抗肿瘤药物的筛选方法.ppt

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抗肿瘤药物筛选抗肿瘤药物筛选张冬梅张冬梅一、导论一、导论二、整体动物水平的筛选二、整体动物水平的筛选三、细胞水平的筛选三、细胞水平的筛选四、酶水平的筛选四、酶水平的筛选五、展望五、展望一、导论一、导论1.肿瘤发病率和死亡率肿瘤发病率和死亡率全球每年癌症全球每年癌症新发病例都在新发病例都在1200万万以上，因癌症死以上，因癌症死亡人数达亡人数达760多万多万，到到2010年底全球肿年底全球肿瘤病人总数已逾瘤病人总数已逾5500万万人人（WHO）。

心脏病心脏病脑血管病脑血管病肿瘤肿瘤25%消化系统病消化系统病肺病肺病其他其他中国每年新增肿瘤病人中国每年新增肿瘤病人200万万人，死亡人，死亡130-170多万多万人左右，目前人左右，目前全国肿瘤患者总数约全国肿瘤患者总数约450万万人，并以每年人，并以每年3%的速度递增。

肿瘤已经的速度递增。

肿瘤已经成为中国公民的头号杀成为中国公民的头号杀手，每年因恶性肿瘤而手，每年因恶性肿瘤而死亡的人口占到总死亡死亡的人口占到总死亡率的率的22%。

2009年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成年中国居民主要疾病死亡率及死亡原因构成死亡原因死亡原因死亡率死亡率（1/10（1/10万万）占总死亡占总死亡人数百分率人数百分率恶性肿瘤恶性肿瘤13522%脑血管病脑血管病11120%心脏病心脏病9618%呼吸系统病呼吸系统病7215%损伤和中毒损伤和中毒315%消化系统病消化系统病175%糖尿病糖尿病171%（中国卫生年鉴中国卫生年鉴）9年中国常见恶性肿瘤的死亡率年中国常见恶性肿瘤的死亡率我国居民常见我国居民常见癌症死亡率癌症死亡率:

胃癌胃癌列肿瘤列肿瘤死亡率首位死亡率首位;其次其次肝癌肝癌、肺癌肺癌、食管癌、食管癌、结直肠癌等。

结直肠癌等。

2.肿瘤的治疗方法肿瘤的治疗方法外科手术治疗外科手术治疗放射线治疗放射线治疗化学药物治疗化学药物治疗3.常用的化疗药物常用的化疗药物v烷化剂烷化剂环磷酰胺、异环磷酰胺环磷酰胺、异环磷酰胺v抗代谢药物抗代谢药物甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷甲氨蝶呤、氟脲嘧啶、阿糖胞苷v抗肿瘤抗生素抗肿瘤抗生素柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星柔红霉素、阿霉素、丝裂霉素、多柔比星v铂类化合物铂类化合物顺铂、卡铂、奥沙利铂顺铂、卡铂、奥沙利铂v抗肿瘤植物药抗肿瘤植物药长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇长春新碱、依托泊苷、替尼泊苷、紫杉醇v激素类激素类v血管新生抑制剂血管新生抑制剂贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼贝伐珠单抗注射液、舒尼替尼、索拉非尼化疗药物的主要不良反应化疗药物的主要不良反应骨髓抑制骨髓抑制（血细胞减少）（血细胞减少）胃肠道反应胃肠道反应（恶心、呕吐、食欲不振等）（恶心、呕吐、食欲不振等）全身反应全身反应（脱发、发热、皮疹）（脱发、发热、皮疹）对各器官影响对各器官影响（心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性）心脏毒性、肝脏毒性、神经毒性）泌尿道毒性泌尿道毒性（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病）（血尿、蛋白尿、尿酸性肾病）局部静脉炎局部静脉炎致畸、致突变、致癌致畸、致突变、致癌4.天然产物与抗肿瘤药物天然产物与抗肿瘤药物v天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不天然产物在新药及新药先导化合物的发现中起着不可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化可替代的作用，是结构新颖和作用独特的抗肿瘤化合物的重要来源。

合物的重要来源。

v美国国立癌症研究所（美国国立癌症研究所（NCI）从从1955年开始从天然年开始从天然产物中筛选抗肿瘤药物。

产物中筛选抗肿瘤药物。

v目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中目前世界上被批准广泛使用的抗肿瘤药物中,以上来源于天然产物。

