兔盲肠细菌宏基因组中β葡萄糖苷酶基因的分离与活性研究.docx

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兔盲肠细菌宏基因组中β葡萄糖苷酶基因的分离与活性研究

兔盲肠宏基因组中新型碱性β-葡萄糖苷酶基因的分离与活性研究

马振刚1………………………………..

（1.西南大学农业部蚕桑学重点实验室,重庆400716

2.重庆师范大学生命科学学院,重庆400047）

摘要：

采用宏基因组学方法提取兔盲肠内微生物总DNA，构建DNA文库，通过筛选培养基获得产β-葡萄糖苷酶的菌株，测序获得β-葡萄糖苷酶编码基因序列，并对此酶的酶学性质进行相关研究。

结果从兔盲肠内微生物宏基因中成功筛选获得一个β-葡萄糖苷酶基因片段nglu007，其ORF长180bp，编码60个氨基酸，NCBI预测其具有不完整的水解酶超家族保守结构域，氨基酸多重序列比对表明其具有Glu4活性位点与Tyr47底物结合位点，推测其属于糖苷水解酶Ⅰ家族中的新成员；酶活性质结果显示，该酶反应最适温度为50℃，最适pH为10.0，粗酶活为8.12U/mL；由于该酶在中性和碱性环境中保持较高的酶活力，具有作为碱性酶开发应用的潜力，在食品加工、棉织品生物整理、洗涤及废纸脱墨等工业中有一定的应用价值。

关键词：

总DNA；文库；新型β-葡萄糖苷酶；活性；应用

β-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷水解酶，它能催化水解芳香基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键生成葡萄糖[1]。

β-葡萄糖苷酶是Liebig和Wohler首次在苦杏仁中发现的，随后的研究证明它广泛分布于自然界，特别是植物的种子和微生物中尤为普遍[2]。

β-葡萄糖苷酶存在于许多动物、植物与细菌体内，能参与生物体的糖代谢，对维持生物体正常生理功能起着重要作用[3]。

另外，β-葡萄糖苷酶能将果、蔬、茶中的风味前体物质水解为具有浓郁天然风味的香气物质[2]，，能增加酒类和果汁产品中的风味物质含量，能使杏仁、青梅果等食品脱苦[4]，由此β-葡萄糖苷酶被广泛用于食品和饮料工业中；β-葡萄糖苷酶在工业上用于生产低聚龙胆糖[5]；值得关注的是β-葡萄糖苷酶作为纤维素降解酶系的主要组分之一，可以把纤维二糖和低分子量的纤维寡糖水解为葡萄糖，是纤维素酶解过程中的关键限速酶[6]，因此研究和开发新型高效的β-葡萄糖苷酶具有十分重要的意义。

由于自然界中β-葡萄糖苷酶含量少、活力低，使得自然界分离获得的β-葡萄糖苷酶不能高效应用于生产生活中；目前通过基因重组技术构建工程菌，分泌表达高活性β-葡萄糖苷酶成为解决这一难题的有效途径，因此获得高活性β-葡萄糖苷酶编码基因显得极为重要。

微生物基因资源非常丰富，在其中获得目的基因具有较高的可能性；但目前不可培养微生物却占据了微生物总量的90%以上[7]。

1985年，Pace等[8]首次绕过微生物培养阶段从环境中直接提取微生物群体基因组DNA，成功获得了大量未知微生物的信息。

随后，Schmidt[9]和Stein等[10]分别利用此方法对海水样品DNA的λ噬菌体文库和一种未知海洋古细菌进行了分析；这些研究使得研究者从未培养微生物资源中获得有用基因成为可能。

盲肠是家兔重要的消化器官，其中共生的微生物能产生纤维素酶降解食物粗纤维[11]，将其分解为挥发性脂肪酸，并在盲肠中吸收；因此兔盲肠微生物群落中可能蕴含着丰富的纤维素酶基因资源，本研究利用宏基因组学的方法，对兔盲肠内微生物总DNA进行提取与纯化，不完全酶切后构建文库，成功筛选到一株具有产β-葡萄糖苷酶能力的克隆菌株，测序获得了基因序列；同时对基因的大肠杆菌表达物粗酶活进行研究，获取了该酶的酶学特性。

