病毒引物设计Word文档下载推荐.docx

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H1N1流感病毒H1亚型与其他亚型的核酸序列同源性较差，而H1亚型不同毒株的HA序列较为保守，应用软件设计的H1亚型的引物可以较好地检测出H1亚型流感病毒。

关键词：

H1N1流感病毒H1亚型快速检测PCR引物设计

ABSTRACT

Objective:

TodesignH1N1influenzavirusH1subtypePCRprimersforrapiddetectionmethodwithbiologicalinformationtechnology.Methods:

ComparenucleicacidsequencesfromH1N1influenzavirusandothersubtypesoffluvirusdownloadfromGenbankNCBIwithMegAlignofDNAStarsoftwareandHAnucleicacidsequencesfromthedifferentstrainsofH1subtypes.Finally,designprimerswiththeprimerpremier5.0,andBlasttheprimersinNCBI.Results:

ThroughtheMegAlignofDNAStarsoftware,wefindthatthehomologyofnucleicacidssequencesbetweenH1N1influenzavirusandothersubtypesispoor,however,thenucleicacidssequencesofdifferentstrainsofH1subtypesaremoreconservative.Apairofbetterprimersweredesignedbyscreeningfromtheresultsinprimerpremier5.0,makingthePCRdetectionofH1N1influenzavirusmorequicklyandaccurately.Conclusion:

ThehomologyofnucleicacidssequencesbetweenH1N1influenzavirusandothersubtypesispoor,however,thenucleicacidssequencesofdifferentstrainsofH1subtypesaremoreconservative.H1N1influenzavirusH1subtypeprimerdesignebysoftwareisbetterabletodetecttheH1subtypesoffluviruses.

Keywords:

H1N1influenzavirusH1subtyperapiddetectionDesignPCRprimers

1前言

1.1流感及流感病毒概述

1.1.1.流感的流行病学特点及主要症状

流行性感冒（influenza，简称流感）是流感病毒引起的急性呼吸道感染，也是一种传染性强、传播速度快的疾病。

其主要通过空气中的飞沫、人与人之间的接触或与被污染物品的接触传播。

典型的临床症状是：

急起高热、全身疼痛、显著乏力和轻度呼吸道症状。

一般秋冬季节是其高发期，所引起的并发症和死亡现象非常严重。

1.1.2.流感病毒的分类及命名

流行性感冒病毒，简称流感病毒，是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，在分类学上，流感病毒属于正黏液病毒科，它会造成急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常会有周期性的大流行。

病毒最早是在1933年由英国人威尔逊·

史密斯（WilsonSmith）发现的，他称为H1N1。

H代表血凝素；

N代表神经氨酸酶。

流感病毒分为A、B、C三种：

A型：

流感病毒最常见，可广泛流行及人畜共患，例如1997年在香港肆虐的禽流感，以致政府须屠宰150万只鸡。

A型病毒可再分为A1、A2型，并按结构再划分，例如A型H5N1毒株（香港禽流感病毒）、A型H3N2（1995年在武汉发生）、A型H1N1（1995年在德国发生）等。

病毒因不定时的基因突变而衍生新品种。

B型：

也会流行，症状较A型轻，无再分亚型。

C型：

主要以散发病例出现；

无再分亚型。

根据世界卫生组织1980年通过的流感病毒毒株命名法修正案，流感毒株的命名包含6个要素：

型别/宿主/分离地区/毒株序号/分离年份（HnNn），其中对于人类流感病毒，省略宿主信息，对于乙型和丙型流感病毒省略亚型信息。

例如A/swine/Lowa/15/30（H1N1）表示的是核蛋白为A型的，1930年在lowa分离的以猪为宿主的H1N1亚型流感病毒毒株，其毒株序号为15，这也是人类分离的第一支流感病毒毒株。

