细胞遗传实验指导Word格式文档下载.docx

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微镜它们的放大原理及光路图如下：

　　AB物体．A1Bl第一次成像，A2B2第二次成像，Ol目镜．O2物镜，

　　　　　　F1为Ol的前焦点，F2为O2的前焦点

　　各种光学显微镜的光学放大原理基本相同，各种特殊用途的光镜不过只是在光源、

物镜、聚光器等方面作了改动，或在其它方面增设了某些特殊的设备。

（二）几种光学显微镜

1．普通光学显微镜：

　　普通光学显微镜也叫复式显微镜，是最常见，最简单的显微镜。

它适于观察一般固

定的，有色的透明度较高的标本。

其最大分辨力一般为0.2微米，从构造上可分光学、

机械和电子三大系统。

2．暗视野显微镜：

　　暗视野显微镜是以丁达尔现象（Tyndallphenomenon）（即光的微粒散射现象）为基础设计的，它使用了特殊的聚光器进行斜射照明，因光源中心束不直入物镜，所以视野黑暗，而被检细胞器因斜射照明发生衍射和反射，所以发亮可见。

暗视野显微镜可用增加光照方法增加物体与背景的反差，因而可观察到0.2-0.004微米直径的微小粒子，但它分不清被检物的细微构造，它常用于观察物体的存在与运动。

暗视野显微镜与普通光学显微镜的区别，主要在于聚光器的不同，致使照明方法有别。

确切地说，称暗视野显微镜为暗视野照明更为贴切，它是照明光线仅照亮被检样品而不进入物镜，使视野背景暗黑，样品明亮的照明方法。

3．相差显微镜：

相差是指同一光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。

相位是指在某一时间上，光的波动所达到的位置。

一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨出这种差别的，只有在变相差为振幅差（明暗之差）之后，才能被分辨。

相差显微镜是以光的干涉现象为基础设计的。

与普通光学显微镜比较，它在聚光器和物镜上作了改动。

用装有环状光栏的聚光器造成的空心光线柱，使直射光（背景）和衍射光（样品）分开。

同时在物镜的后焦面上装有相位板，使直射光和衍射光发生干涉，从而把我们肉眼不能见的相位差变为可见的振幅差，同时相位板上装有吸收膜，吸收部分直射（或衍射）光以增加反差，使人们能够看清更加细微的结构。

所以相差显微镜一般用于观察活细胞的细微结构。

4．荧光显微镜：

荧光是指某些物质经波长较短的光线照射后，分子被激活吸收能量后呈激发态，其能量除部分转化为热量或用于光化学反应外，相当一部分则以波长较长的光能形式辐射出来，这种波长长于激发光的可见光称作荧光。

荧光显微镜是以紫外线（3650A）或蓝紫光（4200A）照射某些物质，可激发其产生荧光的原理为基础设计的，利用一个高发光效率的光源，经过一个滤光系统得到紫外光（或蓝紫外光），直接照射标本中的自然荧光物质，使其产生自发荧光，再加以镜检。

