第4章细菌的生化试验文档格式.docx
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1.原理:
不同的细菌对各种糖醇的分解能力及所产生的代谢产物各不同,有的能分解多种糖醇),有的只能分解1~2种糖醇,有的分解糖醇能产酸产气,有的分解糖醇只产酸不产气,根据这些特点,可鉴别细菌。
常用的糖醇
单糖:
葡萄糖、甘露糖醇、木糖、半乳糖鼠李糖
双糖:
乳糖、蔗糖、麦芽糖、蕈糖
三糖:
棉子糖
多糖:
菊糖、肝糖、淀粉
醇类:
甘露醇、山梨醇、肌醇、卫茅醇
2、试验方法:
用接种针或环移取纯培养物少许,接种于糖发酵管中,若为半固体培养基,则用接种针作穿刺接种。
置36±
1.0℃培养1~3天,每天观察结果。
3、结果观察和记录
记录:
产酸不产气,阳性,以“+”表示
产酸产气,阳性,以“⊕”表示
不产酸产气,阴性,以“-”表示
(二)葡萄糖氧化发酵(O/F)试验
1、原理:
细菌对葡萄糖的分解,分为氧化型和发酵型。
氧化型细菌在有氧的条件下才能分解葡萄糖,无氧的条件下不能分解葡萄糖;
发酵型细菌在有氧无氧条件下均可分解葡萄糖;
不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。
根据糖管的色泽变化可鉴别细菌。
2、方法
取待检菌,以穿刺法接种于两管葡萄糖半固体培养基上,在其中一管加入一层(约1Cm)灭菌的液体石蜡以隔绝空气,在37℃培养2~4h天,每天观察结果。
3、结果观察与记录
(三)V-P试验
1、原理:
某些细菌能分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸经缩合、脱羧生成乙酰甲基甲醇,后者在强碱环境下,被空气中的氧氧化为双乙酰,在α-萘酚和肌酸的催化作用下,双乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物,称V-P(+)反应。
2、试验方法
(1)奥梅拉法:
将试验菌接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于36±
1℃培养48h,每1ml培养液加奥梅拉O’Meara试剂0.1ml,摇动试管1~2min,静置于37℃恒温箱4h,或在48~50℃水浴放置2h后判定结果。
(2)贝立脱法:
1℃培养2天,每2ml培养液先加入6%a-萘酚纯酒精溶液1ml,再加40%氢氧化钾水溶液0.4ml,摇动2~5min,阳性菌常立即呈现红色,若无红色出现,静置于室温或36±
1℃培养4h,如显现红色为阳性,呈黄色或有类似铜色者,可判定为阴性。
(3)快速法:
将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中,挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环,乳化接种于其中,加入5%α-萘酚3滴,40%氢氧化钠水溶液2滴,振动后放置5min,判定结果。
不产酸的培养物不能使用。
(1)发酵管出现红色者,为阳性,记V-P+
(2)发酵管为黄色或铜绿色者,为阴性,记V-P-
(四)甲基红试验(MR)
1、原理 细菌分解葡萄糖产生丙酮酸后,由于代谢的途径不同,有的细菌可使丙酮酸转化生成乳酸、琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物,使培养基PH值下降至pH4.5以下,使甲基红指示剂变红色,为甲基红试验阳性;
有的细菌使丙酮酸脱羧后形成酮、醇类中性产物,培养液pH>5.4,甲基红指示剂呈桔黄色,为甲基红试验阴性。
挑取新鲜的待试培养物少许,接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基,于36±
1℃或30℃(以30℃较好)培养3~5天,从第48h起,每日取培养液1ml,加入甲基红指示剂1~2滴,立即观察结果。
MR-VP试验原理及照片
(1)呈鲜红色或橘红色为阳性,呈淡红色为弱阳性,记MR+;
(2)呈橘黄色或黄色为阴性,记MR-,迄至发现阴性并培养至第5天仍为阴性,即可判定结果。
(五)七叶苷水解试验
1、原理:
七叶苷被细菌分解后,生成葡萄糖和七叶素,七叶素与Fe2+结合,生成黑色化合物,使培养基呈黑色,以此鉴别细菌。
将待试纯培养物少许,接种于七叶苷培养基,于36±
1℃培养24h,观察结果。
(1)培养基变为黑色或棕黑色者,为阳性,记录为+
(2)培养基不变色者,为阴性,记录为-
(六)甘油品红试验
某些细菌可分解甘油成为丙酮酸,并进一步脱羧生成乙醛,乙醛与无色品红生成醌式化合物,呈深紫红色,以此鉴别细菌。
取待检菌的新鲜纯培养物,接种于甘油品红肉汤培养基中,于36±
1℃培养8天,并用未接种的培养基在相同条件下培养作为阴性对照,观察结果。
(1)出现紫色或紫红色者,为阳性,记录为+;
(2)与对照管颜色相同者,为阴性,记录为-
复习题
1、什么是生化试验?