1.1.3.流感病毒的基因组特征

病毒的核心包含了存贮病毒信息的遗传物质以及复制这些信息必须的酶。

流感病毒的遗传物质是单股负链RNA，简写为ss-RNA，ss-RNA与核蛋白（NP）向结合，缠绕成核糖核蛋白体（RNP），以密度极高的形式存在。

除了核糖核蛋白体，还有负责RNA转录的RNA多聚酶。

甲型和乙型流感病毒的RNA由8个节段组成，丙型流感病毒则比他们少一个节段，第1、2、3个节段编码的是RNA多聚集酶，第4个节段负责编码血凝素；

第5个节段负责编码核蛋白，第6个节段编码的是神经氨酸酶；

第7个节段编码基质蛋白，第8个节段编码的是一种能起到拼接RNA功能的非结构蛋白，这种蛋白的其他功能尚不得而知。

丙型流感病毒缺少得是第六个节段，其第四节段编码的血凝素可以同时行使神经氨酸酶的功能。

1.1.4.流感病毒的变异和进化

流感病毒有一层脂质囊膜，膜上有蛋白质，是由血凝素（H）和神经氨酸酶（N）组成，均具有抗原性。

A型流感病毒变异是常见的自然现象，主要是H和N的变异。

一般感染人类的流感病毒的血凝素有H1、H2和H3三种。

H4至H16则只会感染人类以外的其他动物，如鸡、猪及鸟类。

N分为N1~N9共9个亚型。

数字代表不同类型。

由于甲型流感病毒分为l6个H亚型和9个N亚型，它们可以不断变异，发生排列组合，实现自我进化、变异，也不断带给人类新的威胁。

流感病毒变异有抗原性变异、温度敏感性变异、宿主范围以及对非特异性抑制物敏感性等方面的变异，但最主要的是抗原性变异。

抗原性变异与其他病毒不同，特点是表面抗原HA和NA易变异。

变异有两种形式，即抗原性转变和抗原性漂移。

抗原性转变（antigenicshift）变异幅度大，属于质变，即病毒株表面抗原结构一种或两种发生变异，与前次流行株抗原相异，形成新亚型（如H1N1→H2N2、H2N2→H3N2），由于人群缺少对变异病毒株的免疫力，从而引起流感大流行。

如果两种不同病毒同时感染同一细胞，则可发生基因重组形成新亚型。

1978年前苏联流行的甲型流感病毒H1N1与香港甲型流感病毒H3N2同时感染人则分离出H3N1亚型，这说明自然流行情况下可发生这样的变异。

过去一直认为新旧亚型病毒株间的交替是迅速的，一旦新亚型出现，旧亚型就很快消失。

但1997年夏甲1型（H1N1）虽再度出现，却至今尚未能替代甲3型（H3N2），而是两者共同流行。

直到1998年甲3型（H3N2）代表株的抗原发生了变异，武汉株被悉尼株所取代，人们对新株没有免疫力，造成了新的流行。

抗原性漂移（antigenicdrift）变异幅度小或连续变异，属于量变，即亚型内变异。

一般认为这种变异是由病毒基因点突变和人群免疫力选择所造成的，所引起的流行是小规模的。

在感染人类的三种流感病毒中，甲型流感病毒有着极强的变异性，乙型次之，而丙型流感病毒的抗原性非常稳定。

乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株，但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫，即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效。

甲型流感病毒是变异最为频繁的一个类型，每隔十几年就会发生一个抗原性大变异，产生一个新的毒株，这种变化称作抗原转变亦称抗原的质变；

在甲型流感亚型内还会发生抗原的小变异，其表现形式主要是抗原氨基酸序列的点突变，称作抗原漂移亦称抗原的量变。

抗原转变可能是血凝素抗原和神经氨酸酶抗原同时转变，称作大族变异；

也可能仅是血凝素抗原变异，而神经氨酸酶抗原则不发生变化或仅发生小变异，称作亚型变异。

甲型流感病毒的变异情况见表1-1。

对于甲型流感病毒的变异性，学术界尚无统一认识，一些学者认为，是由于人群中传播的甲型流感病毒面临较大的免疫压力，促使病毒核酸不断发生突变。

另一些学者认为，是由于人甲型流感病毒和禽流感病毒同时感染猪后发生基因重组导致病毒的变异。

后一派学者的观点得到一些事实的支持，实验室工作显示，1957年流行的亚洲流感病毒（H2N2）基因的八个节段中中有三个是来自鸭流感病毒，而其余五个节段则来自H1N1人流感病毒。

表1-1甲型流感病毒抗原变异情况

亚型名称

抗原结构

流行年代

代表病毒株

原甲型（A0）

H0N1

1930-1946

A/PR/8/34（HoN1）

亚甲型（A1）

H1N1

1946-1957

A/FM/1/4/（H1N1）

H2N2

1957-1968

A/Singapore/1/57（H2N2）

香港亚型（A3）

H3N2

1968-1977

A/Hongkong/1/68（H3N2）

新A1与A3交替型

H3N2H1N1

1977-至今

A/USSR/90/77（H1N1）A/BeiJing/32/92（H3N2）

*代表病毒株命名法：

型别/分离地点/毒株序号/分离年代（亚型）

甲型流感病毒的高变异性增大了人们应对流行性感冒的难度，人们无法准确预测即将流行的病毒亚型，便不能有针对性地进行预防性疫苗接种，另一方面，每隔十数年便会发生地抗原转变更会产生根本就没有疫苗的流感新毒株。

