质粒DNA提取定量酶切与PCR鉴定实验报告Word下载.docx
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B.当以高盐缓冲液调治其pH值至中性时,变性的质粒DNA复性并生存在溶液中,染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构,可通过离心形成沉沉淀去除。
(2).离心层析柱:
A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA,而不吸附溶液中的卵白质和多糖等物质;
B.通已往卵白液和漂洗液将杂质和其它细菌身分去除;
C.低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。
3.质粒DNA的定量阐发(紫外分光光度法):
A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应,且其对光的吸收是具有选择性;
B.种种差别的物质都具有其各自的吸收光谱:
DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰卵白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280及A260/A230的比值可以反响DNA的纯度;
A260/A280=1.8
DNA纯净A260/A280<
1.8
体现样品中含卵白质(芳香族)或酚类物质
A260/A280>
含RNA杂质,用RNA酶去除。
4.质粒DNA的酶切判定:
限制性内切酶是DNA重组操纵历程中所使用的根本东西。
限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合,或是与其四周的特异位点结合,并在结合位点切割双链DNA。
5.琼脂糖凝胶电泳:
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子,可以形成具有刚性的滤孔,凝胶孔径的巨细决定于琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性情况中带负电荷,在外加电场作用下向正极泳动。
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时,有电荷效应与分子筛效应:
差别的DNA,分子量巨细及构型差别,电泳时的泳动率就差别,从而分出差别的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比干系).
三、质料与要领:
:
(一)
实验质料:
1.PCR仪器:
PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管质料:
菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光卵白GFP)】、无菌去离子水、2_____Premi_Taq、引物2.
质粒DNA的提取与制备仪器:
恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管质料:
溶液P1(S1)、溶液P2(S2)、溶液P3(S3)、去卵白液PE(W1)漂洗液WB(W2)、洗脱液EB(Eluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH5alpha;
3.
质粒DNA的定量(紫外分光光度法)
仪器:
比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪质料:
蒸馏水、质粒DNA4.质粒DNA的酶切判定仪器:
1.5ml的EP管、微量加样枪质料:
无菌水、10_____M酶切缓冲液BufR、质粒DNA、HindIII(15U/ul)、EcoRI(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳系统、凝胶成像系统质料:
电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNAMarker5000、电泳缓冲液
(二)实验要领
1.
.PCR
2.
.
质粒DNA的提取与制备
准备目的DNA:
菌液煮沸10min,冷冻,室温解冻后离心取上清液取0.2mlPCR反响管一只,用微量加样枪按下述顺序分别参加:
灭菌去离子水5.5mu;
l、2_Premi_Taq12.5mu;
l、引物1(10mol/L)1mu;
l、引物2(10mol/L)1mu;
l、菌液5mu;
l将装有PCR反响体系的PCR反响管放入PCR仪上进行如下操纵:
①94℃预变性5分钟后开始以下循环②循环为94℃;
;
30秒,50℃;
30秒,72℃;
1分钟。
循环为30次③72℃5分钟④4℃
保温取1.5ml培养物参加Eppendorf管中将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中
13000rpm_1min,弃上清
将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心
3.
参加250mu;
l溶液S1,吹打,使细菌沉淀疏散,彻底悬浮
l溶液S2,颠倒4~6次混匀(不要剧烈振荡),直到溶液变得清亮
参加350mu;
l溶液S3,立即温和混匀6~8次。
13000rpm离心10min,小心取上清液(500-800mu;
l)
将吸附柱放于收集管中,将上一步所得上清液参加吸附柱中,13000rpm离心3min,弃滤液
参加500mu;
l去卵白液(W1),13000rpm离心1min,弃滤液
向吸附柱中参加700mu;
l漂洗液W2,13000rpm离心1min,弃滤液;
重复一遍空柱13000rpm离心1min,然后室温安排3min,使残留乙醇挥发取出吸附柱,放入一个洁净的离心管中,在吸附膜的中间加50mu;
l洗脱缓冲液(Eluent),室温安排1min,13000rpm离心1min洗脱质粒DNA,-20℃生存备用清洗比色皿:
用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗,2~3次。
并用滤纸擦拭洁净空白比较比色测定向比色皿参加98ul蒸馏水,进行Blank调零再向比色皿参加2ul的质粒DNA,于紫外分光光度计上进行lsquo;
sle��测定,记录相关数据
4.