以上来源于天然产物。

二、整体动物水平的筛选二、整体动物水平的筛选非实体瘤动物模型非实体瘤动物模型肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主艾氏艾氏腹水瘤腹水瘤ECAKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤肉瘤腹水型腹水型S180AKM小鼠BALB/c小鼠肝癌肝癌腹水瘤腹水瘤HepAKM小鼠BALB/c小鼠白血病白血病L1210DBA小鼠白血病白血病P388KM小鼠BALB/c小鼠白血病白血病P615615小鼠常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物）常用小鼠腹水瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型国内外推荐模型肿瘤移植方法：

肿瘤移植方法：

1）无菌操作）无菌操作2）接种部位：

腹腔）接种部位：

腹腔3）癌细胞悬液的制备及接种）癌细胞悬液的制备及接种接种710天小鼠处死，酒精消毒，穿过腹部肌肉吸取腹水24mL*，置冰块上保存。

细胞计数后，PBS稀释制备1x107/0.1mL细胞浓度悬液，每只小鼠注射0.2mL肿瘤细胞悬液注射到腹腔。

5天左右，小鼠出现腹水即为造模成功。

*腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去腹水应为白色浓稠液体，若为黄色或红色应弃去给药及药效评价：

给药及药效评价：

动物分组：

动物分组：

随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低随机分五组（溶剂对照组、阳性药组、高、中、低给药组）；每组给药组）；每组8-10只。

只。

药品制备：

药品制备：

药品溶解生理盐水或药品溶解生理盐水或PBS等缓冲盐溶液等缓冲盐溶液给药方式：

给药方式：

连续给药；连续给药；1-2次次/天天;（ig,ip,iv）14天以上天以上评价指标：

评价指标：

观察记录荷瘤小鼠的存活天数（观察记录荷瘤小鼠的存活天数（30天）天）（7天死亡率天死亡率20%20%或或20%20%动物存活超过动物存活超过44周，实验失败周，实验失败对照组存活时间对照组存活时间14-2014-20天）天）数据处理：

数据处理：

生命延长率生命延长率（%）治疗组存活天数对照组存活天数对照组存活天数非腹腔给药生命延长率非腹腔给药生命延长率50%腹腔给药腹腔给药75%x100%.实体瘤动物模型实体瘤动物模型1）动物移植性肿瘤）动物移植性肿瘤肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主肿瘤名称肿瘤名称代号代号宿主宿主艾氏癌艾氏癌实体型实体型ECSKM小鼠BALB/c小鼠肉瘤肉瘤S180KM小鼠BALB/c小鼠肝癌肝癌实体型实体型HepSKM小鼠BALB/c小鼠黑色素瘤黑色素瘤B16C57BL/6小鼠BALB/c小鼠肺癌肺癌LewisC57BL/6小鼠BALB/c小鼠结肠癌结肠癌C26BALB/c小鼠瓦克癌瓦克癌肉瘤肉瘤W256Wistar大鼠结肠癌结肠癌C38BALB/c小鼠常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）常用小鼠、大鼠实体瘤动物模型表（细胞株及动物）国内外推荐模型国内外推荐模型肿瘤移植方法：

肿瘤移植方法：

1）无菌操作）无菌操作2）接种部位：

）接种部位：

右前肢腋下3）癌块的制备及接种）癌块的制备及接种接种710天小鼠处死，酒精消毒，切开皮肤取出肿瘤块，置于生理盐水中，冰块上保存。

剪碎瘤块成2-3mm3的小块或组织块匀浆成细胞悬液，接种到右前肢腋下。

5天左右，小鼠出现瘤块即为造模成功。

7天后对照组天后对照组20%小鼠肿瘤小于小鼠肿瘤小于400mg或大于或大于2g，实验失败，实验失败给药及药效评价：

给药及药效评价：

给药方式：

给药方式：

连续给药；连续给药；1-2次次/天天;（ig,ip,iv）10-12天天评价指标：

评价指标：

记录小鼠的体重变化。

记录小鼠的体重变化。

12天后，处死小天后，处死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1g左右）。

左右）。

取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目取脾脏和胸腺称重，并测定脾细胞数目数据处理：

数据处理：

抑瘤率抑瘤率（%）对照组瘤重治疗组瘤重对照组瘤重抑瘤率抑瘤率30%认为有效认为有效x100%）人癌异种移植模型）人癌异种移植模型细胞：

细胞：

人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞人源肝癌，胃癌，肺癌，结肠癌等肿瘤细胞动物：

动物：

裸鼠裸鼠（nudemice）特点：

特点：

1）裸体，行似无毛；）裸体，行似无毛；2）不能执行正常）不能执行正常T细胞功能，免疫力低下细胞功能，免疫力低下3）B细胞功能正常，细胞功能正常，NK细胞活性高细胞活性高T淋巴功能缺陷淋巴功能缺陷先天性无胸腺小鼠先天性无胸腺小鼠11号染色体上隐性号染色体上隐性突变裸基因（突变裸基因（nu）肿瘤移植和给药方法：

