药品微生物检验及方法验证.docx
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药品微生物检验及方法验证
药品微生物限度检查及方法验证
从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。
第一部分：
外围工作
外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。
器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：
干净。
培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。
固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。
煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。
万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。
液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。
万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。
消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。
表面消毒可以用消毒剂擦拭，尤其注意门框边缘以及出风回风口，不能留有死角；空气消毒宜采用臭氧或者紫外灯。
可以使用专门的臭氧发生器产生臭氧进行消毒，也可以在每一个操作间包括净化台安装适宜功率的紫外灯，一方面紫外线可以对近距离的物体表面进行消毒，另一方面紫外线的作用也可以使空气中的氧气转换成臭氧，从而能够杀死空气中的微生物。
另外在每次做完实验之后，都应当对实验台面以及地面进行消毒处理。
第二部分：
检验过程
整个无菌室的检验操作过程应当有一个标准的操作规范，严格按照无菌操作的规定进行操作，包括进入无菌室的程序以及人员清洁消毒，都应当遵守标准来进行。
首先，进入无菌室应当严格按照洁净区（室）有关规定进行。
进入之前先进行洗手消毒，在一更换鞋，脱去外衣，进入二更，穿洁净工作服，注意穿戴洁净工作衣帽时必须做到衣服的任何部位不得拖地。
穿戴好后通过缓冲间进入无菌操作间。
实验前先对工作台面进行消毒，然后再摆放实验用品。
实验中供试液的制备是一个关键环节。
针对不同的供试品性质制定不同的制备方法，原则上整个过程不得损伤供试品中污染的微生物，也不得污染供试品。
在吸取供试液时，
使用的吸管容量和最小刻度要和吸取的供试液量相匹配，不能使用10ml的吸管吸取1ml的供试液，以免造成误差过大的情况，影响结果。
吸取供试液时应当取均匀的液体注皿或者稀释，取上清夜或沉淀物必然对结果产生影响，因为中药口服制剂一般都含药材原粉，不能溶解于稀释液当中，只能以小颗粒分散在液体中，这些颗粒上边会附着有一部分微生物，供试液的制备过程不能把附着在颗粒上的微生物全部洗脱到液体中，而且各种微生物细胞的沉降系数各不相同，在静置状态下，它们在液体中的分布也是不均匀的，所以必须取振摇均匀的供试液（混悬液）。
在无菌操作的过程中，应当注意一些细节，特别是瓶口试管口以及镊子剪刀等的灼烧灭菌和擦拭消毒。
剪刀用消毒液擦拭消毒后必须烤干或者凉干再使用，避免剪刀上残留的消毒液杀死供试品中的微生物。
往平皿里加注供试液时，注意应当缓缓注入，速度过快容易造成液体飞溅，吸管壁残留液体过多，导致污染操作台面、器皿，培养皿中供试液量不足，影响结果。
实验中手臂不要有大的动作，不宜快速移动。
净化台上物品的摆放应当有一定的顺序，尽可能地减少来回交叉动作，因为这样会导致层流净化台中气流紊乱，容易引起污染也容易碰倒容器，发生意外。
倾注培养基时，以培养基能够覆盖平皿底部为好，大概在15-20ml，不宜过多或过少。
