
2．mRNAR的译制（
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