1材料和方法

1.1.1材料

家兔饲养3个月左右，采集盲肠样品，将样品置于-80℃冰箱保存，备用。

1.1.2主要试剂仪器与培养基

DNAExtractionbuffer（含CTBA），10%SDS，100%无水乙醇，75%无水乙醇，氯仿：

异戊醇（24：

1），TRIS-饱和酚，3%PVPP，等均购自上海生工；TaqDNA聚合酶，ProtemaseK、pUC118、pMD18-T载体和细菌E.coli.JM109等均购自TaKaRa公司；DNA回收试剂盒购自OMEGA公司，基因组提取试剂盒购自北京鼎国公司，PCR引物由上海博亚公司合成。

PCR扩增仪为EppendorfMastercycler5331。

β-葡萄糖苷酶筛选培养基[12]：

蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl1g，七叶苷（Esculinhydrate）0.1g，柠檬酸高铁铵（Ammoniumiron（Ⅲ）critrate）0.25g，ddH2O100mL。

1.2实验方法

1.2.1菌体的收集

取出样品，37℃水浴溶化，将样品分装于六个灭菌的50mL离心管中，每管加入20mLpH7.4的磷酸缓冲液，摇床上振荡30min；2000rpm离心30min，收集上清，加入20mL的磷酸缓冲液重悬沉淀物质，摇床振荡30min；重复收集上清3次；合并上述步骤中所有的上清液，4000rpm离心5min去除沉淀，在上清中加入终浓度为3%的PVPP和终浓度为4mM的CaCl2，冰浴1h；2000rpm离心25min，收集上清；上清液再以8000rpm离心20min，收集菌体沉淀；反复用少量的缓冲液清洗菌体，去除有色可溶解性杂质直至缓冲液澄清为止；清洗完成后用缓冲液重悬菌体分装至10mL的离心管中。

1.2.2总DNA粗提

参照JulieA.H.等[13]的方法，提取样品总DNA，-20℃保存。

1.2.3总DNA的纯化

将粗提的基因组DNA分装于1.5mL离心管中，每管加入600μL的无菌水，根据分子克隆实验指南[14]中的酚-氯仿抽提法纯化粗提的总DNA。

1.2.4电洗脱纯化总DNA

上述总DNA经凝胶电泳，将含有目的条带的胶条转入无菌的50mL离心管中，4℃，0.5×TBE溶液中振荡平衡30min，反复平衡3次；将胶条装入透析袋内进行电洗脱：

首先4℃，0.5×TBEbuffer，100V电泳5h；然后将正负极反向电泳1-2min；将透析袋和胶条移至500mL0.5×TE溶液中，平衡2次，每次平衡时间为6-8h；最后将透析袋内的洗脱液收集于灭菌的离心管中，即得电洗脱回收的DNA[13]，电泳检测回收样品后，存于-20℃备用。

1.2.5基因组DNA酶切

酶切体系如下：

限制性内切酶Sau3AI0.05μL，宏基因组DNA6μL，10×HBuffer1μL，ddH2O3μL；37℃酶切30min。

电泳检测样品酶切效果，酶切产物存于-20℃备用。

1.2.6兔盲肠基因组DNAshotgun文库的构建

将限制性内切酶Sau3AI部分消化的基因组总DNA进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收长度为0.5kb~4.5kb左右的片段。

回收的DNA与用BamHI酶切并经CIAP去磷酸化处理的pUC118质粒连接，转化到大肠杆菌JM109菌株后建立其基因组shotgun文库。

1.2.7β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆的筛选

取文库菌液涂布于含氨苄青霉素的β-葡萄糖苷酶筛选培养基平板上，37℃培养36h~48h，菌落周围颜色出现黑色水解圈者为β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆[15]。

挑选阳性克隆，抽提其质粒DNA，进行测序分析。

1.2.8β-葡萄糖苷酶基因测序

提取β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆质粒DNA，送至大连宝生物工程有限公司（TaKaRa）进行核苷酸序列测定，将序列在美国国立生物技术信息中心（NCBI）上进行BLAST同源性检索，采用DNAMAN对基因进行核苷酸分析。