如过多则在摇匀时容易溢出皿外，过少则会营养不足，且在培养过程中容易干裂甚至不能覆盖平皿底面，影响微生物生长。
摇匀时应以平皿中供试液分布均匀即可，如果供试液颜色较浅不便于观察，一般可以顺逆时针交替摇20次左右即能达到均匀分布。
从开始制备供试液到倾注培养基，时间不得超过1小时，否则供试液中的微生物有可能死亡或者繁殖。
做完实验后，关掉电源，工作台面进行消毒，最好对房间地面也进行消毒。
所有工作都进行完毕之后，将培养皿及实验过程中使用到的、不宜在无菌室存放的器皿和试剂等通过传递窗传递到室外，将霉菌（酵母菌）、细菌、致病菌分别放入各自适宜的温湿度环境培养。
霉菌（酵母菌）一般置23~28℃培养48~72小时；细菌置30~35℃培养24~48小时；致病菌置37℃培养18~24小时培养，必要时延长至48小时。
逐日观察。
第三部分：
菌落计数及报告单填写
按照《中国药典》2005年版规定，细菌以48小时菌落数字报告，霉菌（酵母菌）以72小时菌落数字报告，必要时延长至5~7天。
菌落蔓延成片的平皿不宜计数，霉菌菌落为丝状的集合体，在菌落较小时肉眼难以看清楚，因此培养时间一定要足，必要时可以延长培养时间。
致病菌通常有大肠菌群和大肠埃希菌以及沙门菌，一般都需要进行增菌培养，
增菌培养液不能作为鉴别致病菌检出与否的依据，必须做进一步的分离培养和生化鉴别。
平皿计数完毕后，再将菌落数字及鉴别情况填写在报告单上。
菌落数字的报告规则为：
选取细菌、酵母菌菌落数在30~300之间，霉菌菌落数在30~100之间的稀释级别，作为菌落数报告的依据。
具体计算方法见《中国药典》2005年版一部附录72。
当菌落数大于100时，采用数字修约方法保留两位有效数字：
四舍六进五留双。
第三位数字如果小于等于四就舍去，如果大于等于六就向前进一位，如果是五则看五前边的数字，是奇数五进一位，是偶数五舍去。
另外，当同一稀释级别的两个平皿上的菌落平均数不小于15时，则两个平皿的菌落数字不能相差一倍或以上。
包材的检验由于稀释倍数不规则导致结果数字比较复杂。
以面积为单位制备供试液的有PVC和镀铝膜，一般都是擦拭100平方厘米的面积，再将棉签剪入30ml的稀释液中，取1ml注皿或者稀释，这样稀释倍数就是1：
30，1：
300如此类推，最后各级别的菌落数都要乘以30，300等等作为结果报告。
以个体为单位制备供试液的有各种规格的瓶子，一般取三个，以瓶子的容积为限将体积等于一瓶容积的稀释液分别等量加入三个瓶子中，充分振摇后再折到一起，摇匀，取1ml注皿或者稀释。
最后稀释倍数应当是瓶子的体积除以3作为基数，依次增大10倍。
牛黄消炎丸小瓶和小金丸用的指形瓶因个体太小，不宜采用前边的方法，目前也没有现成的规定可循，我个人认为取10个置100ml的稀释液中充分摇匀作为1：
10的供试液较好，最后可以报告为cfu/瓶。
第四部分：
致病菌检验
致病菌检验有其不同于计数检验的地方，因此单独叙述。
口服制剂需要检验的致病菌有一下几种：
大肠埃希菌，大肠菌群，沙门菌；外用制剂需要检验的致病菌有：
金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌，深层伤口用制剂还需要检验生孢梭菌。
标准规定，除大肠菌群外致病菌一律不得检出。
大肠菌群是一类能在36℃培养24h内发酵乳糖产酸产气,需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽胞杆菌.它主要包括肠杆菌科的大肠埃希氏菌、枸椽酸杆菌、克雷伯氏菌和阴沟肠杆菌，一般采用发酵法进行检查，按照最大可能数原则报告检验结果。
凡经过验证的产品，其致病菌检验均不需要做阳性对照试验。
致病菌检验属于定性检验，对于除大肠菌群之外的其他检验菌种，都要求鉴别到种。
菌种鉴定一般从菌落形态，细胞形态（革兰氏染色），生化反应等方面进行试验。
增菌培养是为了让污染到药品中的致病菌进行恢复生长，为后续的分离培养和生化试验做准备，以提高检出率。
培养液的操作（分离培养等步骤）必须在阳性室进行，实验过程中注意保护自己，如果发生培养液外漏污染台面等情况时，不要惊慌，立即将蘸有消毒剂的抹布扑在污染处，停留一定时间后再
