泌尿系统疾病动物模型.ppt

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第九章第九章泌尿和男性生殖系统疾病动物模型泌尿和男性生殖系统疾病动物模型1肾小球模式图肾小球模式图复习复习2正正常常肾肾小小球球复习复习3胶状铁实验胶状铁实验等电点等电点4.6滤过屏障滤过屏障模式图模式图复习复习4PASPAS染色染色复习复习5第一节第一节肾小球肾炎动物模型肾小球肾炎动物模型6肾小球肾炎（肾小球肾炎（glomerulonephritisglomerulonephritis）是一组以是一组以肾小球损害为主的疾病，病因、发病机制、病理肾小球损害为主的疾病，病因、发病机制、病理改变、病程和预后不尽相同，多数肾小球肾炎的改变、病程和预后不尽相同，多数肾小球肾炎的发病与免疫反应有关。

发病与免疫反应有关。

7与肾小球肾炎发病有关的抗原与肾小球肾炎发病有关的抗原肾小球性抗原肾小球性抗原（基膜、基膜、HeymannHeymann、Thy1Thy1）内源性内源性非肾小球性抗原非肾小球性抗原（核抗原、肿瘤抗原及甲状球蛋白核抗原、肿瘤抗原及甲状球蛋白）外源性外源性包括病原生物的成分、药物、外源性凝集素包括病原生物的成分、药物、外源性凝集素及及异种血清异种血清等等8发病机制发病机制n循环免疫复合物性肾炎：

循环免疫复合物性肾炎：

可溶性抗原抗体复合物在肾可溶性抗原抗体复合物在肾小球内沉积引起损伤；小球内沉积引起损伤；n原位免疫复合物性肾炎原位免疫复合物性肾炎：

抗体在肾小球内直接与抗原：

抗体在肾小球内直接与抗原发生反应形成原位免疫复合物引起损伤发生反应形成原位免疫复合物引起损伤9一、家兔一、家兔MasugiMasugi肾炎模型肾炎模型MasugiMasugi肾炎肾炎本模型属于抗肾小球基膜肾炎模型，本模型属于抗肾小球基膜肾炎模型，动物模型动物模型称马杉（称马杉（MasugiMasugi）肾炎（抗肾抗体性肾炎和肾毒血肾炎（抗肾抗体性肾炎和肾毒血清性肾炎）。

研究清性肾炎）。

研究增生性增生性肾小球肾炎的常用动物模肾小球肾炎的常用动物模型。

此型肾炎在人类肾炎中的比例不到型。

此型肾炎在人类肾炎中的比例不到5%5%。

抗原成抗原成分主要定位于基膜分主要定位于基膜型胶原型胶原33链羧基端非胶原区。

链羧基端非胶原区。

10区别区别n人类抗肾小球基膜肾炎由抗肾小球基膜的自身抗人类抗肾小球基膜肾炎由抗肾小球基膜的自身抗体引起体引起n马杉肾炎模型抗肾小球基膜抗体由外源性肾脏抗马杉肾炎模型抗肾小球基膜抗体由外源性肾脏抗原诱发原诱发11给动物外源性注入抗肾小球基膜抗体（抗肾血给动物外源性注入抗肾小球基膜抗体（抗肾血清），与肾小球基膜发生免疫反应而激发炎症。

清），与肾小球基膜发生免疫反应而激发炎症。

兔肾皮兔肾皮质匀浆质匀浆绵羊；绵羊；制备抗血清制备抗血清兔兔甲甲乙乙甲甲MasugiMasugi肾炎肾炎造模机制造模机制造模机制造模机制1222.5kg体重的家兔，性别不限；体重的家兔，性别不限；绵羊。

绵羊。

MasugiMasugi肾炎肾炎实验动物实验动物实验动物实验动物13.11.制备免疫原：

制备免疫原：

体重体重22kgkg左右家兔左右家兔放血处死放血处死,肾脏肾脏从肾动脉插入导管，用生理盐水从肾动脉插入导管，用生理盐水反复冲洗反复冲洗肾皮质肾皮质55gg研成匀浆研成匀浆与与弗氏完全佐剂弗氏完全佐剂充分混匀至充分混匀至1010mlml制成混悬液制成混悬液加生理盐水加生理盐水20mlMasugiMasugi肾炎肾炎操作步骤操作步骤操作步骤操作步骤142.2.制备羊抗兔抗肾血清：

制备羊抗兔抗肾血清：

皮下或肌肉内分皮下或肌肉内分5点点每点注射每点注射1ml，每每2周周1次，共次，共4次次加入经生理盐水洗涤加入经生理盐水洗涤3次的等量次的等量兔红细胞混匀，置于兔红细胞混匀，置于4过夜过夜给绵羊注射制备的混悬液给绵羊注射制备的混悬液末次注射后末次注射后22周采羊血分离血清周采羊血分离血清抗体纯化抗体纯化灭活备用灭活备用离心、吸取上清离心、吸取上清MasugiMasugi肾炎肾炎1533免疫家兔：