1.2.9β-葡萄糖苷酶酶活力的测定

将筛选到的β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆菌株接种于装有100mLLB培养基的1L三角瓶中，37℃,220rpm培养3-4d；12000rpm5min离心去除发酵液中的菌体，发酵上清液用于β-葡萄糖苷酶酶活力测定。

参照文献[16]中β-葡萄糖苷酶的酶活力测定，以七叶苷为底物测定其酶活力。

1酶活力单位（U）定义为一定温度下1min由底物生成1μmol葡萄糖所需的酶量。

2.结果与分析

2.1样品总DNA的抽提

样品经前处理后，进行总DNA的粗提、精提以及电洗脱纯化，0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测。

结果如图1所示，粗提DNA拖带比较严重，含有杂质过多，而经精提与纯化后的DNA纯度提高，纯化效果较好。

图1兔盲肠样品总DNA的琼脂糖凝胶电泳

M.λ-Ecot-14;a.粗提的总DNA;b.精提的总DNA,c.电洗脱纯化的总DNA;

Figure1TheAgrosegelelectrophoresisoftotalDNAfrommicrobeinRabbitcecum

M.λ-Ecot-14;a.RoughtotalDNA;b.FinetotalDNA;c.PurifiedtotalDNA;

2.2总DNA不完全酶切与pUC118载体的构建

纯化的总DNA经限制性内切酶Sau3AI不完全酶切（如图2），结果a泳道得到一条弥散的带，说明基因组不完全酶切效果良好；将片段回收，并与BamHI线性化的载体pUC118连接，转化至大肠杆菌感受态JM109中构建文库。

图2Sau3AI酶切消化的总DNA

M.λ-Ecot-14;a:

Sau3AI消化的总DNA

Figure2：

AgaroseGelElectrophoresisoftotalDNAbySau3AIDigestion

M.λ-Ecot-14;a.ProductionoftotalDNAbySau3AIDigestion

2.3宏基因组DNAshotgun文库分析

随机挑取白斑，提取质粒，检查重组质粒滞后效果，并以M13引物检测插入片段。

本研究从文库中挑取白色菌落240个，共获得阳性克隆197个，阳性率为82.1%，电泳检测部分质粒的滞后性如图3所示；同时选取54个质粒以M13为引物进行PCR扩增检测阳性克隆插入片段大小（如图4），结果显示PCR扩增产物DNA片段大小主要约为0.5~4.5kb。

图3宏基因组文库重组质粒电泳图

M.pUC118空质粒；M'.DNAmarkerλ-HindⅢdigestion;1-68.阳性重组质粒

Figure3Electrophoresisofrecombinantplasmidfromruminalmetagenomiclibrary

M.pUC118vector;M'.DNAmarkerλ-HindⅢdigestion;1-68.Positiveplasmidsfromlibrary

图4阳性克隆的PCR产物电泳图

M.λ-E.coilT-14;1-54.阳性克隆PCR产物

Figure4AgrosegelelectrophoresisofPCRproductsfrompositiveclones

M.λ-E.coilT-14;1-54.PCRproductsofpositiveclones；

2.4β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆的筛选

在基因组DNA文库中筛选到1株含有β-葡萄糖苷酶基因的阳性重组子PUCGL1。

经过多次七叶苷平板复筛，均能产生黑色的水解圈，水解圈与菌落直径比约为2:

1，水解圈直径为30mm（如图5）；故该阳性克隆插入片段能编码产生β-葡萄糖苷酶，将筛选获得的β-葡萄糖苷酶基因阳性克隆送出测序；将此菌株接种于LB培养基中，以37℃、220rpm的条件振荡培养3天，测得发酵上清粗酶活力为8.12U/mL。

图5克隆PUCGL1的β-葡萄糖苷酶酶活检测

Fig.5PUCGL1cloneexpressingβ-glucosidaseactivityscreenedontheLAplatecontaining0.1%Esculinand0.25%Ammoniumiron（Ⅲ）citrate