将其擦干。
第五部分：
异常检验结果的处理
微生物检验偶尔会出现结果异常的情况，在中药制剂的检验中尤为多见。
究其原因，跟中药制剂成分的复杂性和药材来源的多样性以及加工过程的粗放性等有关系。
复杂的成分常常引起不确定的抑菌性，药材来源的多样性和加工过程的粗放性往往使污染微生物的数量处在大幅的变化之中。
总体来说，产生的异常结果通常有以下几种：
1、培养皿上菌落过多无法计数；2、高稀释级培养皿上菌落数大于或接近于低稀释级；3、同一稀释级各培养皿菌落数差异过大；4、阴性对照平皿有菌生长；5、似是而非的酵母菌。
首先分析一下出现上述结果的可能原因。
1、培养皿上菌落过多无法计数。
有两个可能的原因：
供试品本身污染较为严重；实验过程污染。
究竟怎么区分是供试品本身的问题还是实验过程的问题，很大程度上需要相当的经验积累，需要从菌落的生长情况和形态的差异性等方面进行判别，一般人为污染的微生物其菌落形态较为单一，而供试品本身污染的微生物则菌落形态较为多样化。
最终确定结论还应当结合各稀释级别平皿上的情况和阴性对照以及其他供试品的情况综合判别。
2、高稀释级培养皿上菌落数大于或接近于低稀释级。
原因一：
供试品有抑菌性，在高浓度时抑制微生物生长；原因二：
稀释不均匀。
可能的情况是吸取了低稀释级供试液的上清液注皿，而在稀释下一个级别时吸取了较为均匀的或者下层沉淀的供试液；原因三：
操作过程污染。
3、同一稀释级各培养皿菌落数差异过大。
平行实验各次吸取的供试液不均匀，或者是倾注培养基后没有充分摇匀，导致某一个平皿上的若干个微生物细胞因为重叠在一起而形成了同一个菌落，另外一个原因仍然是操作过程污染。
4、阴性对照平皿有菌生长。
无疑这是实验过程本身的问题，分析其污染的原因，也有这么几个可能：
一是稀释液污染，二是培养基污染，三是器皿污染，四是操作污染。
如果是前两个原因，污染肯定是大面积的，也就是说在其他的平皿上也肯定有异常情况出现；如果器皿灭菌不到位，也会出现大面积污染的情况；操作过程污染属于偶然的个别现象，不会形成大面积的污染。
5、似是而非的酵母菌。
这个问题在含有药材原粉的中药固体制剂当中比较容易出现。
目前药典规定的培养酵母菌和霉菌的培养基是玫瑰红钠琼脂，该培养基的选择性不是特别高，一部分细菌仍然可以在玫瑰红钠琼脂平皿上生长，而且一部分细菌的菌落和某些酵母菌
的菌落从其形态上也很难做出区分，往往让人觉得似是而非。
针对上述几种异常现象和可能的原因，经过实践和参考相关的资料，提出解决办法。
首先，检验结果出现异常时，不论何种原因引起，从工作流程上来说，都必须安排另一名检验员进行复检，以确保检验结果的准确性。
分析原因只是为了在以后的工作当中进行改进，避免出现同类问题。
其次，如果判断是稀释液、培养基和器皿灭菌不到位引起的污染，原则上培养基和稀释液应当灭菌后弃去，重新配制，器皿可以重新清洁后再次灭菌，注意灭菌的时间和温度等参数必须符合规定。
如果判断是供试品本身带菌较多，在复检时应当增加适当的稀释级，但最低稀释级的稀释倍数不宜过大，否则会导致误差太大而无法做出准确的结论。
在复检时应当注意吸取均匀的供试液进行注皿和稀释，并在以后的每次实验中都应当做到这一点，从而避免因供试液不均匀而引起的高稀释级菌落数大于或接近于低稀释级以及同一稀释级各平皿菌落数相差过大的情况。
第三，对于复检仍出现高稀释级菌落数大于或接近于低稀释级的情况，可以判断该产品有抑菌性，需要进行方法学验证。
实际上按照《中国药典》2005年版的规定，每一个产品都应当进行卫生学检验方法验证，以确保针对该产品所采用的检验方法能够消除供试品的抑菌性，从而确保检验结果的科学性和准确性。
关于验证，另外再述。
第四，玫瑰红钠平皿上生长的难以鉴定是否为酵母菌的菌落，需要进一步做染色、镜检，以得出准确结论。
另外，出现异常的检验结果，应当及时报知检验课课长。
第六部分：
卫生学检验方法验证
当建立药品的微生物限度检查法时，应当对细菌、霉菌和酵母菌的计数方法和控制菌检验方法进行验证；建立药品的无菌检查法时，应当对所建立的检验方法进行验证。