免疫家兔：

用上述抗肾血清给家兔用上述抗肾血清给家兔（体重体重222.52.5kgkg家兔家兔）静脉注射，每次静脉注射，每次1.5-21.5-2mlml，每每3030minmin注射注射11次，约次，约3-83-8次，次，数天后出现蛋白尿，说明模型形成。

数天后出现蛋白尿，说明模型形成。

MasugiMasugi肾炎肾炎16特点：

特点：

增殖性肾炎，病变多进行性加重，逐渐发展成肾小球硬化。

增殖性肾炎，病变多进行性加重，逐渐发展成肾小球硬化。

也可用大鼠制备也可用大鼠制备MasugiMasugi肾炎模型肾炎模型大鼠大鼠GBM（GBM（抗原抗原）免疫家兔免疫家兔制备兔抗血清抗鼠制备兔抗血清抗鼠GBMGBMMasugiMasugi肾炎肾炎给正常大鼠多次重复注射给正常大鼠多次重复注射17n尿蛋白；尿蛋白；n血肌酐及血尿素氮；血肌酐及血尿素氮；n病理形态学观察；病理形态学观察；n电镜、免疫荧光等。

电镜、免疫荧光等。

MasugiMasugi肾炎肾炎检测指标检测指标检测指标检测指标181连续静脉注射抗肾血清连续静脉注射抗肾血清35次后，家兔可出现蛋白尿。

次后，家兔可出现蛋白尿。

大多数动物于注射抗肾血清的第大多数动物于注射抗肾血清的第12天出现明显蛋白天出现明显蛋白尿和管型尿。

尿和管型尿。

2光镜检查可见呈光镜检查可见呈急性、亚急性（以形成新月体、环急性、亚急性（以形成新月体、环状体为主）或慢性（纤维化为主）的状体为主）或慢性（纤维化为主）的肾小球肾炎病肾小球肾炎病变。

免疫荧光检查发现，沿基膜有特征性连续线状变。

免疫荧光检查发现，沿基膜有特征性连续线状IgG沉着，绝大多数有沉着，绝大多数有C3同时存在。

同时存在。

MasugiMasugi肾炎肾炎结结结结果果果果19肾脏组织病理学检查肾脏组织病理学检查在光学显微镜下，每只动物各选在光学显微镜下，每只动物各选3030个最大切面个最大切面的肾小球，测量肾小球直径、截面积并计数细胞的肾小球，测量肾小球直径、截面积并计数细胞数，计算肾小球体积。

数，计算肾小球体积。

MasugiMasugi肾炎肾炎20注射抗肾血清的第注射抗肾血清的第1012天后天后出现明显蛋白尿和管型出现明显蛋白尿和管型n注射后注射后1010天天急性改变，肾小球肿大，渗出性变化；急性改变，肾小球肿大，渗出性变化；n注射后注射后2020天天急进性改变，出现新月体或环状体；急进性改变，出现新月体或环状体；n注射后注射后40406060天天慢性改变，肾小球纤维化。

慢性改变，肾小球纤维化。

MasugiMasugi肾炎肾炎病病病病变变变变21急性弥漫增生性肾小球肾炎急性弥漫增生性肾小球肾炎22弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎23弥漫性新月体性肾小球肾炎弥漫性新月体性肾小球肾炎24弥漫性新月体性肾小球肾炎弥漫性新月体性肾小球肾炎25慢性硬化性肾小球肾炎慢性硬化性肾小球肾炎26慢性硬化性肾小球肾炎慢性硬化性肾小球肾炎27原位免疫复合物形成模式图原位免疫复合物形成模式图28抗肾小球基膜肾炎抗肾小球基膜肾炎29分型分型n主动型：

主动型：

主动免疫。

主动免疫。

用自体或同种动物肾皮质匀浆用自体或同种动物肾皮质匀浆（含近端小管刷状缘成分）（含近端小管刷状缘成分）与弗氏佐剂混合后给同种动物与弗氏佐剂混合后给同种动物腹腔注射而引起腹腔注射而引起n被动型：

被动型：

被动免疫，直接注射抗体。

被动免疫，直接注射抗体。

给动物注射给动物注射抗近端小管刷状缘抗原（抗近端小管刷状缘抗原（FxlAFxlA）的抗体而制成）的抗体而制成二、大鼠二、大鼠HeymannHeymann肾炎模型肾炎模型30HeymannHeymann肾炎的近端小管刷状缘肾炎的近端小管刷状缘抗原抗原是一种分子是一种分子量为量为33kD33kD的糖蛋白，的糖蛋白，又称又称megalinmegalin。