2、做生化试验要注意哪些事项?
3、简述糖醇类发酵试验的原理,写出其试验方法和结果的记录
5、简述甲基红试验(MR)的原理,写出其试验方法和结果的记录
(一)靛基质(吲哚)试验
(二)H2S试验
(三)尿素酶试验
(四)氨基酸脱羧酶试验
(五)苯丙氨酸脱氨酶试验
(六)明胶(Gelatin)液化试验
(一)靛基质试验
某些细菌含有色氨酸酶,能分解蛋白胨中的色氨酸,生成靛基质(吲哚)。
吲哚与对二甲氨基苯甲醛结合,可形成红色化合物,即玫瑰吲哚,以此鉴别细菌。
所用试剂:
(1)柯凡克(Kovacs)试剂;
(2)欧—波试剂
将待检菌小量接种于培养基中,于36±
1℃培养24~48h时后,加入柯凡克试剂数滴,轻摇试管,呈红色者为阳性。
或沿试管壁缓慢加入欧-波试剂约0.5ml覆盖液面,两液接触处呈现玫瑰红色者,为阳性反应,无红色者为阴性反应。
靛基质试验原理及照片
呈现玫瑰红色,为阳性反应,记+
无红色者,为阴性反应,记-
(二)硫化氢(H2S)试验
某些细菌可分解培养基中的含硫氨基酸或含硫化合物,产生硫化氢,硫化氢遇铅盐或铁盐可生成黑色沉淀物PbS或FeS,以此鉴别细菌。
挑取待检菌,用穿刺接种法接种于三糖铁培养上,于36±
1℃培养24~48h,观察结果。
培养基底部呈黑色,为阳性,记+
培养基底部无黑色,为阴性,记-
(三)尿素酶试验
某些细菌能产生尿素酶,将尿素分解产生氨,氨使培养基变为碱性,使培养基中的酚红指示剂呈粉红色,培养基由黄色变为红色,为阳性。
以此鉴别细菌。
挑取大量培养18~24h的待试菌,浓密涂布接种于尿素琼脂斜面上,不要到达底部,留底部作变色对照。
培养2、4和24h分别观察一次结果,培养基变为粉红色为阳性,颜色不变者为阴性。
如阴性应继续培养至4天,作最终判定。
尿素酶试验图
培养基变呈粉红色,为阳性,记+
培养基颜色不变,为阴性,记-
(四)氨基酸脱羧酶试验
某些细菌能产生氨基酸脱羧酶,可使赖氨酸、鸟氨酸生产脱羧作用,生成胺类物质和CO2。
胺类物质使培养基呈碱性变紫色,为阳性,如呈黄色为阴性,以此鉴别细菌。
2、试验方法
取待检菌,分别接种于含有氨基酸的培养基内和不含氨基酸的对照培养基内,在36±
1℃培养1~4天,每天观察结果。
试验管呈紫色,对照管呈黄色,为阳性,记+
试验管、对照管都呈黄色,为阴性,记-。
阳性反应试验管颜色变化过程
紫色→黄色→紫色
原理:
对照管呈黄色,说明有细菌生长。
在培养的早期(10~12h),细菌发酵葡萄糖产酸使培养液PH下降,指示剂溴甲酚紫由紫色变为黄色,以后由于氨基酸脱羧生成胺,PH又回升至碱性,指示剂显紫色。
(五)苯丙氨酸脱氨酶试验
某些细菌可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱去氨基,形成苯丙酮酸,苯丙酮酸与氯化铁作用生成绿色化合物,以此鉴别细菌。
从待检菌琼脂斜面上挑取大量培养物,接种于苯丙氨酸培养基上,在36±
1℃培养18~24h后,加入氯化铁溶液4~5滴,转动试管,使试剂与菌苔表面充分接触,立即观察结果。