或以荧光染料先对标本进行染色，然后使之在上述光源照射下产生次生荧光，再加以镜检。

这种显微镜主要用于观察荧光（或次生荧光）物质在细胞内分布情况，以及测定细胞器的生理活性。

（三）如何提高分辨力

显微镜的能力是质量和性能的标志。

能力包括分辨率、放大率、焦点深度和视场宽度等。

其中最重要的是分辨率。

各种能力都有一定的界限，既互相作用，又互相制约。

改善和提高了某种能力，同时降低了某些能力，只能顾其主要，兼顾其他，综合统筹。

1．数片孔径（numerialaperture）

数片孔径（N.A.）也叫镜口率，是物镜和被检样品之间的介质的折射率（n）与物镜所接受的光锥顶角（亦称孔径角）的一半α（半孔径角）正弦的乘积。

其公式如下：

N.A.=n·

sinα

物镜的数值孔径愈大，显微镜的能力愈强，数值孔径与分辨率成正比，与焦点深度成反比。

物镜的数值孔径的N.A.值刻在物镜壳上，如40／0.65表示40倍的物镜，数值孔径为0.65。

物镜的数值孔径随前透镜直径的减少而增大。

显微镜物镜的前透镜口径愈小，数值孔径愈大，放大倍数愈高，价格愈高。

2．分辨率（resolvingpower）

物镜分辨率是指分辨被检样品细微结构的能力。

通常以能清晰地分辨两个物体点的最短距离来表示。

R=0.61×

λ/N.A．

R：

分辨率；

λ：

照射光线波长；

N.A．：

物镜数值孔径

分辨率以分辨两个点的最短距离表示，R值愈小，分辨能力愈大。

物镜的分辨率与照明光线的波长成反比，与物镜的数值孔径成正比。

照明光线波长愈短，物镜的数值孔径愈大，显微镜的分辨率亦愈大。

物镜的分辨力即显微镜的分辨率，目镜与显徽镜的分辨率无关，它只把物像第二次放大，使眼睛便于观察。

目镜只能将物镜已经分辨的影像进行放大，无法观察到未被物镜分辨的细节。

在光学成像过程中，目镜不起初始造像作用，仅作放大而已。

3．放大率（magnification）

显微镜最后形成的物体放大影像，对被检物体的大小比例称为放大率，即像高比物高。

放大倍数以长度计算，而不是以面积或体积计算。

显微镜的总放大率（Mt）应为：

Mt=Mob×

Me×

Mph

Mt：

总放大率；

Mob：

物镜放大率；

Me：

目镜放大率；

Mph：

摄影透镜放大率

一般镜检观察时，摄影附加透镜的放大倍率不计算在内，因它未参于造像，显微镜辨别细微结构的能力，不取决于总放大率，而归于物镜的分辨率。

显微镜的总放大率绝非愈高愈好，有其适量范围：

最低和最高界限。

适宜的总放大率是所用物镜数值孔径的500～1000倍。

在此范围称作有效放大率。

例如：

使用40／0.65物镜时，应选配适宜的目镜倍数范围。

首先计算出有效放大倍率：

　　　　　　　0.65×

500～0.65×

1000=325-650

再用物镜放大倍率除以有效放大率：

325÷

40～650÷

40=8-16

求得的数值是应选配的目镜放大倍率的范围，即要选用8×

-16×

的目镜。

总之，总放大率超过物镜数值孔径的1000倍时，细微结构分辨不清，为空的放大，

低于500倍时由于放大率过低，肉眼难以分辨。

4．焦点深度（depthoffocus）

当显微镜对被检样品的某一点或平面准焦时，影像的清晰范围，不局限于这一点或面，在某上下的一定距离或深度内也是清晰的。

这段清晰的距离或深度，就叫做焦点深度，简称焦深，焦深长表示清晰的上下范围或深度大，焦深短，清晰的上下界限短。

显微镜的焦深可变，它与物镜的数值孔径和总放大率相关。

焦深与物镜的数值孔径和总放大率成反比，收缩孔径。

影像的焦深加大，提高物镜的数值孔径，清晰深度变小，总放大率提高，焦深度小，总放大率降低，焦深加大。

使用同一物镜，配用倍率的目镜，其焦深随目镜倍率加大而减少。

三、实验用品：

（一）材料：

草履虫，洋葱内表皮，紫鸭趾草等花粉，菠菜叶。