该抗原不仅存在于肾小管上皮细胞刷状缘，也存该抗原不仅存在于肾小管上皮细胞刷状缘，也存在于足突细胞靠基膜侧小凹细胞膜外表面。

在于足突细胞靠基膜侧小凹细胞膜外表面。

Heymann肾炎肾炎31用近端小管刷状缘成分为抗原免疫大鼠，使大鼠用近端小管刷状缘成分为抗原免疫大鼠，使大鼠体内产生相应抗体，抗体与体内产生相应抗体，抗体与HeymannHeymann抗原形成免疫复抗原形成免疫复合物，引起膜性肾小球肾炎。

合物，引起膜性肾小球肾炎。

大鼠大鼠肾皮质匀浆肾皮质匀浆同种大鼠同种大鼠造模机制造模机制造模机制造模机制

（一）大鼠主动型

（一）大鼠主动型HeymannHeymann肾炎模型肾炎模型Heymann肾炎肾炎32将多只大鼠处死后取出肾脏将多只大鼠处死后取出肾脏，从肾动脉插入导管，从肾动脉插入导管，用生理盐水反复冲洗后，取皮质用生理盐水反复冲洗后，取皮质5g研成匀浆，与弗氏研成匀浆，与弗氏完全佐剂充分混匀成完全佐剂充分混匀成10ml，加生理盐水加生理盐水20ml，给同种给同种大鼠腹腔注射，每大鼠腹腔注射，每2周周1次，每次次，每次2ml，经经36次注射可次注射可出现蛋白尿，说明模型成功。

出现蛋白尿，说明模型成功。

操作方法操作方法操作方法操作方法

（一）大鼠主动型

（一）大鼠主动型HeymannHeymann肾炎模型肾炎模型Heymann肾炎肾炎33给动物注射抗近端小管给动物注射抗近端小管刷状缘抗原刷状缘抗原（Fx1AFx1A）的抗的抗体，此抗体与足突细胞小凹的抗原复合物结合，在肾小体，此抗体与足突细胞小凹的抗原复合物结合，在肾小球基膜上皮侧（即肾小球上皮下）形成原位免疫复合球基膜上皮侧（即肾小球上皮下）形成原位免疫复合物，继而激活补体形成膜攻击复合物物，继而激活补体形成膜攻击复合物C5b-9C5b-9。

后者插入足。

后者插入足细胞膜足细胞活化，释放氧自由基和蛋白水解酶，导致细胞膜足细胞活化，释放氧自由基和蛋白水解酶，导致基膜完整性破坏，通透性增加。

基膜完整性破坏，通透性增加。

C5b-9C5b-9还可使足细胞相还可使足细胞相关蛋白复合物的结构发生解离，破坏细胞骨架，足细胞关蛋白复合物的结构发生解离，破坏细胞骨架，足细胞足突融合，肾小球滤过屏障完整性受到破坏，产生蛋白足突融合，肾小球滤过屏障完整性受到破坏，产生蛋白尿。

尿。

（二）大鼠被动型

（二）大鼠被动型HeymannHeymann肾炎模型肾炎模型造模机制造模机制造模机制造模机制Heymann肾炎肾炎大鼠肾大鼠肾皮质匀浆皮质匀浆大白兔大白兔大鼠大鼠34n抗近端小管刷状缘抗原（抗近端小管刷状缘抗原（Fx1AFx1A）的制备）的制备皮质匀浆后依次通过皮质匀浆后依次通过8080、100100和和220220目筛网目筛网n抗抗Fx1AFx1A血清的制备血清的制备n大鼠尾静脉注射抗大鼠尾静脉注射抗Fx1AFx1A血清血清5mg/kg5mg/kg操作方法操作方法操作方法操作方法Heymann肾炎肾炎35n蛋白尿；蛋白尿；n光镜下可见肾小球光镜下可见肾小球体积增大，体积增大，基膜基膜局部局部增厚增厚，第，第88、1212周末，肾小球基膜全长增厚，系膜周末，肾小球基膜全长增厚，系膜细胞增细胞增多多；n电镜下电镜下，首次免疫，首次免疫44周末，肾小球基膜呈不规则增厚，周末，肾小球基膜呈不规则增厚，足突融合、消失及钉突形成。

第足突融合、消失及钉突形成。

第88、1212周末，上述病变周末，上述病变进一步加重，进一步加重，可见上皮下有大小不等的电子致密物。

可见上皮下有大小不等的电子致密物。

n免疫荧光显示免疫荧光显示IgGIgG、CC33呈颗粒样沿肾小球基膜分布呈颗粒样沿肾小球基膜分布。

结结结结果果果果Heymann肾炎肾炎36膜性肾小球肾炎膜性肾小球肾炎37原位免疫复合物形成模式图原位免疫复合物形成模式图38394041三、抗三、抗Thy1Thy1肾炎模型肾炎模型（大鼠抗胸腺细胞抗体肾炎模型大鼠抗胸腺细胞抗体肾炎模型）为系膜增生性肾炎，病理特点为系膜细胞增为系膜增生性肾炎，病理特点为系膜细胞增生及系膜基质增多。

本型肾炎