《环境微生物学》 课程授课教案Word文件下载.docx
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CAI
软件名称
上机学时
思考题和作业
P692、3、7、8
备注
第二章原核微生物
Chapter2Prokaryomicrobe
第一节细菌
一、细菌的形态和大小
细菌的个体形态要借助于光学显微镜才能观察到。
细菌的基本形态可分为球状、杆状和螺旋状三种,分别被称为球菌、杆菌和螺旋菌(图1·
2)。
球菌呈球形和近球形。
球菌分裂后产生的新细胞常保持一定的排列方式,在分类鉴定上有重要意义。
根据球菌细胞分裂面和分裂后的排列方式,又可分为单球菌、双球菌、链球菌、四联球菌、八叠球菌和葡萄球菌。
杆菌细胞呈杆状或圆柱形。
各种杆菌的长宽比例上差异很大,有的粗短,有的细长。
短杆菌近似球状,长的杆菌近丝状。
有的菌体两端平齐,如炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis),有的两端钝圆,如维氏固氮菌(Azotobactervinelandii),还有的两端削尖,如梭杆菌属(Fusobacterium)。
杆菌细胞常沿一个平面分裂,大多数菌体分散存在,但有的杆菌呈长短不同的链状,有的则呈栅状或“八”字形排列。
细胞弯曲呈弧状或螺旋状。
弯曲不足一圈的称弧菌,如霍乱弧菌(Vibriocholerae)。
弯曲度大于一周的称为螺旋菌。
螺旋菌的旋转圈数和螺距大小因种而异。
有些螺旋状菌的菌体僵硬,借鞭毛运动,如迂回螺菌。
有些螺旋状菌的菌体柔软,借轴丝收缩运动并称为螺旋体,如梅毒密螺旋体(Treponemapallidium)。
细菌的形态除上述三种基本形态外,还有其他形态的细菌,如柄细菌属(Caulobacter),细胞呈弧状或肾状并具有一根特征性的细柄,可附着于基质上。
又如球衣菌属(Sphaerotilus),能形成衣鞘(sheath),杆状的细胞呈链状排列在衣鞘内而成为丝状体,此外还有呈星状的星状菌属(Stella)、正方形的细菌等(图1·
3)。
图1·
2细菌的基本形态(Madiganetal.,2000)图1·
3特殊形态的细菌
细菌的大小可以用测微尺在显微镜下进行测量,也可通过投影法或照相制成图片,再按放大倍数测算。
表示细菌大小的常用单位是μm(微米)。
球菌大小以其直径表示,多为0.5~1μm。
杆菌和螺旋菌以其宽度与长度表示,杆菌的宽度一般为0.4~10μm,长度为宽度的一倍或几倍。
但螺旋菌的长度是菌体两端点间的距离,而不是真正的长度,它的真正长度应按其螺旋的直径和圈数来计算。
细菌的大小因菌种而异,见表1—1。
细菌的形态、大小受多种因素的影响,一般处于幼龄阶段和生长条件适宜时,细菌形态正常、整齐、表现出特定的形态大小。
在较老的培养物中,或不正常的条件下,细胞常出现异常形态大小。
表1-2细菌的大小
菌名
直径或宽×
长度(μm)
乳链球菌(Streptococcuslactis)
0.5-1
金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)
0.8-1
最大八叠球菌(Sarcinamaxima)
4-4.5
大肠杆菌(Escherichiacoli)
0.5×
1-3
伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphi)
0.6-0.7×
2-3
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)
0.8-1.2×
1.2-3
炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)
1-1.5×
4-8
德氏乳细菌(Lactobacteriumdelbruckii)
0.4-0.7×
2.8-7
霍乱弧菌(Vibriocholerae)
0.3-0.6×
迂回螺菌(Spirillumvolutans)
1.5-2×
10-20
二、细菌细胞的构造与功能
典型的细菌细胞构造可分为两部分:
一是不变部分或称基本构造,包括细胞壁、细胞膜、细胞质和原核,为所有细菌细胞所共有;
二是可变部分或称特殊构造,如荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢和孢囊等,这些结构只在某些细菌种类中发现,具有某些特定功能。
(一)、细胞壁
细胞壁(Cellwall)是包围在细胞表面,内侧紧贴细胞膜的一层较为坚韧、略具弹性的结构,占细胞干重的10%—25%。
细胞壁具有固定细胞外形和保护细胞的功能。
失去细胞壁后,各种形态的细菌都变成球形。
细菌在一定范围的高渗溶液中,原生质收缩,出现质壁分离现象。
在低渗溶液中,细胞膨大,但不会改变形状或破裂,这些都与细胞壁具有一定坚韧性和弹性有关。
细胞壁的化学组成也使细菌具有一定的抗原性、致病性以及对噬菌体的敏感性。
有鞭毛的细菌失去细胞壁后,仍可保持有鞭毛,但不能运动,可见细胞壁的存在为鞭毛运动提供的力学支点,为鞭毛运动所必需的。
细胞壁是多孔性的,可允许水及一些化学物质通过,但对大分子物质有阻拦作用。
1884年丹麦人革兰氏(ChristianGram)发明了一种染色法,这种染色方法的基本步骤为:
在一个已固定的细菌涂片上用结晶紫染色,再加媒染剂-碘液染色,然后用乙醇脱色,最后用复染液(沙黄或番红)复染。
显微镜下菌体呈红色者为革兰氏染色反应阴性细菌(常以G-表示),呈深紫色者为革兰氏染色反应阳性细菌(常以G+表示)。
这一程序后称革兰氏染色法(Gramstaining)。
通过这一简单染色可将所有细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌两大类。
这两大类细菌在细胞结构、成分、形态、生理、生化、遗传、免疫、生态和药物敏感性等方面都呈现出明显差异,因此革兰氏染色有着十分重要的理论与实践意义。
通过电镜观察以及细胞壁化学结构的分析表明革兰氏阳性细菌与阴性细菌的细胞壁在结构和化学组分上有显著的差异,见表1-3,图1·
4。
G-细菌
G+细菌图1·
4革兰氏阴性细菌与革兰氏阳性细菌细胞壁比较图(引自Prescottetal.,2002)
表1-3革兰氏阳性细菌与革兰氏阴性细菌细胞壁的主要区别
比较项目
G+细菌
G-细菌内壁层外壁层
细胞壁厚度(nm)
肽聚糖结构
鞭毛结构
肽聚糖成分
磷壁酸
脂多糖
脂蛋白
对青霉素、溶菌酶
20~80
多层,75%亚单位交联,网格紧密坚固
基体上着生两个环
占细胞壁干重的40~90%
多数含有
无
敏感
2~38
单层,30%亚单位交联,网格较疏松
基体上着生四个环
5%~10%无
无11%~22%
有或无有
不够敏感
古细菌没有肽聚糖
1、革兰氏阳性细菌细胞壁
革兰氏阳性细菌只有一层厚约20~80nm的细胞壁。
细胞壁的化学组成以肽聚糖(Peptidoglycan)为主,占细胞壁物质总量的40%~90%。
另外还结合有磷壁质酸(teichoicacid)又称垣酸,是G+细菌细胞壁特有的成分。
5肽聚糖的化学组成和一级结构
肽聚糖是除古菌外,凡有细胞壁的原核生物细胞壁中的共有组分。
肽聚糖是由若干肽聚糖单体(图1·
5)聚合而成的多层网状结构大分子化合物。