（二）用品：

普通光学显微镜，暗视野显微镜，相差显微镜，荧光显微镜，载玻片，

盖玻片，吸管，镊子，剪刀等。

四、实验方法：

l．观察草履虫的外形、运动、纤毛、食物泡等。

取少许棉花纤维或擦镜纸纤维，放于载玻片上，在其上滴一滴草履虫悬液，然后加盖玻片观察。

2．洋葱表皮细胞和菠菜叶的细胞核、叶绿体的观察

在载玻片上滴一滴水，撕洋葱鳞茎内表皮或菠菜下表皮一小块放于其中，使其展开，然后加盖玻片观察。

3．紫鸭趾草花粉外形、表面突起的观察

在载玻片上滴一滴水，取紫鸭趾草雄蕊在其中沾几下，然后盖片观察。

五、作业：

1．谈谈如何提高显微镜的分辨力。

2．根据实验结果，把所能观察到内容的材料符号填在表内适当的位置。

观察内容

普通光学显微镜

暗视野显微镜

相差显微镜

细胞核

核仁

叶绿体

线粒体

液泡

纤毛

A、草履虫B、洋葱表皮细胞C、菠菜叶细胞

3．通过实验简述所使用的几种显微镜的用途。

实验二细胞形态大小的观测——测微尺的使用

一、实验目的：

观察不同组织的细胞形态，了解它们与功能的关系，学会和掌握测微尺的使用。

二、实验原理：

细胞种类繁多，形态、大小差别较大，从形状上动物卵细胞、植物的基本组织细胞（薄壁细胞）是球形或近球形细胞。

人的红细胞呈圆饼状，神经细胞分枝状，植物细胞执行不同功能，其形状差异很大，如输导组织细胞呈柱状，机械组织细胞呈棱形等。

细胞的形态与其功能相适应。

细胞的形态可以通过显微镜观察得以描述，而细胞的大小是通过一定的测量工具来获得较为准确的测量结果，下面介绍几种测量用的测微尺。

1．镜台测微尺：

是一种特制的载玻片，中央有刻度线的标尺，一般全长为lmm，共分l0个大格、100个小格，每一小格长度（0.01mm），用加拿大树胶将圆盖玻片密封在载玻片上。

2．目镜测微尺：

是放在目镜筒内的标尺。

我们使用的是固定式目微尺，为一块圆片玻璃片，直径20-2lmm，上面有刻度，分为直线式和网格式的。

（1）直线式目微尺：

用于测量被检物的长度，整个刻度一般长约10mm，分成l0个

大格，100个小格。

（2）网式目微尺：

主要用于计算被检物的数目和测量物体的面积，方格大小各有不同。

3．镜台标准推动器上的纵横游标尺：

一些较高级的显微镜都有该装置，它可以用来测量被检物的长度和位置，由标尺和

副标尺组成。

4．微调焦轮的标尺：

是在调上、下厚度时，微调焦轮读出的数值，一般有100个

刻度，每一刻度为l-2µ

m。

l、0.5％蕃红或l/3000中性红溶液

2、香柏油，二甲苯

3、兔的肝、肾、卵细胞永久制片

4、蚕豆根尖切片．洋葱新鲜材料

四、实验步骤：

（一）台微尺和目微尺的校对

1．卸下目镜，拧开后面的透镜，将目微尺装入其焦面上，使刻度向下。

2．将台微尺置于载物台上，使刻度向上。

3．调焦至能看清台微尺刻度线。

4．移动台微尺，并转动目微尺，使两个测微尺的左边第一条刻度线完全重合，然后向右边找完全重合的刻度线。

分别记录两重合线间台微尺刻度数n和目微尺刻度数m，并查出台微尺的实际刻度值a（一般为0.0lmm）。

5．计算目微尺的实际刻度值x（mm）

X=n·

a/m

6．校对后，卸下台微尺进行细胞形态、大小观测，如果物镜倍数改变，需进行重

新校对。

（二）细胞形态观察和细胞大小的测量

1．兔不同组织细胞永久制片

观察其细胞间隙、细胞形状、细胞核及核仁形状与数目、细胞质的形态结构等。

2．蚕豆根尖的永久制片

观察蚕豆根尖纵切面概况，注意生长点与生长点成熟区细胞的异同。

3．大肠杆菌标本示范，注意细胞形状、大小及核物质等情况。

4．细胞大小的测量

对于圆形椭圆形细胞或正方形细胞，它们的直径、长、宽可以用目微尺进行测量，对于长方体的细胞来说，算出体积要有一厚度的问题，它是不能用目微尺测量的，而需要用显微镜微调焦轮上的标尺，具体方法如下：