试验管立即出现绿色,为阳性,记+
无色为阴性,记-。
(六)明胶液化试验
1、原理
有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽,又进一步将多肽水解为氨基酸,明胶失去凝胶性质,使培养基由固态变为液态。
挑取培养18~24h的待试菌,以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度。
于20~22℃培养7~14天。
明胶高层亦可培养于36±
1℃。
另取一支未接种的培养基一同培养作对照,每天取出两支试管,放入冰箱放置20~30min后,再观察结果。
明胶液化,为阳性,+。
明胶凝固,为阴性,-。
1、简述靛基质试验的原理,写出其试验方法、结果的记录和注意事项
2、简述硫化氢试验的原理,写出其试验结果的记录和注意事项
3、简述尿素酶试验的原理,写出其试验方法、结果的记录
4、简述氨基酸脱羧酶试验的原理,写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理
四、有机酸盐和铵盐的利用试验
枸橼酸盐利用试验
丙二酸盐利用试验
(一)枸橼酸盐利用试验
某些细菌能利用柠檬酸盐作为唯一碳源,分解枸橼(柠檬)酸盐生成碳酸盐;
同时分解培养基的铵盐生成氨,使培养基变为碱性,使指示剂溴麝香草酚蓝由淡绿转为深蓝色,为阳性。
挑取待检菌,在西蒙枸橼酸盐培养基斜面上密集划线接种,在36±
斜面有菌苔生长,培养基斜面变为蓝色或深蓝色,为阳性,记+;
无菌苔生长,培养基斜面仍为绿色者,为阴性,记-
枸椽酸盐试验原理及斜面照片
(二)丙二酸盐利用试验
1.原理:
某些细菌可以利用培养基中的丙二酸盐作为唯一碳源,丙二酸盐被分解成碳酸钠,使培养基变为碱性,培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,以此鉴别细菌。
取待检菌新鲜纯培养物,接种于丙二酸钠培养基上,于36±
1℃培养48h,观察结果。
培养基由草绿色变成蓝色,为阳性,记+;
培养基无颜色变化,为阴性,记-
五、呼吸酶类试验
氧化酶试验
过氧化氢酶试验
硝酸盐还原试验
氰化钾试验
(一)氧化酶试验
氧化酶使细胞色素C氧化后,氧化型细胞色素C再使盐酸二甲基对苯二胺氧化,使生成玫瑰红色到暗紫色的醌类化合物,再和α-萘酚结合,生成吲哚酚蓝,呈蓝色反应,为阳性。
试剂
1%α-萘酚-乙醇液
1%盐酸二甲基对苯二胺
用滴管直接滴加1%盐酸二甲基对苯二胺试剂1~2滴在培养物上,再加入1%α-萘酚-乙醇液1~2滴,在30秒内判定试验结果。
在30秒内呈蓝色反应,为阳性,记+
不变色或为红色者,为阴性,记-
(二)过氧化氢酶试验
某些细菌可分泌过氧化氢酶,加入过氧化氢后,可将过氧化氢分解生成水和氧气,产生气泡,即为阳性反应。
挑取固体培养基上的新鲜菌落一环,置于洁净玻片上(或试管),滴加3%过氧化氢液数滴,或在琼脂斜面培养物上直接滴加过氧化氢液,立即观察结果。
产生气泡者,为阳性,记+