肽聚糖的单体含有三种组分:
N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine,简写NAG)、N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid,简称NAM)和四肽链。
N-乙酰葡萄糖胺与N-乙酰胞壁酸交替排列,通过β-1,4糖苷键连接成聚糖链骨架。
四肽链则是通过一个酰胺键与N-乙酰胞壁酸相连,肽聚糖单体聚合成肽聚糖大分子时,主要是两条不同聚糖链骨架上与N-乙酰胞壁酸相连的两条相邻四肽链间的相互交联(见图1.6)。
不同种类细菌的肽聚糖聚糖链骨架基本是相同的,不同的是四肽链氨基酸的组成以及两条四肽链间的交联方式。
四肽链一般可以用R1-D-谷氨酸-R3-D-丙氨酸的通式表示。
R1大多是L-丙氨酸,少数是甘氨酸或L-丝氨酸。
而R3的变化较大,可以是内消旋的二氨基
A.革兰氏阴性菌
B.革兰氏阳性菌图1·
6肽聚糖单层结构模式图(引自Prescottetal.,2002)
庚二酸(meso-DAP),L-赖氨酸,L,L-DAP,L-鸟氨酸,L-二氨基丁酸,有时也可以是同型丝氨酸或L-丙氨酸。
四肽链第二位的D-谷氨酸也可羟基化,游离的α-羟基可酰胺化或被甘氨酸等所取代。
革兰氏阳性菌(以金黄色葡萄球菌为例)的四肽链是L-丙氨酸-D-谷氨酸-L-赖氨酸-D-丙氨酸,二条四肽链间通过五聚甘氨酸桥肽链而间接交联;
桥肽的一头连接L-赖氨酸的ε-氨基,另一头连接着另一条四肽链的D-丙氨酸的羟基,交联度高,从而形成了紧密编织、质地坚硬和机械性强度很大的多层三维空间网格结构。
磷壁质酸是大多数革兰氏阳性菌细胞壁组分,占细胞壁干重的50%左右,以磷酸二酯键同肽聚糖的N-乙酰胞壁酸相结合。
此酸有两个类型:
甘油型磷壁质酸(图1·
7)和核醇型磷壁质酸。
甘油型磷壁质酸是由许多分子的甘油借磷酸二酯键联结起来的分子;
核醇型磷壁质酸是由若干分子的核醇借磷酸二酯键联结而成的分子。
一般认为磷壁酸因含有大量的带负电性的磷酸,故大大加强了细胞膜对二价离子的吸附,尤其是镁离子。
而高浓度的镁离子有利于对维持细胞膜的完整性、提高细胞壁合成酶的活性。
磷壁酸是革兰氏阳性菌表面抗原(C抗原)的主要成分,也是噬菌体吸附的受体位点。
A
B图1·
7磷壁酸类型及基本结构A.核糖醇磷壁酸B.甘油型磷壁酸
2、革兰氏阴性菌细胞壁
G-菌的细胞壁比G+菌的薄,可分为内壁层和外壁层。
内壁层紧贴细胞膜,厚约2~3nm,由肽聚糖组成,占细胞壁干重的5%~10%。
外壁层又称外膜(outermembrane)约8~10nm,主要由脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和外膜蛋白(outmembraneproteins)组成。
G-菌与革兰氏阳性菌肽聚糖的不同之处就在于它们短肽上的氨基酸以及两条短肽上氨基酸相联结的方式不同。
革兰氏阴性菌(以大肠杆菌为例)肽聚糖肽链中的四个氨基酸是L-丙氨酸、D-谷氨酸、内消旋二氨基庚二酸及D-丙氨酸。
一股肽链第三位上的二氨基庚二酸的游离氨基与相邻的另一股肽链末端的D-丙氨酸的羧基形成肽键,将两条肽链联结起来。
脂多糖是G-菌细胞壁的特有成分,G+菌中不存在。
脂多糖由三部分组成,即O-侧链、核心多糖和类脂A(图1·
8)。
O-侧链向外,由若干个低聚糖的重复单位组成,由于具有抗原性,故又称O-抗原或菌体抗原。
不同种或型的细菌,O-侧链的组成和结构(如多糖的种类和
序列)均有变化,构成了各自的特异性抗原。