2.5β-葡萄糖苷酶阳性克隆测序分析

将-葡萄糖苷酶基因阳性克隆PUCGL1送于大连宝生物公司进行测序，测序结果显示外源DNA序列长459bp，预测片段中最大ORF全长为282bp，GC含量为60.3%；蛋白质序列分析表明，该酶蛋白的预测分子量MW为10545.90Da，等电点pI为5.30；NCBI在线BLASTP表明它具有不完整的水解酶超家族基序；其分子量远小于目前报道的-葡萄糖苷酶分子量40-250kDa，本实验证实其确实具有-葡萄糖苷酶活性，基于此推测外源片段基因不完整，只编码了-葡萄糖苷酶部分活性区域，对其基因分析详见讨论。

2.6β-葡萄糖苷酶酶活力性质分析

2.6.1β-葡萄糖苷酶最适反应温度与温度稳定性

在不同温度（30、40、50、60、70、80℃）下测定β-葡萄糖苷酶的活性以确定酶的最适反应温度；将粗酶液在不同温度（30、40、50、60、70、80℃）下保温1h后，立即在0℃冰浴中冷却，然后在标准条件下检测剩余酶活以了解酶的热稳定性。

结果如图6所示，该酶的最适反应温度为50℃，在70℃时仍保留50%左右的酶活力，证明该酶具有较强的温度耐受能力。

B

A

图6温度对-葡萄糖苷酶酶活力的影响A，酶最适反应温度曲线B，酶温度稳定性曲线

Fig6Effectsoftemperatureontheβ-glucosidaseactivityA,

2.6.2β-葡萄糖苷酶最适反应pH与pH稳定性

在不同pH值缓冲液中测定重组-葡萄糖苷酶的酶活，以确定酶作用的最适pH值；在不同pH的缓冲液中50℃保温30min，检测保留的酶活力以了解酶的pH稳定性。

结果如图7，该酶的最适pH值为10.0，并且其在pH4.0~11.0能保持较高酶活力，有较好的碱性环境耐受能力。

B

A

图7pH对-葡萄糖苷酶酶活力的影响A，酶最适反应pH曲线B，酶pH稳定性曲线

Fig7EffectsofpHontheβ-glucosidaseactivity

2.6.3不同金属离子对酶活力的影响

按上述反应温度50℃和pH7.0时，测定不同金属离子对酶活性的影响。

使用0.02mMpH7.0的柠檬酸缓冲液，溶解不同金属离子来配制金属离子缓冲溶液，以不加任何金属离子的酶反应体系为空白对照（相对酶活力为100%），确定各金属离子对酶活性抑制或激活作用。

结果见图7，Mg2+、Zn2+对该酶有较强的促进作用，Ca2+、Cu2+等对酶活力影响较小，而EDTA对该酶有较强的抑制作用（如图8）。

图8不同金属离子化合物对-葡萄糖苷酶酶活力的影响

Fig8Effectsofvariousmetallicionsandsomechemicalsontheβ-glucosidaseactivity

2.6.4酶的底物特异性

在标准条件下，用1％的不同底物（乳糖、麦芽糖、几丁质、滤纸、微晶纤维素、七叶苷、淀粉、CMCNa、蔗糖、脱脂棉）与酶液反应，并测定其酶活力。

结果见图9，该酶对乳糖和麦芽糖具有较高的酶活力，而同时能降解滤纸、几丁质及粉末纤维素，但是对于淀粉、脱脂棉及蔗糖无降解能力。

推测认为该酶作用底物的特异性不强，能够作用于连接基团不同的-葡萄糖苷键，与目前报道的-葡萄糖苷酶性质一致[17]。

图9不同底物对-葡萄糖苷酶酶活力的影响

Fig9Effectsofvarioussubstrateontheβ-glucosidaseactivity

3讨论

3.1总DNA的提取

将兔盲肠肠道内容物收集后，分离物中可能含有低量的腐植酸，多糖等杂质，这些低量存在杂质能强烈抑制酶切反应以及PCR扩增过程中酶的活力，从而影响酶切效果以及PCR扩增结果[18]；通过对不同总DNA提取方法获得的样品进行限制性内切酶不完全酶切（如图10），比较其酶切效果；结果显示采用试剂盒回收与酚-氯仿抽提法获得的基因组DNA酶切效果差，可能其中仍含有低量的腐植酸、多糖或有机溶剂，抑制了酶切反应中限制性内切酶的活力而使得基因组DNA不能被很好的消化；相比而言，采用电洗脱方法获取的基因组DNA纯度高且酶切效果更适于shotgun基因组文库的构建。