1.2当前流行的甲型H1N1流感病毒的研究概况

1.2.1.当前流行的甲型H1N1流感病毒的流行现状

国外流行现状：

从2009年7月开始，WHO根据甲型H1N1流感的流行态势及对人群健康的影响程度，将疫情日报改为周报。

截至2009年9月13日，WHO公布的全球病例数在296471例以上，死亡3486例。

其中美洲地区124126例，死亡2625例；

西太平洋地区76348例，死亡337例；

欧洲地区超过52000例，死亡140例；

东南亚地区25339例，死亡283例；

地中海东部地区10533例，死亡61例；

非洲8125例，死亡40例。

截至2009年9月13日，在北半球的温带地区，流感仍保持着较大的可变性。

在北美，美国报告流感样病例的增加超过了季节性流感发病水平，其南部、东南部及东北部的部分地区尤为显著；

加拿大的流感处于低水平流行，欧洲和中亚的流行水平与之相似，但法国报告流感样病例的增加已超过季节性流行临界水平。

日本的流感活动持续增长并超过季节性流行临界水平，其中增长最明显的是冲绳岛南部。

在美洲和亚洲的热带地区，流感的传播较为活跃，流感流行遍及南亚和东南亚各地域，其中印度和孟加拉国的呼吸道疾病呈增长趋势。

在南半球的温带地区，大多数国家的流感已处于持续下降或回复至季节性流行的基线水平。

澳大利亚较晚受本次疫情影响的地区，其流感样病例的报告呈下降趋势。

而南非的流感活动目前呈现第2个流行峰（第1峰由季节性流感病毒H3N2引起，第2峰则由2009甲型H1N1病毒引起）。

专家预测，夏季后，随着季节性流感的增加，有可能出现更大规模的流感大流行。

国内流行现状：

我国甲型H1N1流感疫情在初期经历了3个发展阶段：

第1个阶段是2009年5月10日我国出现首发确诊病例且之后输入性确诊病例不断增多；

第2个阶段是5月29日我国出现了由输入性病例引发的2代病例，并呈现出2代病例不断增多的趋势；

第3个阶段是我国出现了个别感染来源不清楚的本土病例并引发2代病例。

散在的本土病例使社区范围内持续传播的风险日益增加。

进入8月下旬，随着各类学校的开学和学生人群的大量流动与聚集，全国各地均出现了规模不同的甲型H1N1流感聚集性疫情，且本土病例持续增多。

截至9月7日，我国内地已发生128起甲型H1N1流感聚集性发病。

卫生部通报，截至10月12日，我国内地31个省市自治区累计报告23766例甲型H1N1流感确诊病例，已治愈21342例，重症16例，死亡1例。

目前我国内地每日新增甲型H1N1流感确诊病例数百例，其中绝大多数为境内感染病例。

1.2.2.当前流行的甲型H1N1流感病毒的特点

甲型H1N1病毒属于正粘病毒科（0rthomyxoviridae），甲型流感病毒属（InfluenzavirusA），其遗传物质为RNA。

典型病毒颗粒呈球状，直径为80nm～120nm，有囊膜。

囊膜上有许多放射状排列的突起糖蛋白，分别是血凝素HA、神经氨酸酶NA和M2蛋白。

病毒颗粒内为核衣壳,呈螺旋状对称,直径为10nm。

甲型H1N1病毒为单股负链RNA病毒，基因组约为13.6kb，由大小不等的8个独立片段组成。

尽管不同亚型之间可以组成很多种流感病毒血清型，但是可造成人感染猪流感病毒的血清型主要有H1N1、H1N2和H3N2。

甲型H1N1病原体

H1N1Influenzapathogens

甲型H1N1流感病毒是A型流感病毒，携带有H1N1亚型猪流感病毒毒株，包含有禽流感、猪流感和人流感三种流感病毒的核糖核酸基因片段，同时拥有亚洲猪流感和非洲猪流感病毒特征。

