抗体工程概述.ppt

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食品学院微生物教研室食品学院微生物教研室概述讲述内容1抗原2抗体3多克隆抗体4细胞工程抗体5基因工程抗体6抗体的分离纯化与鉴定7抗体的应用及免疫学检验技术抗体基本结构免疫球蛋白的基本结构抗体攻击病毒抗体攻击病毒凝凝集集细细菌菌抗抗SARS的的单单抗抗SARS-CoV抗抗体体是是对对其抗原有其抗原有极强专极强专一性一性的的魔魔弹弹或或巡巡航导弹航导弹研研研研究究究究以以以以免免免免疫疫疫疫转转转转印法印法印法印法检测检测检测检测特定抗原特定抗原特定抗原特定抗原医医医医疗疗疗疗以毒素以毒素以毒素以毒素连结连结连结连结抗体攻抗体攻抗体攻抗体攻击击击击病病病病变变变变細胞細胞細胞細胞检检检检验验验验以以以以ELISAELISAELISAELISA侦测侦测侦测侦测特定特定特定特定病原体病原体病原体病原体抗体药物销售趋势图抗体药物销售趋势图表已批准上市的治疗性单抗2001淋巴瘤CD52人源化抗体Campath2000淋巴瘤CD33人源化抗体化疗药物交联物Mylotarg1998移植排斥兔多抗Thymogloblin1998RSV感染RSVF蛋白人源化抗体Synagis1998乳腺癌HER-2人源化抗体Herceptin19981999炎症性肠病类风湿关节炎TNF-人-鼠嵌合抗体Remicade1998移植排斥CD25人-鼠嵌合抗体Simulect1997淋巴瘤CD20人-鼠嵌合抗体Rituxan1997移植排斥CD25人源化抗体Zenapax1994冠心病血小板受体ba人-鼠嵌合FabReoPro1995大肠癌17-1A鼠单抗Panorex1986移植排斥CD3鼠单抗OKT3批准日期适应症靶向抗原抗体种类抗体名称生物技术生物技术制药基因工程药物（蛋白类药物）基因工程药物（蛋白类药物）人源化治疗人源化治疗性性单克隆抗体药物单克隆抗体药物基因治疗技术基因治疗技术现代中药现代中药至2000年底，在美国药品市场上生物技术药物有76种，其中抗体药物有15种。

2003年治疗用单抗销售总额已超过52亿美元。

2006年预计50-60个治疗性单抗上市。

2010年预计单抗销售额200亿美元。

美国已占全球单抗市场90%一支独秀。

完全人源化单抗现有多个处于临床前阶段EpitopeEpitope,Antigenicdeterminant,Antigenicdeterminant抗原決定基一一个个抗原分子上可能抗原分子上可能有有数个数个抗原決定基抗原決定基每個每個抗原決定基抗原決定基至少誘生一種至少誘生一種專一性抗体專一性抗体蛋白蛋白质质性性抗原決定基抗原決定基含有含有六六个个以上以上氨氨基酸基酸整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体小型化抗体”（单链抗体）（单链抗体）组合抗体库技术组合抗体库技术噬菌体抗体库技术噬菌体抗体库技术IgIg基因转基因小鼠基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体真核表达技术多克隆抗体多克隆抗体多克隆抗体（多克隆抗体（polyclonalantibodypolyclonalantibody）指由不同指由不同指由不同指由不同BBBB细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决细胞克隆产生的针对抗原物质中多种抗原决定簇的多种抗体混合物。

定簇的多种抗体混合物。

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如如如如:

免疫血清（含多种特异性抗体）。

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实际意义：

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（1111）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病，）预防、治疗感染性疾病，如：

破伤风抗毒素血清如：

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破伤风抗毒素血清抗抗抗抗破伤风，破伤风，破伤风，破伤风，胎盘球蛋胎盘球蛋胎盘球蛋胎盘球蛋白白白白抗病毒感染抗病毒感染抗病毒感染抗病毒感染等等等等副作用：

副作用：

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超敏反应超敏反应超敏反应超敏反应（2222）临床诊断，如：

肥达氏反应）临床诊断，如：

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肥达氏反应-伤寒、副伤伤寒、副伤伤寒、副伤伤寒、副伤寒寒寒寒缺点：

特异性差。

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特异性差。

缺点：

特异性差。

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特异性差。

传统传统抗血清抗血清抗抗原原免免疫疫所有抗所有抗体体混合混合123412341234脾脾脾脾脏脏脏脏淋巴結淋巴結淋巴結淋巴結BBBB細胞細胞細胞細胞传统传统传统传统抗血清的交叉反抗血清的交叉反抗血清的交叉反抗血清的交叉反应应应应专一性反应专一性反应专一性反应专一性反应沒有反應沒有反應沒有反應沒有反應交叉反应交叉反应交叉反应交叉反应+-?