（1）将微调“O”刻度与基部镜臂上刻度线对准。

（2）转动粗调看清细胞的上端面或下端面；

然后顺时针或逆时针旋转微调，看清细

胞的下端面或上端面，计下微调旋过的刻度数L，则厚度为：

h=L．b

（b为微调每转一刻度，物镜垂直下降的距离。

一般显微镜都给出了）

5．求核质比NP

核质比的计算=Vn（核体积）/Vc（细胞体）-Vn（核体）

注：

椭圆体积v=4／3πab2

圆球体积v=4／3π

长方体V=a．b．c

（1）兔肾细胞的永久制片求NP值。

（2）洋葱内表皮细胞，用0.5％蕃红染色5分钟观察，求NP值。

五、作业

1．通过观察，说明真核细胞和原核细胞，植物细胞和动物细胞在形态结构的复杂

性上和大小上有何差异。

2．写出目微尺在10倍、40倍镜下的实际刻度值X的计算过程和结果。

3．分别计算出兔肾细胞和洋葱表皮细胞的NP值。

实验三细胞膜的通透性

了解相对分子质量、脂溶性大小、电解质和电解质溶液对细胞膜透性的影响。

细胞膜在不断变化的环境中，必须保持自己的稳恒状态，才能生存。

细胞膜允许一些物质通透，又能降低甚至阻挡另一些物质的通透，所以细胞膜具有选择通透性。

水分子可以自由通过细胞膜，当细胞处于低渗液环境时，水分子大量渗入细胞内，使细胞膨胀，进而细胞破裂，血红蛋白释放到介质中由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这就是溶血现象。

溶血现象可作为测量物质进入红血细胞速度的一种指标。

红细胞置于乙二醇、丙三醇（甘油）、葡萄糖等摩尔浓度的高渗液中，乙二醇等分子进入红细胞，使细胞内的渗透性活性分子的浓度大为增加，继而导致水的摄入，使细胞膨胀，细胞膜破裂，发生血溶。

溶血现象发生的快慢与进入细胞的物质的分子量大小有关。

相对分子质量大的进入细胞慢，发生溶血所需时间也长。

非极性化合物易溶于脂溶剂，但在水中溶解度很小。

碳链越长，脂溶性越大。

一种化合物在脂溶剂中的溶解度与其在水中溶解度之比，称为分配系数。

各种非电解质溶液，只要单位面积中所含的分子数相同，就具有相同的渗透压。

电解质溶液，如NaCl与葡萄糖分子数相等时，NaCl产生的渗透压要大得多。

具有相同渗透压的某非电解溶液与某电解质溶液浓度之比，成为等渗系数。

用i来表示：

i=葡萄糖的等渗物质的量浓度/NaCl的等渗物质的量浓度

发生溶血者为低渗液，所以把发生溶血前的一管溶液的浓度近似视为红细胞等渗液。

三、实验用品

（1）用品：

小烧杯、试管、试管架、刻度吸管、注射器、秒表等。

（2）材料：

含适量肝素的兔血或鸡血。

（3）试剂：

1mol/L乙二醇水溶液、1mol/L丙三醇水溶液、1mol/L葡萄糖水溶液、3mol/L甲醇、3mol/L乙醇、3mol/L丙醇、1/8mol/L、1/9mol/L、1/10mol/L、1/12mol/L、1/14mol/L葡萄糖溶液、1/12mol/L、1/14mol/L、1/16mol/L、1/18mol/LNaCl溶液。

