常见猪病PCR检测操作步骤及试剂配制精Word格式.docx
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65℃10分钟,10mMdNTP0.25μL、Oligo（dT
18
迅速放置-20摄氏度冰箱中2分钟,加入M-MLV100U/μL0.25μL（反转录酶37℃水浴1h,即可做为PCR扩增的模板,立即用于PCR扩增或置于-20℃保存备用。
2、PCR扩增
设立阳性和阴性对照,阳性对照一般为病毒液,阴性对照用灭菌的双蒸水做为PCR反应模板。
反应总体系为25μL
cDNA2μL,（模板
25mmol/LMg2+1.5μL,
2.5mmol/LdNTPs2.0μL,
10×
Mg2+freePCRBuffer2.5μL,
20mmol/L上下游引物各1μL,
TaqDNA聚合酶（5U/μL0.2μL
无菌双蒸水补至25.0μL。
PCR反应条件为:
94℃预变性3min;
94℃45s,56℃45s,72℃45s,共进行36个循环;
最后72℃延伸10min。
（根据不同的病毒设定时间和温度
一步法:
采用的是TaKaRa的PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒在25uL反应总体系:
<
1>
PrimeScript1StepEnzymeMix,1uL
2>
2×
1StepBuffer,12.5uL
O,6.5ul
3>
RNaseFreedH
2
4>
20mmol/L上下游引物各1μL,
5>
提取的RNA模板:
3ul
反应条件:
50℃反转录30min,94℃预变性2min,进行30个循环（94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1min,最后72℃延伸10min。
扩增完的PCR产物放4℃保存。
3、凝胶电泳
1%琼脂糖凝胶的配制
0.25琼脂糖+25毫升TAE+1.25微升Goidview放入锥形瓶中,置烤箱中约1分钟沸腾后,摇匀,放置室外,约20-30分钟后倒入板中,约30-45分钟凝固后即可使用。
点样:
将凝胶放入电泳槽中,DL2000的DNAMarker3-5微升,其它样品5微升+0.5-1微升的londingbuffer混合后点样,开启电泳仪,电压80-150V。
4、PCR产物回收纯化
取20μLPCR产物与4μL6×
LoadingBuffer混匀,1%琼脂糖凝胶（GoldView0.5ug/ml电泳。
电泳结束后,在紫外灯下切出含有目的DNA条带的琼脂糖凝胶,用纸巾吸尽凝胶表面的电泳缓冲液,此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的多余凝胶以减小凝胶体积,从而提高DNA的回收产率。
之后按照胶回收试剂盒产品说明书回收目的片段,并取1μL回收产物点样观察回收效果。
纯化步骤如下:
（1称量胶块重量,计算胶块体积,按照1mg等于1μL计算胶块体积;
（2向胶块中加入3倍胶块体积的融化液DR-IBuffer;
（3均匀混合后65℃水浴10min,其间摇晃3-5次使胶块完全溶化;
（4向上述胶块融化液中加入DR-IBuffer0.5倍体积量的DR-IIBuffer,均匀混合;
（5转移液体至Spincolumn中,12,000rpm离心1min,弃滤液（可将滤出液体回收再离心一次以提高DNA回收率;
（6将500ul的RinseA加入Spincolumn中,12,000rpm离心30s,弃滤液;
（7将700ul的RinseB加入Spincolumn中,静置2-3min,12,000rpm离心30s,弃滤液;
（8重复上一步操作;
（910,000rpm,离心1min,弃滤液;
（10将Spincolumn安置于一灭菌的1.5mlEppendorf管中,在滤膜中央处加入灭菌双蒸水或者试剂盒中的洗脱缓冲液20-30微升,室温静置1-2min;
（1112,000rpm离心1min,收集滤出液体再离心洗脱一次,即得到纯化的PCR产物。
注:
PCR纯化产物可直接用于测序,如用PCR回收产物直接测序时,回收第10步中不可用洗脱缓冲液,只可用双蒸水。
5、DNA病毒（PCV2、伪狂犬病毒、细小病毒等
包括病料处理、DNA的提取和PCR扩增、凝胶电泳四个步骤。
1、病料处理同上
2、DNA的提取