不产生气泡者,为阴性,记-
(三)硝酸盐还原试验
某些细菌具有还原硝酸盐的能力,可将硝酸盐还原为亚硝酸盐,在酸性条件下,亚硝酸盐可生成亚硝酸,亚硝酸与对氨基苯磺酸作用,生成重氮苯磺酸,重氮苯磺酸再与α-萘胺作用,生成红色的化合物,呈红色反应,为阳性反应。
A、对氨基苯磺酸试剂
B、α-萘胺试剂
取待检菌新鲜纯培养物,在硝酸盐培养基上接种,在36±
1℃培养1~4天,每天取2mL培养液,加入A、B试剂的等量混合物各二滴混匀,立即观察结果。
呈现红色,为阳性,记+
若无红色出现,为阴性,记-
(四)氰化钾试验
氰化钾是细菌呼吸酶系统的抑制剂,可与呼吸酶作用使酶失去活性,抑制细菌的生长,但有的细菌在一定浓度的氰化钾存在时仍能生长,以此鉴别细菌.
取培养20~24h的营养肉汤培养液或菌落1环,接种至对照培养基及氰化钾培养基内,立即以橡胶塞塞紧,36±
1℃培养24~48h,观察结果。
对照管有菌生长,试验管有菌生长为阳性,记+。
对照管有菌生长,试验管无菌生长为阴性。
记-。
六、毒性酶类试验
(一)溶血试验
某些细菌在代谢过程中能产生溶血素,可使人或动物的红细胞发生溶解,不同的细菌有不同的溶血反应,借此可鉴别细菌。
有二种:
平板法
将培养物接种于血平板培养基上,36±
溶血试验的溶血类型及现象
(1)α(甲型)溶血:
菌落周围出现较窄的半透明的草绿色溶血环。
(2)β(乙型)溶血:
菌落周围出现较宽的透明溶血环。
(3)γ(-丙型)溶血:
菌落周围无溶血环。
试管法
将待检菌培养液与等量的2%羊血球混合,在36±
1℃培养16~18h,观察结果。
如溶血,培养液可出现透明状。
有溶血现象,为阳性,记+;
无溶血现象,为阴性,记-
(二)链激酶试验
A群链球菌群能产生链激酶,该酶能使血液中的纤维蛋白酶原变成纤维蛋白酶,而后溶解纤维蛋白,使血凝块溶解,为阳性反应。
此试验用于测定链球菌的致病性。
阳性反应具有致病性。
吸取草酸钾血浆0.2mL(0.01g草酸钾加5mL兔血浆混匀,经离心沉淀,吸取上清液),加入0.8mL生理盐水,混匀后,再加入待检菌36℃下培养18-24h肉汤培养物0.5mL和0.25%氯化钙0.25mL,混匀,放37℃水浴中,2min观察一次。
如凝块全部溶化,为阳性+,
凝块24h仍不溶化,为阴性-
(三)卵磷脂酶试验
某些微生物能产生卵磷脂酶,在钙离子存在时,能迅速分解卵磷脂,生成不溶性甘油酯和水溶性磷酸胆碱,在卵黄琼脂平板上菌落周围形成不透明的乳浊环或混浊白环,或使血清、卵黄液变混浊,以此鉴别细菌。
(1)卵黄平板法:
A法:
将待检菌培养物划线接种或点种于卵黄琼脂平板上,36±
1℃培养3~6h,观察结果。
B法:
先用卵黄磷脂酶抗血清将平板涂一半,置于36℃待干后,将待检菌接种于未涂抗血清的一半卵黄琼脂平板上,再转划已涂过抗血清的一半,36±
1℃厌氧培养24~48h,观察结果。
在未涂抗血清的一半平板上,菌落周围形成较大的不透明乳白色混浊区,在涂抗血清的一半平板上,菌落周围无不透明混浊区,为阳性。
两边均无不透明区,为阴性。
