乳品检验实用技术Word文档格式.docx
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抗生素阴性抗生素阳性↓
↓报告
报告
操作步骤
菌液制备：
将菌种移种脱脂乳经36±
1℃、15h培养后，以灭菌脱脂乳1:
1稀释待用。
取检样9ml，置15×
150mm试管，80℃水浴加热5min，冷却37℃以下，加菌液1ml，36±
1℃水浴培养2h，加TTC0.3ml，36±
1℃水浴培养30min，观察，如为阳性，再水浴培养30min做第二次观察。
每份检样做二份，另外再做阴性、阳性对照各一份，阳性对照管用无抗生素的乳8ml加抗生素及菌液和TTC。
阻性对照管用无抗生素9ml加菌液和TTC。
判断方法
准确培养30min，观察结果，如为阳性，再继续培养30min做第二次观察。
在观察时要迅速，避免光照过久干扰，乳中有抗生素存在，则在向检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂TTC不过原，所以不显色。
与此相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖，TTC被还原而显示红色，也就是说检样呈样呈乳的原色时为阳性，成红色时为阴性。
表4显色状态标准判断
显色状态
判断
未显色者
阳性
微红色者
可疑
桃色·
红色
阴性
表5检测各种抗生素的灵敏度
抗生素名称
最低检出量
毒霉素
0.004单位
链霉素
0.5单位
庆大霉素
0.4单位
卡那霉素
5单位
细菌总数及大肠菌群检验
按GB5408—85《消毒牛乳》附录B（补充件）执行。
六六六、滴滴涕检验
按GB5413—85中2.11条进行
汞的检验
按GB5413—85中2.10条进行
第十章微生物检验
第一节微生物实验室常识
一、 实验室规则
1.进入实验室要穿工作服，只带必要的文具和教材。
离开实验室前脱下工作服，要反折。
2.实验室内绝对禁止饮食、吸烟及把铅笔、纸片等含于口内。
3.凡具有传染性的培养物、带菌材料、动物、器具等，均需按要求处理，不得随便乱放或用水冲洗。
4.实验室内需保持安静、整洁。
每次实验完毕，所用物品均应放回原处，整理桌面。
5.微生物实验中一旦发生意外，如吸入菌液、划破皮肤、细菌污染实验台或地面等处时，应立即报告教师及时处理。
6.如打破实验器材时，应向指导教师报告，进行登记，未经许可，不得任意将实验室内任何物品携带出实验室外。
7.必须节约用水、电、酒精、染色液以及其他材料。
8.每次微生物实验后，需用体积分数20mL/L来苏液浸手或以肥皂洗手，再以清水冲洗。
切实检查水、电、煤气后，离开实验室。
二、设备和材料
实验室常用设备和材料有:
探子、采样器、试管、广口瓶、剪子、开罐器、温箱、冰箱、恒温水浴、天平、电炉、吸管、广口瓶或三角瓶500ml、玻璃珠、平皿、量筒、放大镜、菌落计数器、酒精灯、均质器、试管架、显微镜
三、 实验室意外事故的处理
1.火险：
立刻关闭电门、煤气门、，使用灭火器，沙土和湿布灭火，如系酒精、乙醚或汽油等着火，慎勿以水灭火。
衣服着火可就地或靠墙滚动。
2.破伤：
先除尽外物，用蒸馏水洗净，涂以碘酒或红汞，或雷弗诺尔（黄药水）或用双氧水冲洗伤口。
3.火伤：
可涂50ml/L鞣酸、20ml/L苦味酸或苦味酸铵苯甲酸丁酯油膏，或龙胆紫液等。
4.灼伤：
⑴强酸、溴、氯、磷或其它酸性化学药品所致的灼伤，先以大量清水洗涤，再用50mg/L重碳酸钠或50ml/L氨水溶液洗涤以中和之。
⑵强碱、氢氧化钠、金属钠、钾或其它碱性化学药品所致的灼伤，先以大量清水洗涤，再用50mg/L硼酸溶液或醋酸溶液洗涤以中和之。
⑶石碳酸灼伤以浓酒精洗涤。
⑷眼灼伤先以大量清水冲洗。
若碱以50mg/L硼酸溶液洗涤；
若酸以50mg/L重碳酸钠溶液洗涤，然后再滴入橄榄油或液体石蜡1－2滴以滋润之。
5.食入酸碱或腐蚀性物质
⑴食入酸立即以大量清水漱口，并服镁乳或牛乳等，勿服催吐药。
⑵食入碱立即以大量清水漱口，并服50ml/L醋酸、食醋、柠檬汁，或服油类或脂肪以皂化之。
⑶食入石碳酸或来苏，以体积分数为300－400ml/L的酒精漱口，并喝大量烧酒或500ml/L的酒精，再服用催吐剂使其吐出。
6.吸入菌液
⑴吸入非致病菌液，立即以大量清水漱口，再以1g/L的高锰酸钾溶溶漱口。
⑵吸入葡萄球菌，链球菌，肺炎球菌等，立即以大量热水漱口，再以消毒液0.2g/L米化芬，30ml/L过氧化氢或1g/L高锰酸钾溶液漱口。
⑶吸入白喉菌，经上法处理后，并注射1000单位的白喉抗毒素以预防患病。
吸入伤寒、霍乱、痢疾、布氏等菌液，经上法处理后，须注射疫苗及抗生素以预防患病。
第二节菌落总数测定
4.6.1菌落总数测定方法为：
GB4789.2－94
[概念]
菌落总数是指食品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度和时间、pH、需氧性质等），所得1ml（g）检样中所含菌落的总数。
本方法规定的培养条件下所得结果，只包括一群在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧的菌落总数。
菌落总数主要作为判定食品被污染程度的标志，也可以应用这一方法观察细菌在食品中繁殖的动态，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
[设备和材料]
1.温箱：
1℃
2.冰箱：
0～4℃
3. 恒温水浴：