1取处理好的病料约1毫升置1.5毫升的离心管中,12000rpm/min离心五分
钟,取上清液（500-700μl.缴入等体积的氯仿剧烈振摇静止5分钟,12000rpm离心10分钟,
2去上清至新的离心管中,加入终浓度为分别为10%的SDS（约50微升和
50μg/ml蛋白酶K（约10微升,55℃作用1.5h-2h（提前准备好水浴锅。
3加入200uLTris饱和酚,振荡混匀,4℃,12000rpm/min离心15min;
4取上清液,于一个新的离心管中,加入Tris饱和酚和氯仿各200uL,充分混
匀,12000rpm/min离心15min;
5取上清于一新的离心管中,加入200uL氯仿,充分混匀,12000rpm/min离
心15min;
6去上清于新的离心管中,加入2倍体积无水乙醇,-20℃放置20min,12000
rpm/min离心15min,弃上清。
（无水乙醇提前冰浴
7加入70%的乙醇（提前放入冰箱冲洗沉淀表面和管壁,弃乙醇,晾干。
（若
无沉淀可以离心7500rpm/min离心5min;
8最后加入20μl无菌ddH2O溶解,-20℃保存备用。
3、PCR扩增
3、凝胶电泳同上
4、PCR产物的纯化回收以及测序同上。
试剂配制
1、DEPC水的配制
向灭菌的玻璃瓶中加入超纯水,然后加入DEPC至终浓度为0.01%（V/V过夜搅拌（放置摇床中,高压灭菌即可。
2、病料处理用PBS的配制
NaCl:
8.00g
KCl:
0.20g
Na
2HPO
4
1.42g
KH
2PO
:
0.27g
向烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,用浓盐酸调节PH至7.4,加入去离子水定容至1升,高压灭菌后即可使用。
1、TAE电泳液
150×
TAE贮存液:
Tris242g,冰乙酸28.5ml和Na
2EDTA.2H
O37.2混合,向
烧杯中加入800毫升去离子水,充分搅拌,加入57.1毫升醋酸,充分搅拌,加入去离子水定容至1升,室温保存。
（21×
TAE工作液:
50×
TAE贮存液20ml,加纯水定容至1000ml。
4、10%SDS:
10gSDS置于100-200ml烧杯中,加入80ml的去离子水,68℃溶解,调PH7.2,早定容100ml.
5、dNTPMixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIZOL等试剂均购自Invitrogen公司;
M-MLV购自Promega公司。
DL2000的DNAMarker,一步法的PrimeScriptOneStepRT-PCRKitVer.2试剂盒
购自TaKaRa公司。
Tris饱和酚,购自Solarbio。
检测用的引物:
1.蓝耳:
上游:
JN15CGGTTTTGATGGGCGACA3
下游:
JN25TGCAGGCGTGCGAGGTAA3
退火温度:
53-56℃
检测缺失毒株用
2.猪瘟
检测疫苗毒用
HCV15AAACGGAGGGACTAGCCGT3
HCV25GATTCAACTCCATGTGCCATG3
56℃
检测野毒
CSFV15-ACCTAATCTTACACTATGCAATC-3
CSFV25-CTGGACTAGTCCCATCAAAT-3
51-54℃
3.传染性胃肠炎
TGEV15-GATGGCGACCAGATAGAAGT-3
TGEV25-GCAATAGGGTTGCTTGTACC-3
51℃
4.流行性腹泻
PEDV15-GAAATAACCAGGGTCGTGGA-3
PEDV25-GCTCACGAACAGCCACATTA-3
5.乙脑
JE-15AACAGCATGCAAATCGAAGAC3
JE-25CCAGAAACATCACCAGAAGG3
55℃
6.伪狂犬
PRV-gB-F5’CGTCGAAGTACACGTACCCG3’
PRV-gB-R5’CTCGAGCGAGCTGCAGAACAAG3'
退火温度:
7.细小
PPV-F5’CCCAGAGGCAACAGCAATTAGG3’下游:
PPV-R5’CGAGATCTTGTGAAGATGTGG3’
退火温度55℃
8.圆环
PCV2-F5’CAACAGCATGCCCAGCAAGAAGAAT3’下游:
PCV2-R5’TAGATTACACAGTCTCAGTAG3’
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