四、实验方法

1.相对分子质量大小对膜通透性的影响。

（1）在编号的3支试管中，分别用吸管吸入2ml1mol/L乙二醇、1mol/L丙三醇、1mol/L葡萄糖高渗液。

（2）先后分别用注射器滴加两滴血液，用手指按住管口，倒置一次。

（3）观察血溶时间，最长延至10min。

（4）将实验结果列入如下所示的表格中。

溶液

相对分子质量

溶血时间

1mol/L乙二醇

62

1mol/L丙三醇

92

1mol/L葡萄糖

180

2.脂溶性大小对细胞膜透性的影响

（1）编号的3支试管分别加入2ml3mol/L的甲醇、乙醇、丙醇。

（2）分别先后加入两滴血液，按住管口倒置一次。

（3）观察溶血时间。

（4）将实验结果记入下所示的表格中。

分配系数

3mol/L甲醇

32.04

0.0097

3mol/L乙醇

46.07

0.0357

3mol/L丙醇

58.0

0.156

3.电解质和非电解质溶液对细胞膜透性的影响

（1）将试管编号，注明溶质名称及物质的量浓度。

（2）按编号分别加入不同浓度的葡萄糖及氯化钠溶液2ml。

（3）每管各加入两滴血液，按住管口，倒置一次。

（4）室温放置15min，观察发生溶血的浓度，确定等渗浓度。

（5）按下表记录实验结果。

（6）计算等渗摩尔浓度。

溶质

物质的量浓度/（mol/L）

1/8

1/9

1/10

1/12

1/13

1/14

1/16

1/18

葡萄糖

NaCl

实验四胞间连丝的观察

观察植物细胞的胞间连丝，了解其意义。

二、实验原理

高等植物细胞之间通过胞间连丝相互连接，完成植物细胞间的通讯连接，胞间连丝穿越细胞壁，由相互连接的相邻的细胞质膜共同组成的直径为20—40nm的管状结构，中央是由内质网延伸形成的链管结构，胞间连丝的形成是在细胞分裂时由GB内质网小泡形成胞间层，内质网穿过胞间层形成胞间连丝，在细胞生长过程中胞间连丝的数目还会增加。

（一）器材：

显微镜，载玻片，盖玻片，解剖刀，刀片，镊子，剪刀。

（二）试剂：

0.5％的蕃红水溶液。

（三）材料：

红辣椒，玉米籽粒，洋葱。

（一）红辣椒表皮细胞临时制片

取一小块红辣椒，用刀片小心刮除果肉，留下一层极薄的表皮，放于载玻片上，封片观察、镜检时光线不要太亮。

（二）玉米种子糊粉层临时制片

将玉米种子在水中浸泡一天，用镊子剥去表皮露出糊粉层，这时可以用摄子轻撕糊

粉层放于水中，或制作徒手切片。

刀口与糊粉层平行，切极薄片，封片观察。

（三）洋葱内表皮细胞观察

撕洋葱内表皮一小块，0.5％番红染色2—3分钟，冲洗，封片观察，多余的水用

吸水纸吸干。

绘各种材料的胞间连丝图。

实验五荧光细胞化学测定

一、实验目的

学习荧光显微镜的使用，了解荧光显微技术原理和方法，以及荧光技术在细胞化学方面的应用。

二、实验原理

荧光显微技术是利用短波光照射被射物质，以激发其发射荧光而在荧光显微镜下可以检视的方法。

荧光又可分为：

自发荧光和次生荧光。

自发荧光是指有些生物体受到短波光照射后，直接发出的荧光。

如经紫外光照射后，叶绿体发出的红色荧光；

木质素发出的黄色

荧光等。

次生荧光是指有些生物材料受到短波光照射后并不发光，但当它吸附荧光染料后，也同样产生荧光，这种荧光也称间接荧光。

．

作为荧光的激发光源可分别采用紫外，紫、蓝、绿等波段的光；

而获得的荧光为紫、蓝、绿、黄、橙、红等波段的光。

不同生理活性的细胞，发射荧光（或次生荧光）的能力有很大差别，不同组份对荧光染料反应产生的荧光颜色也不同，所以利用这一特性，通过荧光显微镜可以测定某些组分的含量。

以及细胞的生理活性。

三、实验用品

（一）材料：

洋葱

荧光显微镜，载玻片，镊子，烧杯等。

（三）试剂：

（1）O.01％吖啶橙生理盐水溶液

（2）O.02％异硫氰酯荧光素生理盐水溶液

（3）O.Ol％罗丹明生理盐水溶液

（4）荧光增白剂溶液，将荧光增白剂溶于0.4M山梨醇溶液中，使浓度达到

0.1％。

（一）利用荧光增白剂观察植物细胞壁

植物细胞壁有强烈的吸附染料的能力，因此很多荧光染料都能着染细胞壁，但近年来最常用的还是荧光增白剂，以此来鉴别细胞壁的状况，并常用于检查原生质体细胞壁是否分解完全，以及原生质体再生细胞壁的鉴别。