像沙门氏菌(Salmonella),根据O-抗原可再细分为1000多个血清型,这些血清型的沙门氏菌,核心多糖部分相同,而O-抗原的差异使之在免疫学和临床诊断中具有重要意义。
非致病性革兰氏阴性细菌细胞壁组成中不具O-侧链。
核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸组成,所有革兰氏阴性细菌都有此结构。
类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位,通过焦磷酸键组成的一种独特的糖脂化合物。
类脂A的结构在不同细菌中有所不同,它是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性中心。
8革兰氏G-细菌脂多糖、类脂A、磷脂、孔蛋白的排列方式
外膜蛋白指嵌合在脂多糖和磷脂层外膜上的20多种蛋白,多数功能还不清楚。
其中脂蛋白(lipoprotein)的蛋白质部分末端游离的氨基酸残基与肽聚糖层的某些二氨基庚二酸残基形成肽键,呈共价结合,其脂质部分同外壁层磷脂相结合。
因此,脂蛋白是从肽聚糖层到外壁层之间的桥梁。
另有一类称微孔蛋白(porin)的蛋白存在于G-菌的外壁层中,这些蛋白的功能是作为一个通道使低分子的亲水性物质得以进出。
有特异性性与非特异性两类。
特异性孔蛋白形成“充水”的通道,任何类型的小物质都可以通过。
而另一些孔蛋白具有高度特异性,是因为它们含有一种或多种物质的特异性结合位点。
最大的微孔蛋白可以允许分子量高达5000Da的物质进入。
3、细胞壁结构与革兰氏染色的关系
革兰氏染色的性质同细胞壁的结构与组分有关。
现在大多认为,在染色过程中,细胞内形成了一种不溶性的结晶紫-碘的复合物,这种复合物可被乙醇(或丙酮)从G-细菌细胞内抽提出来,但不能从G+菌中抽提出来。
这是由于G+菌细胞壁较厚,肽聚糖含量高,脂质含量低甚或没有,经乙醇处理后引起脱水,结果肽聚糖孔径变小,渗透性降低,结晶紫-碘复合物不能外流,于是保留初染的紫色。
而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖层较薄,含量较少,而且脂质含量高,经乙醇处理后,脂质被溶解,渗透性增高,结果结晶紫-碘复合物外渗,细胞被番红复染成红色。
4、细胞壁缺陷型细菌
用溶菌酶处理细胞或在培养基中加入青霉素、甘氨酸或丝裂霉素C等因子,便可破坏或抑制细胞壁的形成,成为细胞壁缺陷细菌,通常包括原生质体、原生质球和细菌L-型。
用溶菌酶除去革兰氏阴性菌细胞壁时,若先用乙二胺四乙酸(EDTA)处理外壁,则效果更好。
原生质体(protoplast)在革兰氏阳性细菌培养物中加溶菌酶或通过青霉素阻止其细胞壁的正常合成而获得的完全缺壁细胞称原生质体。
原生质体由于没有坚韧的细胞壁,故任何形态的菌体均呈球形。
原生质体对环境条件很敏感,而且特别脆弱,渗透压、振荡、离心以至通气等因素都易引起其破裂。
有的原生质体还保留着鞭毛,但不能运动,也不能被相应的噬菌体感染。
原生质体在适宜条件下同样可生长繁殖,形成菌落,其他生物活性基本不变。
如用即将形成芽孢的营养体获得的原生质体仍可形成芽孢。
原生质体的获得,给微生物学工作者提供了另一种类型的生物学实体,用原生质体融合新技术,可培育新的优良菌种。
细菌L-型(bacterialL-form)是细菌在某些环境条件下因基因突变而产生的无壁类型。
细胞呈多形态,有的能通过细菌滤器,故又称“滤过型菌”。
L-型菌落生长缓慢,一般需经2-7天方见到针尖样小菌落,中心部分深埋于培养基内,呈典型的“油煎蛋”状。
这些变异型,有些是能回复至亲代的“不稳定”变异株,有些是不能回复的“稳定”变异株。
由于它最先被英国Lister医学研究院发现,故名细菌L-型。