若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，应当重新进行验证。
这项试验的目的是验证细菌、霉菌和酵母菌计数方法的准确性，验证控制菌检查方法和无菌检查法的专属性和可靠性，以保证检验结果的准确性、科学性以及检验方法的完整性。
一、微生物限度检查方法验证
包括计数方法与控制菌检查法验证。
计数方法验证：
对细菌、霉菌和酵母菌计数方法进行验证，有平板法和薄膜过滤法两种方法，验证要求对照菌回收率不得低于70%。
控制菌检查法验证：
是指建立对控制菌检查方法的专属性，因此要求阳性对照应检出控制菌，阴性对照应无菌生长。
试验中使用的标准菌株有：
大肠埃希菌，金黄色葡萄球菌，枯草芽孢杆菌，白色念珠菌，黑曲霉。
其中以大肠埃希菌代表革兰氏阴性无芽孢杆菌，以金黄色葡萄球菌代表革兰氏阳性球菌，枯草芽孢杆菌代表产芽孢菌，以白色念珠菌代表酵母菌，以黑曲霉代表霉菌。
验证试验操作
A、计数验证方法操作要求
1、菌种传代不得超过5代，并采用适宜的方法保存。
一般采用斜面保藏法保存于4℃的冰箱中。
2、菌液浓度为50～100cfu/ml，要求进行活菌计数，即每次使用前进行培养计数。
3、.验证至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各菌每次试验的回收率。
B、计数法验证操作
计数法验证时，可将试验分为四个组（并可与控制菌检查同时进行）。
1、试验组：
平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu/ml试验菌，分别注入平皿，倾注琼脂培养基，每株试验菌制备2个平皿，按平皿法测定菌数。
薄膜过滤法计数时，取规定量最低倍数稀释供试液，过滤、冲洗，在最后一次冲洗液中加入50～100cfu/ml菌液，过滤，按薄膜法测定其菌数。
2、菌液组：
空白平皿中加入与试验组等量的各标准菌株菌液。
3、供试品对照组：
取同试验组的供试液1ml加入平皿中，测试供试品的本底菌。
该组不加入对照菌液。
4、稀释剂对照组：
若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。
试验时可以稀释液代替供试品加入相应的菌液浓度，按试验组方法计数。
C、计数方法验证结果判断
1、3次对照试验中稀释剂对照组的菌回收率分别均不低于70%。
计数公式：
稀释剂对照组平皿菌落均数/菌液组平皿菌落均数×100%
2、试验组的菌回收率均不得低于70%。
试验组菌落均数-供试品对照组菌落均数
计算公式：
×
100%
菌液组菌落均数
3、若试验组菌回收率不低于70%，可按该供试液制备方法进行对供试品细菌、霉菌和酵母菌数的测定和计数。
若试验组菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法，离心沉淀法、薄膜过滤法或中和法等方法或联合使用这些方法，以消除供试品的抑菌活性，并重新验证。
D、计数验证方法注意事项
1、对照用菌液加入量为50~100cfu，加入体积可参照事前测得的菌液浓度，不可加入过多或过少，过多影响计数，过少则平行性较差，影响结果判断。
2、对照用菌液最好每次试验前重新制备。
每次使用前，都从低一稀释级的菌液中吸取适宜的菌液进行稀释，如果是两次试验间隔时间较长，则必须从原始培养液重新进行稀释计数，或者重新接种培养，确保对照菌的活性和计数的准确性。
3、大肠埃希菌为兼性厌氧菌，能够利用蛋白胨作为营养，所以不宜用加有蛋白胨的稀释液稀释保存，而应使用0.9%的氯化钠液。
E、薄膜过滤计数验证应注意事项。
1、滤膜孔径应不大于0.45μm，φ为50mm，滤膜可灭菌处理。
2、滤膜材质不应受供试品及其溶剂的影响，使微生物能充分被截留。
3、水溶性供试品，滤前用少量冲洗液润湿滤膜，油性供试品、滤器与滤膜使用前应充分干燥。
4、滤膜冲洗量100ml/次，不得少于3次，总量不宜过大，滤膜菌数不得超过100个/张。