46±
4. 天平。
5. 电炉。
6. 吸管。
7. 广口瓶或三角瓶：
容量为500ml。
8. 玻璃珠：
直径约5mm。
9. 平皿：
直径为90mm。
10.试管。
11.放大镜。
12.菌落计数器。
13.酒精灯。
14.均质器或乳钵。
15.试管架。
16.灭菌刀或剪子。
17.灭菌镊子。
[培养基和试剂]
1.营养琼脂培养基。
⑴成分：
蛋白胨 10g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
琼脂 15～20g
蒸馏水 1000ml
⑵制法：
将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入150g/L氢氧化钠溶液约2ml，校正pH至7.2～7.4。
加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化。
分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。
注：
此培养基可供一般细菌培养之用，可倾注平板或制成斜面。
如用于菌落计数，琼脂量为15g/L；
如作成平板或斜面，则应为20g/L。
2. 磷酸盐缓冲稀释液。
⑴储存液：
磷酸二氢钾34g
1mol/L氢氧化钠溶液 175ml
蒸馏水 825ml
pH7.2
先将磷酸盐溶解于500ml蒸馏水中，用1N氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000ml。
⑶稀释液：
取府存液1.25ml，用蒸馏水稀释至1000ml。
分装每瓶100ml或每管10ml，121℃高压灭菌15min。
3.生理盐水
质量分数8.5g/LNacl溶液。
4. 750ml/L的酒精。
取75ml950ml/L的乙醇，加水稀释至95ml。
[检验程序]
检 样
↓
作成几个适当倍数的稀释液
↓
选择2－3个适宜稀释度
──────────────
各以1ml分别加入灭菌平皿内
↓
每皿内加入适量营养琼脂
36±
1℃ 48±
2h
菌落计数
报 告
图4.6.1 菌落总数的检验程序
[操作步骤]
1.检样稀释及培养
⑴以无菌操作，将检样25g（或ml）剪碎放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成1:
10的均匀稀释液。
固体检样在加入稀释液后，最好置均质器中以8000－10000rpm的速度处理1分钟，做成1:
⑵用1ml灭菌吸管吸取1:
10稀释液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液），振摇试管混合均匀，作成
1:
100的稀释液。
⑶别取1ml灭菌吸管，按上项操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1支1ml灭菌吸管。
⑷根据食品卫生标准要求或对标本污染情况的估计，选择2－3个透宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移1ml稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。
⑸稀释液移入平皿后，应即时将凉至46℃营养琼脂培养基（可放置于46±
1℃水浴保温）注入平皿约15mL，并转动平皿使混合均匀。
同时将营养琼脂培养基倾入加有1mL稀释液的灭菌平皿内作空白对照。
⑹待琼脂凝固后，翻转平板，置36±
1℃温箱内培养。
2菌落计数方法、
作平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。
在记下各平板菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。
3菌落计数的报告
（1）、平板菌落数的选择
选取菌落数在30－300之间的平板作为菌落总数测定标准。
一个稀释度使用两个平板应两个平板平均数。
其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘２以代表全皿菌落数。
平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落；
如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。
（2）、 稀释度的选择
⑴应选择平均菌落数在30－300之间的稀释度。
乘以稀释倍数报告之（见表1例1）。
⑵若有两个稀释度，其生长的菌落数均在30－300之间，则视两者之比如何来决定。
若其比值≤2，应报告其平均数；
若≥2则报告其中较小的数字（见表1例2及3）。
⑶若所有释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。
（见表1例4）
⑷若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表2例5）
⑸若所有稀释度均无菌落生长，则以＜1乘以最低稀释倍数报告之（见表1例6）。
⑹若所有稀释度的平均菌落数均不在30－300之间，其中一部分大于300或小于30时，则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1例7）。
（3）、. 菌落数的报告