图10不同方法获得的总DNA经Sau3AⅠ不完全酶切效果图

（a,基因组提取试剂盒提取；b,酚氯仿抽提；c,PVPP-电洗脱提取）

3.2β-葡萄糖苷酶基因分析

本研究成功构建了一个约含9000个重组克隆、插入片段主要为0.5~4.5kb的小容量兔盲肠细菌总DNA文库，并从文库中成功筛选获得一株具有β-葡萄糖苷酶活性的阳性克隆菌株；测序后获得该克隆插入序列，其中最大ORF全长为282bp，编码93个氨基酸；NCBI在线BLAST同源性检索结果显示该片段第181-282位核苷酸序列与许多克隆载体片段序列相似度为100%，可能由于去载体序列不完全造成；因此，推测克隆得到的基因片段序列不完整，将其命名为nglu07，它的编码序列长度为180bp;nglu07预测氨基酸序列进行NCBI在线BLASTP分析，结果显示其具有一个不完整的水解酶超家族基序（如图11），与已报道的β-葡萄糖苷酶序列相似性较低，其序列分化较大，但是本研究结果表明它具有β-葡萄糖苷酶降解纤维二糖的活性，推测nglu07是纤维素酶家族中的新成员。

β-葡萄糖苷酶的分子量通常为40-250kDa，氨基酸序列长度在300aa以上[19,20,21]；本文中筛选获得了长度为180bp的nglu07，仅编码60个氨基酸残基，但其却具有较强的β-葡萄糖苷酶酶活力，可以将纤维二糖分解为单糖，据此我们推测其包含有β-葡萄糖苷酶活性区域部分。

本研究将nglu07氨基酸残基序列与已鉴定的糖苷水解酶Ⅰ家族中β-葡萄糖苷酶成员BGL27_ORYSJ、BGL28_ORYSJ、BGL29_ORYSJ的氨基酸残基序列进行多序列比对，根据已知序列的序列特征来预测nglu07可能的酶活性位点和底物结合位点（如图12）。

结果显示，nglu07氨基酸残基序列中存在与已知序列保守性一致的活性位点Glu4和底物结合位点Tyr47，具有二硫键形成位点Cys22与Cys27[22]，推测Glu4与Tyr47分别为nglu07的酶活性位点与底物结合位点，且蛋白能形成二硫键；多重序列比对也表明nglu07可能属于糖苷水解酶Ⅰ家族中的新成员。

由于nglu07序列不完整，所以对该基因家族具体分类很困难，需要进一步的实验数据。

图11阳性克隆外源片段分析

图12氨基酸多重序列比对（代表保守的结合位点，代表保守的活性位点，二硫键形成位点）

3.3碱性纤维素酶的应用

目前已报道的β-葡萄糖苷酶的pI大多数都在酸性范围，并且变化不大，最适pH大多在pH4.5-6.0之间[23];本研究中筛选得到的β-葡萄糖苷酶nglu07最适pH为10.0，在中性和碱性环境中仍具有较高的酶活力与稳定性，属于碱性纤维素酶。

碱性纤维素酶于20世纪70年代被发现，其最适pH值处于碱性范围；碱性纤维素酶具有水解细小织物纤维的能力，有助于清除附着在衣物上的一些顽固污渍，使衣服经过反复穿戴洗涤后仍可以保持柔软、亮丽；另外，碱性碱性纤维素酶一般不具有葡萄糖苷外切酶活性，不能作用于结晶纤维素,故棉麻织物经过反复洗涤后其强度和表观聚合度不会有明显的改变[24]，因此碱性纤维素酶经常被开发为洗涤剂用酶[25]；同时碱性纤维素酶也可以用于废纸脱墨[26],棉织品生物整理等工业中。

本研究分离获得的nglu07属于碱性纤维素酶，因此具有碱性酶开发应用的潜力，可作为碱性酶制剂用于食品与饮料生产中，在作为棉织品生物整理及洗涤工业中的纤维素酶制剂方面也具有重要的参考价值。

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