(二)、细胞质膜
细胞质膜(cytoplasmicmembrane)又称细胞膜(cellmembrane),是围绕在细胞质外面的一层柔软而富有弹性的薄膜,厚约8nm。
细菌细胞膜占细胞干重的10%左右,其化学成分主要为脂类(20%~30%)与蛋白质(60%~70%)。
原核生物中除支原体外,细胞膜上一般不含胆固醇,这与真核生物不同(图1.9)。
细菌细胞膜的脂类主要为甘油磷脂。
磷脂分子在水溶液中很容易形成具有高度定向性的双分子层,相互平行排列,亲水的极性基指向双分子层的外表面,疏水的非极性基朝内(即排列在组成膜的内侧面),这样就形成了膜的基本骨架。
磷脂中的脂肪酸有饱和及不饱和两种,膜的流动性高低主要取决于它们的相对含量和类型,如低温型微生物的膜中含有较多的不饱和脂肪酸,而高温型微生物的膜则富含饱和脂肪酸,从而保持了膜在不同温度下的正常生理功能。
细胞膜中的蛋白质依其存在位置可分为外周蛋白和内嵌蛋白两大类。
外周蛋白存在于膜的内或外表面,系水溶性蛋白,占膜蛋白总量的20%~30%。
内嵌蛋白又称固有蛋白或结构蛋白,镶嵌于磷脂双层中,多为非水溶性蛋白,占总量的70%~80%(图1·
10)。
膜蛋白除作为膜的结构成分之外,许多蛋白质本身就是运输养料的透酶或具催化活性的酶蛋白,在细胞代谢过程中起着重要作用。
9原核生物与真核生物的细胞质膜比较
10细菌细胞质膜的基本结构(引自Prescottetal.,2002)
细胞膜的主要功能为:
①控制细胞内、外的物质(营养物质和代谢废物)的运送、交换;
②维持细胞内正常渗透压的屏障作用;
③合成细胞壁各种组分(LPS、肽聚糖、磷壁酸)和荚膜等大分子的场所;
④进行氧化磷酸化或光合磷酸化的产能基地;
⑤传递信息。
膜上的某些特殊蛋白质能接受光、电及化学物质等产生的刺激信号并发生构象变化,从而引起细胞内的一系列代谢变化和产生相应的反应。
除细胞质膜外,很多细菌还具有内膜系统。
①中间体(mesosome)是由细胞膜局部内陷折叠而成,它与细胞壁的合成、核质分裂、细胞呼吸以及芽孢形成有关。
由于中间体具有类似真核细胞线粒体的作用,又称拟线粒体。
②类囊体(thylakoid)是蓝细菌细胞中存在的囊状体,由单位膜组成,上面分布有叶绿素、藻胆色素等光合色素和有关酶类,是光合作用的场所。
③载色体(chromatophore)是一些不放氧的光合细菌的细胞质膜多次凹陷折叠而形成的片层状、微管状或囊状结构。
载色体含有菌绿素和类胡萝卜素等光合色素及进行光合磷酸化所需要的酶类和电子传递体,是进行光合作用的部位。
④羧酶体(carboxysome)或称多角体(polyhedralbody)是自养细菌所特有的内膜结构。
羧酶体由以蛋白质为主的单层膜包围,厚约35nm,内含固定CO2所需的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶和5-磷酸核酮糖激酶,是自养细菌固定CO2的场所。
(三)、细胞质
细胞质(cytoplasm)是细胞膜内的物质,除细胞核外皆为细胞质。
它无色透明,呈粘胶状,主要成分为水、蛋白质、核酸、脂类,也含有少量的糖和盐类。
由于富含核酸,因而嗜碱性强,幼令菌着色均匀。
此外,细胞质内还含有核糖体、颗粒状内含物和气泡等物质。
1、核糖体
核糖体(ribosome)亦称核蛋白体,为多肽和蛋白质合成的场所。
在电子显微镜下可见到细菌的核糖体游离于细胞质中,系70S的颗粒,由50S和30S两个亚单元组成,化学成分为蛋白质与核糖核酸(RNA)。
细菌细胞中绝大部分(约90%)的RNA存在于核糖体内。
原核生物的核糖体常以游离状态或多聚核糖体状态分布于细胞质中。