菌落数在100以内时，按其实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有数字后面的数值，以四舍五入方法计算。
为了缩短数字后面的零数，也可用10的指数来表示（见表4.6.2“报告方式”栏）。
表4.6.2稀释度选择及菌落数报告方式
例次
稀释液及菌落数
两稀释液之比
菌落总数
（个/g或ml）
报告方式
10-1
10-2
10-3
1
多不可计
164
20
－
16400
16000或1.6×
104
2
295
46
1.6
3750
38000或3.8×
10-4
271
60
2.2
27100
27000或2.7×
4
313
313000
313000或1.6×
105
5
27
11
270
270或2.7×
102
6
＜1X10
＜10
7
305
12
30500
31000或3.1×
第一节大肠菌群检验
[术语]
大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL（g）检样内大肠菌群最可能数（MPN）表示。
3.恒温水浴：
44.5±
0.5℃
4.天平。
5.显微镜。
6.均质器或乳钵。
7.平皿：
8.试管。
9.吸管。
10.广口瓶或三角瓶：
11.玻璃珠：
12.载玻片。
14.试管架。
[培养基及试剂]
1. 乳糖胆盐发酵管。
单料作用双料
蛋白胨 20g40g
猪胆盐（或牛、羊胆盐） 5gG＋抑制10g
乳糖 10g20g
0.4g/L溴甲酚紫水溶液 25mL50mL
蒸馏水 1000mL1000mL
pH7.4
将蛋白胨、胆盐及乳糖溶于水，校正pH、加入指示剂，分装每管10mL，并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
双料乳糖胆盐发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
2.伊红美兰琼脂平板。
⑴成分
蛋白胨 10g
乳糖 10g
磷酸氢二钾 5g
琼脂17g
20g/L伊红Ｙ溶液 20mL
6.5g/L美蓝溶液 10mL
蒸馏水 1000mL
pH7.1
将蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH，分装于烧瓶内，121℃高压灭菌15min备用。
临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至50～55℃，加入伊红和美蓝溶液，摇匀，倾注平板。
3.乳糖发酵管。
蛋白胨 20g
0.4g/L溴甲酚紫水溶液25mL
将蛋白胨及乳糖溶于水中，校正pH，加入指示剂，按检验要求分装30mL、10mL或3mL或并放入一个小倒管，115℃高压灭菌15min。
注①双料乳糖发酵管除蒸馏水外，其他成分加倍。
②30mL和10mL乳糖发酵管专供酱油及酱类检验用，3mL乳糖发酵管供大肠菌群证实试验用。
4.ＥＣ肉汤。
胰蛋白胨 20g
3号胆盐（或混合胆盐） 1.5g
乳糖 5g
磷酸氢二钾 4g
磷酸二氢钾1.5g
氯化钠5g
蒸馏水 1000mL
溶解后，分装有发酵倒管的试管中，121℃15min高压灭菌，最终pH为6.9±
0.2。
5.磷酸盐缓冲稀释液。
1mol/L氢氧化钠溶液175mL
蒸馏水825mL
pH7.2
先将磷酸盐溶解于500mL蒸馏水中，用1N氢氧化钠溶液校正pH后，再用蒸馏水稀释至1000mL。
取储存液1.25mL，用蒸馏水稀释至1000mL。
分装每瓶100mL或每管10mL，121℃高压灭菌15min。
6.生理盐水。
7.革兰氏染色液。
⑴结晶紫染色液：
结晶紫1g
950ml/L的乙醇20mL
10g/L草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。
⑵革兰氏碘液：
碘1g
碘化钾2g
蒸馏水300mL
将碘与碘化钾先进行混合，加入蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。
⑶沙黄复染液：
沙黄0.25g
950ml/L的乙醇10mL
蒸馏水90mL
将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。
⑷染色法：
①将涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染色液，染1min，水洗。
②滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。
③滴加95％乙醇脱色，约30s；
或将乙醇滴满整个涂片，立即倾去，再用乙醇滴满整个涂片，脱色10s。
④水洗，滴加复染液，复染1min，水洗，待干，镜检。
⑸结果：
革兰氏阳性菌呈紫色。
革兰氏阴性菌呈红色。
亦可用10g/L稀释石炭酸复红染色液作复染液，复染时间仅需10s。
[检验程序]
24±
h36±
36±
1℃18－24h
图4.7.1大肠菌群检验程序
1.检样稀释
⑴以无菌操作将检样25mL（或g）放于含有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内予置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成体积比1:
固体检样最好用均质器，以8000－10000r/min的速度处理1分钟，做成体积比为1:
⑵用1mL灭菌吸管，吸取体积比1:
10稀释液1mL，注入含9mL灭菌生理盐水或其他释释液的试管内，振摇试管混匀，作成体积比1:
⑶另取1mL灭菌吸管，按上项操作依次作10倍递增稀释液，每递增稀释液一次，换用1支1mL灭菌吸管。
⑷根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种3管。
2.乳糖发酵试验
将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1mL以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1mL及1mL以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。
每一释释度接种3管，置36±
1℃温箱内，培养24±
2小时，如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。
3.分离培养
将产气的发酵管分别转种在伊红美兰琼脂平板上，置36±
1℃温箱内，培养18－24小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。
4.证实试验
在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落1－2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，置36±
1℃温箱内培养24±
2小时，观察产气情况。
凡乳糖管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。
5. 报告
根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100mL（g）大肠菌群的MPN值。
[粪大肠菌群（faecalcoliform）]
1.用接种环将所有产气的乳糖胆盐发酵管培养物（见7.2）转种于ＥＣ肉汤管内，置44.5±
0.5℃水浴箱内（水浴箱内的水面应高于ＥＣ肉汤液面），培养24±
2小时，经培养后，如所有ＥＣ肉汤管均不产气，则可报告为阴性。
如有产气者，则将所有产气的ＥＣ肉汤管分别转种于伊红美兰琼脂平板上，置36±
1℃培养18－24小时，凡平板上有典型菌落者，则证实为粪大肠菌群阳性。
2. 结果报告
根据证实为粪大肠菌群的阳性管数，查MPN检索表即表4.7.1，报告第100mL（g）大肠菌群的MPN值。
表4.7.1大肠菌群最可能数（MPN）
续表
1.本表采用3个稀释度（1mL（g）、0.11mL（g）和0.01mL（g）），每稀释度3管。
2.表内所列检样量如改用10mL（g）、1mL（g）和0.1mL（g）时，表内数字相应降低10倍；
如改用0.1mL（g）、0.01mL（g）和0.001mL（g）时，则表内数字应相应增加10倍，其余可类推。
[大肠菌群的介绍]
大肠菌群是许多国家用于食品生产上质量鉴定的指标，采用MPN值（MaximumProbable Number），这是按一定方案检验结果，根据Mccrady及Hopkins等按概率论所求出的统计数值。
MPN是表示样品中活菌密度的估测。
我国采用样品三个稀释度各三管的乳糖发酵三步法。
根据各种可能检验结果，编制了相应的MPN检索表。
大肠菌群一般都是直接或间接来自于人畜粪便。
当粪便排出体外后，初期以典型大肠杆菌占优势，而两周后典型大肠杆菌在外界环境的影响下产生生理特性的变异。
在食品中检出大肠菌群，即表示食品曾受到人畜粪便的污染。
其中典型大肠杆菌说明粪便近期污染，其它菌属可能是粪便的陈旧污染。
大肠菌群在粪便中存在数量较大，食品中的粪便污染含量只要达到0.001mg/kg即可检出大肠菌群。
大肠菌群与肠道致病菌来源相同，且在一般条件下，大肠菌群在外界生存时间与主要肠道致病菌也是一致的，所以大肠菌群可作为肠道致病菌污染食品的指标菌。
近年来，有研究者提出将肠球菌也列为反映粪便污染指标菌。
因大肠菌群是嗜中温菌，在５℃以下，基本不能生长，因此它不适于低温食品，如冷冻饮品。
而用肠球菌，则可克服其不足点。
大肠菌群或大肠杆菌作为食品卫生质量的指标
1.粪便污染的指标细菌
早在1892年，沙尔丁格（Schardinger）氏首先提出用大肠杆菌作为水源中病原污染的指标菌的意见，因为大肠杆菌是存在于人和动物的肠道内的常见细菌。
一年后，1893年，赛马博耳德·
斯米思（Theoboldsmith）氏指出，大肠杆菌因普遍存在于肠道内，若在肠道以外的环境中发现，就可以认为这是由于人或动物的粪便污染所造成的。
从此就开始应用大肠杆菌作为水源中粪便污染的指标菌，一直沿用到现在。
大肠菌群包括大肠杆菌和产气肠细菌（Enterobacteraerogenes），和一些中间类型的细菌。
这群细菌是革兰氏阴性短杆菌。
能分解乳糖而产气。
大肠杆菌在人及动物肠道内生存，一般无病原性。
产气肠道菌也属于非病原性的细菌，经常在肠道内发现，可是它经常生活在植物体上，因此，产气肠细菌所显示粪便污染的指标特异性就不如大肠杆菌。
有人研究成人粪便中的大肠菌群的含量，发现每克粪便含有108－109个。
若水中发现有大肠菌群，即可证实已被粪便污染。
有粪便污染也就有可能有肠道病原菌存在。
根据这个理由，就可以认为这种含有大肠菌群的水供饮用是不安全的。
由此，目前为评定食品的卫生质
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