(2)卵黄盐水法
将庖肉培养基培养物经除菌过滤,收集滤液。
在两支灭菌试管内,每管加入1%卵黄盐水0.4mL,在一管中加入滤液0.2mL,另一管加入生理盐水0.2mL作对照。
在36℃水浴中,经2h、4h、8h、24h观察结果。
管底发生混浊沉淀,对照管无沉淀者,为阳性。
菌落周围形成较大的不透明区,为阳性。
两管无沉淀者,为阴性。
(四)血浆凝固酶试验
致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶,可使血浆中的纤维蛋白原转变成纤维蛋白,附着在细菌的表面,形成凝块;
或作用于血浆凝固酶原,使它成为血浆凝固酶,从而使抗凝的血浆发生凝固现象,为阳性。
(1)玻片法:
取清洁干燥载玻片,一端滴加一滴生理盐水,另一端滴加一滴兔(人)血浆,挑取菌落分别与生理盐水和血浆混合,5min内,如血浆内出现团块或颗粒状凝块,而盐水滴仍呈均匀混浊,则为阳性;
如两者呈均匀混浊,无凝固则为阴性。
(2)试管法
取灭菌小试管3支,各加入血浆①-无菌水(1:
1)0.5ml,1支加入被检菌株的营养肉汤培养液(或浓菌悬液)0.5ml;
其余2支作对照管,1支加入金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作阳性对照;
另1支加入营养肉汤或0.9%氯化钠溶0.5ml作空白对照。
将3管同时放37℃温箱或水浴中培养,每0.5h观察一次,4h内无凝固现象者,观察直至24小时。
3、试管法的结果观察与记录
空白对照管的血浆流动自如,阳性对照管血浆凝固,试验管血浆凝固者为阳性;
均无凝固则为阴性。
七、三糖铁(TSI)试验
1、三糖铁试验的原理
如果细菌可利用乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气,培养基全部变黄;
如果只可以利用葡萄糖,葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸,因接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面最后为红色,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,仍保持黄色。
如果细菌又能分解含硫化合物,产生硫化氢,培养基底部变黑。
以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物,穿刺接种并涂布于斜面,置36±
1℃培养18~24h,观察结果。
思考题
提问:
志贺氏菌都能分解葡萄糖,产酸不产气,大多不发酵乳糖,不产生H2S。
在培养基上应该产生什么现象?
大肠杆菌,能分解葡萄糖产酸产气,大多数能分解乳糖,不产生H2S。
在培养基上应该是什么现象?
沙门氏菌,能分解葡萄糖,不发酵乳糖,大多数产生H2S,多数产气,在培养基上应该是什么现象?
下面照片所示2-3-4,可能是大肠杆菌、沙门氏菌还是志贺氏菌?