而真核细胞的核糖体既可以游离状态存在于细胞质中,也可结合于内质网上。
2、内含物
很多细菌在营养物质丰富的时候,其细胞内聚合各种不同的贮藏颗粒,当营养缺乏时,它们又能被分解利用。
这种贮藏颗粒可在光学显微镜下观察到,通称为内含物(cytoplasmicinclusions)。
贮藏颗粒的多少可随菌令及培养条件不同而改变。
异染颗粒(metachromaticgranules)又称捩转菌素(volutin),最早发现于迂回螺(Spirillumvolutans)中。
异染粒是以无机偏磷酸盐聚合物为主要成分的一种无机磷的贮备物。
异染颗粒嗜碱性或嗜中性较强,用蓝色染料(如甲苯胺蓝或甲烯蓝)染色后不呈蓝色而呈紫红色,故称异染颗粒。
聚β-羟基丁酸(poly-β-hydroxybutyricacid,PHB)颗粒,是一种碳源和能源性贮藏物。
它是D-3-羟基丁酸的直链聚合物。
用革兰氏染色时,这类物质不着色,但易被脂溶性染料如苏丹黑着色,在光学显微镜下可见(图1.11)。
根瘤菌属(Rhizobium)、固氮菌属(Azotobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)等细菌常积累PHB。
A
B
图1.11细胞内含物(Madiganetal.,2000)A.细胞中的硫滴B.聚β—羟基丁酸颗粒
肝糖粒(glycogen)和淀粉粒肝糖粒较小,只能在电镜下观察到,如用稀碘液染色成红褐色,可在光学显微镜下看到。
有的细菌积累淀粉粒,用碘液可染成深蓝色。
肝糖粒、淀粉粒都是碳源贮藏物。
硫滴(sulfurglobules)某些氧化硫的细菌细胞内可积累硫滴。
如贝氏硫菌属(Beggiatoa)、发硫菌属(Thiothrix)在细胞内常含有强折光性的硫滴,此为贮存的硫,系通过氧化硫化氢而形成,作为能量储备,需要时可被细菌再利用。
磁小体(megnetosome)存在于水生细菌和趋磁细菌中,是细胞内磁铁矿Fe3O4的晶体颗粒,数目不等。
不同种类的细菌磁小体形态不同,有正方形、长方形、还有刺状之分。
含有磁小体的细菌表现出趋磁性、即沿着地磁场转向和迁移。
磁小体由一层含有磷脂、蛋白质和糖蛋白的膜包围。
3、气泡
某些水生细菌,如蓝细菌、不放氧的光合细菌和盐细菌细胞内贮存气体的特殊结构称气泡。
气泡由许多小的的气囊(gasvesicle)组成,气囊膜只含蛋白质而无磷脂。
气泡的大小、形状和数量随细菌种类而异。
气泡能使细胞保持浮力,从而有助于调节并使细菌生活在它们需要的最佳水层位置,以利获得氧、光和营养。
(四)、细胞核
细菌细胞的核位于细胞质内,无核膜、无核仁,仅为一核区,因此称为原始形态的核(primitiveformnucleus)或拟核(nucleoid)。
细菌细胞的原核只有一个染色体,主要含有具有遗传特征的脱氧核糖核酸(DNA)。
拟核中尚有少量RNA和蛋白质。
但没有真核生物细胞核所含的组蛋白(结构蛋白)。
染色体是由双螺旋的大分子链构成,一般呈环形结构,总长度为0.25~3mm(例如E.coli的DNA长约1mm,分子量为3×
109Da,约有5×
106个bp,至少含5×
103个基因)。
拟核在静止期常呈球形或不规则的棒状或哑铃形。
一个细菌在正常情况下只有一个核区,而细菌处于活跃生长时,由于DNA的复制先于细胞分裂,一个菌体内往往有2~4个核区,低速率生长时,则可见1~2个核区。
原核携带了细菌绝大多数的遗传信息,是细菌生长发育、新陈代谢和遗传变异的控制中心。
在细菌中,除染色体DNA外,还存在一种能自我复制的小环状DNA分子,称质粒(plasmid)。
质粒分子量较细菌染色体小,约2~100×