1．取洋葱表皮细胞（1cm2）置于载玻片，以荧光增白剂染色5分钟，加盖玻片，荧光显微镜下观察其细胞壁。

2．取以酶液游离出来的原生质体悬液l滴于载玻片上，加荧光增白剂一滴，染色5分钟，加盖玻片，在荧光显微镜下观察原生质体脱壁是否完全，蓝紫光激发观察。

（二）DNA分布的观察

取洋葱内表皮细胞（1cm2）置于载玻片，以0.0l％吖啶橙染色5分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下蓝光激发观察。

（三）蛋白质分布的观察

取洋葱内表皮细胞（1cm2）置于载玻片，以0.02％异硫氰酯荧光素染色5—10分钟，生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下蓝光激发观察。

（四）线粒体观察

取洋葱内表皮细胞（1cm2）置于载玻片，以0.0l％罗丹明染色5分钟生理盐水冲洗一次，加盖玻片，荧光显微镜下绿光激发观察。

分别描述DNA，蛋白质及线粒体在细胞内的分布与颜色。

实验六细胞活力的测定

一、实验目的及原理

二、实验用品

（一）材料：

新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆原生质体悬液，人口腔上皮细胞。

（二）用品：

荧光显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，烧杯，牙签等。

（三）试剂：

1．二丙酸酯荧光素溶液：

取l0mg二丙酸荧光素于5ml丙酮中，将此溶液逐滴加入

5mlPH5-6生理盐水或0.65M的甘露醇溶液中，直到出现永久性乳白沉淀为止。

2．0.01％吖啶橙的生理盐水溶液。

三、实验方法

（一）细胞二丙酸酯荧光素分解酶的活性及细胞活力的测定

二丙酸酯荧光素是非荧光性的亲酯性化合物，很容易进入细胞活力较强的细胞内，由于细胞内有较强的活性酯酶而将二丙酸酯荧光素中的荧光素分解出来，从而在荧光显微镜下发出了强烈的黄绿荧光，相反活力较弱的细胞，由于酯酶的含量低，表现荧光较弱，而死亡的细胞，由于酯酶活性丧失，不能分解二丙酸酯荧光素，而完全没有荧光，具体方法如下：

1．取少许新鲜紫鸭趾草花粉或蚕豆表皮放在玻片上，加二丙酸酯荧光素溶液一滴，

5-lO分钟后，在荧光显微镜下观察，时间不宜太长，以免细胞逐渐死亡，影响效果。

2．若着染是悬浮细胞，可将上述染色液数滴直接加入细胞培养液5分钟后，可离

心收集。

再用无细胞和无染料的培养液洗二次，即可收集观察。

上述染过的细胞可保存在4℃左右的冰箱中，直到细胞死亡前故可观察。

（二）吖啶橙鉴定细胞死活

细胞经吖啶橙染色，在激发光作用下，活细胞核呈黄绿色或亮绿色荧光，而细胞质为淡红色，但含有粘多糖的细胞在其细胞质中出现桔黄色颗粒，或整个细胞质呈桔黄桔红色荧光，死细胞其核呈红色荧光其操作方法如下：

用牙签取少许口腔粘膜上皮细胞，涂在载玻片上，滴加1-2滴0.01％吖啶橙生理盐水溶液，加盖玻片，待染色5分钟后于荧光显微镜下观察，注意细胞核所呈荧光颜色。

四、作业

说明你所检查的细胞活力状况。

实验七细胞活体染色技术

1．学习细胞活体染色的方法。

2．观察动、植物活细胞内线粒体，液泡系的形态、数量与分布。

活体染色是利用某些无毒或毒性较小的染色剂，在不影响细胞生命活动的情况下显示细胞的天然构造，更具真实性。

活性染色又分为体内活体染色和体外活体染色。

詹纳斯绿B（JanusgreenB）能够活染线粒体为蓝色，主要是由于线粒体内膜上的细胞色素酶系使染料始终保持在氧化状态（即有色状态），在周围的细胞质内，这些染料被还原为无色的色基（即无色状态）。

中性红是液泡系的特殊活体染色剂，它可将不