3、简述糖酵解试验的原理,写出其试验方法和结果的记录
4、简述甲基红试验(MR)的原理,写出其试验方法和结果的记录
5、简述靛基质(Imdole)(吲哚)试验的原理,写出其试验方法、结果的记录和注意事项
6、简述硫化氢(H2S)试验的原理,写出其试验结果的记录和注意事项
7、简述尿素酶(Urease)试验的原理,写出其试验方法、结果的记录
8、简述氨基酸脱羧酶试验的原理,写出结果的记录、阳性反应试验管颜色变化过程和原理
9、简述氰化钾试验的原理,写出其试验方法、结果的记录和注意事项
10、写出溶血试验的溶血类型及现象
11、简述链激酶试验的原理,
12、简述血浆凝固酶试验的原理,并写出玻片法的试验方法
13、简述三糖铁(TSI)试验的试验的原理
第二节血清学试验
血清学反应:
指相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用,所出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。
一、抗原与抗体
(一)抗原
1、抗原的概念
抗原(Ag):
是指凡能刺激机体免疫系统诱导免疫应答,并能与应答产生的抗体或致敏淋巴细胞发生特异反应的物质。
2、抗原的特性
免疫原性
免疫反应性
(二)抗体
1、抗体
是指机体内的淋巴系统细胞在抗原物质的激发下,所合成的一种具有特异性免疫功能的球蛋白(免疫球蛋白)。
2、抗体的理化性质
(1)抗体是球蛋白
(2)免疫球蛋白
(三)抗原抗体反应
抗原抗体反应:
是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应
1、抗原抗体反应的化学本质
(1)结构基础
(2)、化学变化:
①四种分子间作用力参与并促进Ag-Ab的反应
电荷引力、范登华引力、氢键结合力、疏水作用
抗原抗体反应的胶体状态的变化过程总结如下。
2、反应过程:
①不可见阶段
②可见阶段
二、血清学反应的特点:
1、具有特异性与交叉性
2、具有敏感性
3、具有定理特性。
4、反应的两个阶段性
5、反应的稳定性与可逆性的。
三、影响血清学试验的的因素
1.抗体
2.抗原
3.电解质:
常用:
0.85%氯化钠或各种缓冲液
作用:
中和胶体粒子上的电荷,使胶体粒子的电势下降,促使抗原抗体复合物从溶液中析出,形成可见的沉淀物或凝集物。
4.酸碱度:
pH为6~8进行
5.温度:
一般以15~40℃为宜,最适为37℃,
四、血清学反应的种类
1、凝集反应
2、沉淀反应
3、中和反应
4、标志抗体技术
(一)凝集试验
颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗体结合,在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象,称为凝集反应
(二)凝集试验的方法
1.直接凝集法
2.间接凝集法
3.抗球蛋白试验
(三)直接凝集试验
1、玻片凝集法
(1)原理:
用已知抗体作为诊断血清,来检测未知抗原,以鉴定相应的抗原。
(2)方法步骤:
①、于洁净玻片的一端加诊断血清1滴,另一端加生理盐水1滴作为阴性对照。
②、用接种环取待检菌或血细胞的悬液分别涂于诊断血清和生理盐水中。
③、轻轻转动玻片,使其充分混匀,静置数分钟,观察结果。
(4)诊断血清及类型
诊断血清:
将已知的抗原注射于动物体,使其产生相应的抗体,采出动物的血液,分离出含有大量抗体的血清,称为诊断血清(或抗血清、免疫血清)
抗O血清:
用菌体抗原(O抗原)免疫动物后所获得的血清。
抗H血清:
用鞭毛抗原(H抗原)免疫动物后所获得的血清。
表面抗原血清:
用含有表面抗原的菌体免疫动物后所获得的血清。
多价诊断血清:
用含有两种(型)的菌体免疫动物后所获得的血清。
单价诊断血清:
只含有一种(型)特异性抗体的血清。
因子诊断血清:
把含有多种抗体的混合免疫血清,用具有共同抗原成分的有关细菌将其共同抗体吸收,只留下一种或几种所需的特异性抗体的血清。
诊断血清的使用与保存
保存:
2~10℃冰箱;
无菌取用,有效期2年
操作方法
1、制备待检菌悬浮液:
1~2×
108个/ml,
2、稀释待检血清:
取10支试管,依次编号,用吸管加入生理盐水,第1管0.9ml,其余各管均为0.5ml。
然后吸取0.1ml待检血清加入第1管内,吹打3次,使混匀,该管含1:
10稀释血清。
接着用同一吸管从第1管吸出