5、供试品含量1g或1ml/张，若含菌较多时，可稀释至适宜的倍数过滤，但报告数必须乘以稀释倍数。
6、阴性对照按试验条件加入稀释液体，同法操作，不得有菌生长。
F、控制菌验证方法操作要求
1、在建立药品微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确定所采用的方法适合于该药品的控制菌检查，若该药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。
2、验证时，按各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应的验证菌株。
3、验证大肠菌群检查法时采用大肠埃希菌作为验证菌株，验证梭菌检查法时，采用生孢梭菌作为验证菌株。
4、常用菌株选择有代表性、普遍性、非致病性标准菌株为生孢梭菌，大肠埃希菌，乙型副伤寒沙门菌，金黄色葡萄球菌，铜绿假单胞菌。
5、菌株要求不得超过5代，采用适宜的方法保存。
6、菌液制备：
大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌用营养肉汤或营养琼脂，生孢梭菌的新鲜培养物用硫乙醇酸盐流体培养基，菌液浓度为10～100cfu/ml。
H、控制菌验证方法操作
验证分为两组，即试验组与阴性对照组。
1、试验组：
取规定量供试液及10-100cfu试验菌液，加入到增菌培养基中，按照相应的控制菌检查法进行检查，当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液进行过滤、冲洗，在最后一次冲洗液中加入10-100cfu试验菌液，过滤后注入培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。
2、阴性对照组：
阴性对照组是为了验证该控制菌检查方法的专属性，具体操作同试验组方法。
验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌的检查方法时，采用金黄色葡萄球菌作为阴性对照菌，验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、梭菌的检查方法时，采用大肠埃希菌作为阴性对照菌，结果阴性对照菌不得检出。
I、控制菌检查方法验证结果判断
1、阴性对照组不得产生阳性反应。
2、试验组检出试验菌，可按该方法进行该控制菌检查。
3、若试验组未检出试验菌应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法或联合使用上述方法以消除供试品的抑菌性，并重新验证。
4、验证试验可与控制菌检查同时进行。
验证报告
验证报告的起草一般应当包括一下几个项目：
1、验证产品的品种，批号；
2、验证试验用培养基、稀释液等的型号，来源，配制；
3、标准菌株的名称，代数与来源；
4、供试液制备方法和过程；
5、验证试验数据表；
6、验证结论。
验证试验从平皿法开始，如果平皿法不能通过验证，则依次改用培养基稀释法，离心沉淀法，薄膜过滤法等。
按照节省和经济的原则，在满足微生物生长条件（即消除抑菌性）的情况下，必须尽可能选择实验步骤少的检验方法。
对于含有药材原粉的中药固体制剂来说，因其不能完全溶解在稀释液中，悬浮在液体当中的颗粒上面附着有大量微生物细胞，所以不宜采用离心沉淀法检验，更无法采用薄膜过滤法。
需要指出的是，不论从理论上还是实践中的经验来看，中药尤其是成分复杂的固体制剂，其抑菌性一般不会特别强，经过1：
50或者1：
100的稀释后，抑菌性基本可以去除，而且含药材原粉的中药固体制剂的微生物限度标准数字一般较大，从实验误差上允许进行较大倍数的稀释，所以，可以采用稀释法来消除抑菌性。
注：
以上内容是按照《中国药典》2005年版所做，2010年版在培养时间等方面有所调整。
西安正大制药有限公司李继辉
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