医学测试显示，目前主流抗病毒药物对这种毒株有效。

美国疾控机构的照片显示甲型H1N1流感病毒呈阴性反应。

1.2.3.当前流行的甲型H1N1流感病毒的检测方法

当前流行的甲型H1N1流感病毒已蔓延到了全世界很多国家,给人们的生命健康带来威胁，影响了经济发展和社会稳定。

及时快速的诊断是有效控制流感疫情大规模爆发的最有效的途径之一。

而国内外检验确诊的方法主要有：

甲型H1N1流感病毒的核酸扩增，细胞培养的方法分离鉴定甲型H1N1流感病毒，甲型H1N1流感抗原检查，血清学检查等,但这些方法都费时耗力，不适于快速的检验诊断。

目前对病毒检测最有效、最灵敏、最准确的方法是荧光定量PCR。

通过对当前流行的甲型H1N1流感病毒及甲型流感病毒的序列进行比对，同时设计了特异性检测甲型H1N1流感病毒的引物探针和检测甲型流感病毒的通用型引物探针。

通过应用上述两组引物探针优化PCR反应体系,对甲型H1N1流感病毒进行双重检测，检测结果相互验证更加可靠。

经试验验证，所建立的检测甲型H1N1流感病毒实时荧光PCR体系，其特异性、灵敏度、精密度良好。

并在此基础上建立了同时检测甲型H1N1流感病毒和甲型流感病毒的多重实时荧光PCR体系。

为了方便各检验单位的使用，将实时荧光PCR各成分进行有效的组合，开发甲型H1N1流感病毒及甲型流感病毒联合核酸检测试剂盒。

2研究材料

2.1H1N1流感病毒H1亚型核酸序列的获得

H1N1流感病毒的基因序列来源于NCBI的Genbank，首先打开NCBI的主页，如下：

在search的分类框里选择Nucleotide，并在search框里输入检索关键词，比如输入H1N1，如下：

点击search，则会出现下一页面：

在检索的结果里选择目标序列，就可以得到所需要的序列，所选择的基因序列为全长序列（CDS）。

利用上述检索步骤，并通过筛选，选择了下面的序列为目标序列:

InfluenzaAvirus（A/Bethesda/NIH107-D31/2009（H1N1））segment4hemagglutinin（HA）gene，completecds,登录号为HQ263288;

InfluenzaAvirus（A/Astana/S1/2009（H1N1））segment4hemagglutinin（HA）gene，completecds，登录号为JF789634;

InfluenzaAvirus（A/Astana/S2/2009（H1N1））segment4hemagglutinin（HA）gene，completecds，登录号为JF789635;

InfluenzaAvirus（A/Astana/S3/2009（H1N1））segment4hemagglutinin（HA）gene，completecds，登录号为JF789636；

InfluenzaAvirus（A/Astana/S4/2009（H1N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为JF789637。

2.2其它流感病毒HA亚型核酸序列的获得

利用上述获取H1N1流感病毒H1亚型核酸序列的方法，在NCBI中的公共数据库（GeneBank）中检索其它流感病毒HA亚型的核酸序列，通过筛选，选择了下面的序列:

InfluenzaAvirus（A/Singapore/1-MA12D/1957（H2N2））segment4,completesequenceCDS，登录号为CY034076；

InfluenzaAvirus（A/Singapore/1-MA12C/1957（H2N2））segment4,completesequenceCDS，登录号为CY034990；

InfluenzaAvirus（A/Singapore/1-MA12E/1957（H2N2））hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为CY087792；

InfluenzaAvirus（A/Japan/305-MA12/1957（H2N2））hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为CY087800；

InfluenzaAvirus（A/canine/Korea/1/2010（H3N1））hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为CY090035；

InfluenzaAvirus（A/swine/Iowa/A0109034/2010（H3N2））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为JF812276；

InfluenzaAvirus（A/swine/Iowa/A0109035/2010（H3N2））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为JF812277；

InfluenzaAvirus（A/swine/Indiana/A0109091/2010（H3N2））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds，登录号为JF812289；

InfluenzaAvirus（A/swine/Iowa/A0109112/2010（H3N2））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds登录号为JF812293；

InfluenzaAvirus（A/mallard/ALB/47/1998（H4N1））segment4,completesequence，登录号为CY004925；

InfluenzaAvirus（A/mallard/ALB/47/1998（H4N1））segment4,completesequence，登录号为CY004925；

InfluenzaAvirus（A/Cambodia/408008/2005（H5N1））HAgeneforhemagglutinin,completecds，登录号为AB598119；

InfluenzaAvirus（A/chicken/Dakahlia/121/2007（H5N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,partialcds登录号为HM013679；

InfluenzaAvirus（A/chicken/Dakahlia/122/2008（H5N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,partialcds，登录号为HM013680；

InfluenzaAvirus（A/duck/Dakahlia/123/2009（H5N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,partialcds登录号为HM013681；

InfluenzaAvirus（A/chicken/Gharbia/124/2007（H5N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,partialcds，登录号为HM013682；

InfluenzaAvirus（A/greaterwhite-frontedgoose/California/44358-095/2007（H6N1））segment4,completesequence，登录号为CY076661；

InfluenzaAvirus（A/greaterwhite-frontedgoose/California/44358-112/2007（H6N1））segment4,completesequence，登录号为CY076669；

InfluenzaAvirus（A/shorebird/Delaware/255/2006（H6N1））segment4,completesequence，登录号为CY077118；

InfluenzaAvirus（A/chicken/Rostock/45/1934（H7N1））segment4sequence，登录号为CY077420；

InfluenzaAvirus（A/duck/Denmark/53-147-8/2008（H7N1））segment4hemagglutinin（HA）gene,completecds，登