肿瘤移植和给药方法：

1）无菌操作）无菌操作2）接种部位：

背部）接种部位：

背部3）细胞悬液的制备及接种）细胞悬液的制备及接种细胞悬液浓度细胞悬液浓度1x108/mL，接种，接种0.1mL到背部。

到背部。

7天左天左右，瘤块达到右，瘤块达到50mm3体积即为造模成功，开始给药体积即为造模成功，开始给药。

4）给药时间：

）给药时间：

根据药效确定，一般根据药效确定，一般12-60天。

天。

阳性药阳性药5-Fu（5-氟尿嘧啶）氟尿嘧啶）ADM（阿霉素）（阿霉素）Taxol（紫杉醇）（紫杉醇）CTX（环磷酰胺）（环磷酰胺）选择性对照药选择性对照药推荐剂量：

推荐剂量：

1-20mg/kg给药方式：

给药方式：

与测试药物相同与测试药物相同;常隔天给药常隔天给药药效评价：

药效评价：

评价指标：

评价指标：

记录小鼠的体重变化。

结束治疗后，处记录小鼠的体重变化。

结束治疗后，处死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重死小鼠，拨瘤称重（对照组瘤重1g左左右）。

取脾脏称重，并测定脾细右）。

取脾脏称重，并测定脾细胞数目。

胞数目。

数据处理：

数据处理：

抑瘤率抑瘤率（%）对照组对照组肿瘤体积治疗组肿瘤体积肿瘤体积治疗组肿瘤体积对照组肿瘤体积对照组肿瘤体积抑瘤率抑瘤率30%认为有效认为有效x100%抗肿瘤谱抗肿瘤谱vTaxol（卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、（卵巢癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、食管癌、淋巴瘤）淋巴瘤）v5-Fu（乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀（乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）胱癌、前列腺癌和头颈部肿瘤）vADM（乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）乳腺癌、胰腺癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤和皮肤癌）沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用沙蟾毒精的体内抗肿瘤作用（Carcinogenesis,2013,34:

1331）三、细胞水平的筛选三、细胞水平的筛选1.抑制肿瘤细胞增殖实验抑制肿瘤细胞增殖实验2.诱导肿瘤细胞分化实验诱导肿瘤细胞分化实验3.诱导肿瘤细胞凋亡实验诱导肿瘤细胞凋亡实验4.抗肿瘤血管生成实验抗肿瘤血管生成实验5.肿瘤多药耐药性逆转实验肿瘤多药耐药性逆转实验6.抗肿瘤侵袭和转移实验抗肿瘤侵袭和转移实验7.诱导肿瘤细胞自噬实验诱导肿瘤细胞自噬实验细胞株的选择细胞株的选择.抑制肿瘤细胞增殖实验抑制肿瘤细胞增殖实验A）噻唑兰实验（噻唑兰实验（MTT）原理：

原理：

活细胞活细胞线粒体中脱氢酶线粒体中脱氢酶能够代谢还原黄色的能够代谢还原黄色的MTT，生，生成蓝紫色不溶于水的成蓝紫色不溶于水的甲臜甲臜（Formazan）。

甲臜的多少可以）。

甲臜的多少可以用酶标仪在用酶标仪在570nm处进行测定。

甲臜生成量与活细胞数处进行测定。

甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。

值推测出活细胞的数目。

MTT原理示意图原理示意图甲臜生成量正比于活细胞数甲臜生成量正比于活细胞数采用比色法（采用比色法（570nm）测定甲臜生成量）测定甲臜生成量实验方法实验方法1）细胞培养）细胞培养培养液：

培养液：

RPMI1640、DMEM、MEM、M199、McCoys5A等血清血清：

FBS、NBS、抗生素抗生素：

青霉素、链霉素、庆大霉素、新生霉素等胰酶胰酶：

Trypsin-EDTA、Collagenase缓冲液缓冲液：

PBS、HBSS等生长因子生长因子：

EGF、B-27、N-2等2）细胞传代）细胞传代贴壁细胞生长贴壁细胞生长3-5天，天，80%融合度。

用胰酶消化融合度。

用胰酶消化1-3min后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养后，离心，调节适当密度重新悬浮在培养液中。

液中。

3）细胞计数）细胞计数细胞计数板细