123AgAxyzAgB120AgA123123123单克隆抗体可生可生产产有用抗有用抗体体的的淋巴細胞淋巴細胞若若与与癌癌细细胞胞融合，融合，则则形成形成稳稳定而可培定而可培养养的的细细胞胞株株。

癌细胞可培养生长浆细胞Bcell可分泌抗体融合瘤HybridomaYYYYYYYYYYYYYYYYYY细胞融合两组两组染色体混在一起染色体混在一起也可以培也可以培养养生長生長产产生生专专一性抗一性抗体体一個個Bcell只只产产生一生一种种抗抗体体一一个个B细细胞只能生胞只能生产产一一种种抗体，抗体，对对付某一付某一抗原決定基。

抗原決定基。

若有若有若有若有许许许许多抗原決定基，多抗原決定基，多抗原決定基，多抗原決定基，则则则则需需需需许许许许多株多株多株多株BB細胞分別生細胞分別生細胞分別生細胞分別生产许产许产许产许多抗体多抗体多抗体多抗体。

BBBYYYY抗原BYB亲亲亲亲和力成熟和力成熟和力成熟和力成熟11Y22Y33Y44抗原決定基抗原決定基抗原決定基抗原決定基1234mmmm12341234单单抗抗细细胞融合胞融合取出脾細胞取出脾細胞+癌細胞癌細胞各抗各抗体体分分开开1234mmmm1234YYYYYYYYYm核酸补救合成m核酸从头合成核酸氨甲喋呤（A）（-）次黄嘌呤（H）胸苷（T）TKTKHGPRTHGPRTTK-HGPRT-抗体-a-b-c-d-a-b-c-d抗原決定基BALB/cabbcd传统抗体（抗血清）是所有抗体的混和脾脏产生各种B細胞免疫前要先把抗原作成乳剂免疫抗原采血后可得传统抗血清已建立之小鼠骨髓癌细胞株由脾脏收集B細胞抗原通常有多个抗原決定基免疫后的脾脏约在两月內注射五到八次AgX-d细胞融合-a-b-c-dAgXAgXELISAHATPEGCellfusionHybridomacells融合瘤细胞（Subcloning）（确定只有一种细胞）ddabcdabcd+-X-d-c-b-a+-dNS-1骨髓癌细胞Bcell脾细胞分株培养筛选筛选单抗传统抗体（抗血清）试验专一性对抗原的反应无法分辨完全不同d旧有抗原d新的抗原基因工程抗体1人一鼠嵌合抗体（ChimericAntibodies）人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融合而得到的抗体。

定区融合而得到的抗体。

构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因及表达所需的其它元件（如启动子、增强子、选择标记等）的表达载体上，在哺乳动物细胞（如骨髓瘤细胞、CHO细胞）中表达。

构建重组表达载体构建重组表达载体克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分离，也可用PCR技术分离。

人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会带给嵌合抗体不同功能。

为避免人抗体的恒定区产生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效应。

人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种抗各种抗原（包括肿瘤相关抗原）的嵌合抗体。

2鼠单抗可变区的人源化尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时它仍可能引发较强的免疫反应。

为了进一步降低抗体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。

CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。

经过CDR移植，抗体的免疫原性极低，而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原及全抗原（如细胞表面受体、病毒等）的改形抗体都已有报道，到现在已有数百种人源化抗体。

（美国正式上市的11种治疗性单抗中多数是改型抗体）人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。

全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的粘性末端。

合成所有DNA片段，每组片段分别退火，然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中，进一步即可用于构建和表达改形抗体。

定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗体的CDR序列合成几种突变引物，用定点突变的方法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序列，然后表达出改型抗体。

研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框架序列进行操作。

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。

小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低可以用细菌发酵生产，成本低;分子小，穿透力强分子小，穿透力强;不含不含FcFc，没有没有FcFc带来的效应带来的效应;在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

酶标抗体等。

33小分子抗体小分子抗体FvFvScFvScFv单区单区抗体抗体最小识别单位最小识别单位FabFab由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。

（1）FabFv、ScFv的大小约为全分子的1/6。

（2）Fv或ScFvFvScFv连接肽连接肽连接肽连接肽Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故Fv不稳定。

在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体。

连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特点。

常用的连接肽是（GGGGS）3。

单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全人工合成法;在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。

单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种方式:

一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。

产量高，可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性，使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。

但产量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产量仅在数毫克左右。

即为VH，约为完整分子的1/12。

它只由一个结构域构成，故称单域抗体。

单域抗体尽管亲和力有所降低，但仍保持着原单抗的特异性。

（3）单域抗体VH约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR构成，它也保持着抗体的特异性。

（4）最小识别单位CDR44双特异抗体和多价抗体双特异抗体和多价抗体双链抗体双链抗体（DiabodyDiabody）一词