质粒DNA的酶切判定
5.
琼脂糖凝胶电泳
四、结果与讨论:
(一)实验现象1.参加溶液P1,出现悬表现象;
2.参加溶液P2,温和混匀,溶液会变得清亮;
在一个洁净的1.5mlEP管中按顺序依次参加下述试剂
无菌水9.0mu;
l、10_____M酶切缓冲液2.0mu;
l、质粒DNA7.0mu;
l、HindIII(15U/ul)1.0mu;
l、
EcoRI(12U/ul)
1.0mu;
l小心混匀试剂,将EP管置于恒温水浴箱中37℃1.5小时。
取质粒DNA、经酶切反响后的DNA片段和PCR扩增的DNA各6mu;
l于三个EP管中并做好标记往每个EP管中参加1mu;
lGelview染料,室温安排一分钟用微量加样枪分别各吸取10ul,按序号参加到电泳仪的凝胶孔中电泳30分钟
取出凝胶紫外光下视察,拍照
3.参加溶液P3,有白色絮状沉淀生成;
4.电泳时,可视察到在电流作用下,点样的溶液出现电泳现象,电泳速度差别。
在紫外检测仪条件下,可以视察到差别的物质出现差别的电泳带。
(二)实验结果
原始实验数据丈量次数
质粒DNA浓度(ug/ml)
Ratio比值(A260/A280)
1
148
1.46
2
106
1.52
3
115
1.45平均值
123
1.47
电泳后的图片
A:
PCR目的条带
B:
酶切片段
C:
质粒DNA
(四)实验阐发1.由上数据可知,Ratio=1.47
A260/A280<
表明样品中含有较多的卵白质(芳香族)
2.
在图片中,其他三类DNA与Maker相比力,可知质粒DNA的分子巨细在
2500bp-3500bp,酶切反响的质粒DNA片段分子巨细在2800-3000bp和400-500左右,PCR的DNA分子巨细在400-500bp。
根本切合预期。
(四)实验讨论1.质粒DNA中出现三条带,分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。
这三种差别构型的分子有差别的迁移率,在一般情况下,迁移速度最快的为超螺旋型,其次为线性分子,最慢的为开环状分子,所以条带从上到下分别为:
超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。
2.对付实验结果中:
1.8的可能原因为:
A.在质粒DNA的提取实验的“取上清液”步调中吸入沉淀导致引入较多的卵白杂质,进而导致后续实验中因卵白质量较多而难以去除。
B.可能为试剂污染引起杂质卵白的引入。
3.实验中需注意的事项:
用微量加样枪加试剂时,同种试剂可以不消换吸头,每次换差别试剂时要记得换一个新吸头。
在PCR中,如果配好的反响液较多沾到管壁上,要将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心,使反响液会合于管底,然后才将反响管放到基因扩增仪上。
在质粒DNA提取的实验中,参加溶液S2时,时间不能太久,行动要温柔,轻轻颠倒频频。
在电泳实验中,点样时枪头下伸,点样孔内不能有气泡。
在电泳中,Geldview有毒,切勿用手打仗。
思考题:
(1)碱裂解法提取质粒时,溶液I、II、III的作用分别为?
答:
溶液I:
螯合金属离子,抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用;
有利于溶酶体的作用。
溶液II:
细胞壁肽聚糖在碱性下水解,核酸和卵白质变性。
溶液III:
酸性条件下质粒DNA复性,变性卵白-SDS+线性DNA沉淀,Na+可中和DNA。
(2)结合实验情况,如何提高限制性酶切的反响效率?
①尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。
②酶量的选择任何时候2种酶的总量不能凌驾反响体系的1/10体积,并且最大反响体系最好不要小于20ul,且酶切反响中甘油浓度应低于5%。
③底物DNA的纯度:
主要污染DNA的某些物质,如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。
④反响系统:
主要是反响缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+,符合离子强度可以引发酶切反响。