天然药物化学实验指导Word文件下载.docx

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2．学习生物碱的各种鉴识方法，包括：

层析方法（TLC及PC），沉淀反应，衍生物制备鉴识。

3．学习各种实验技能

提取：

回流提取

分离：

萃取、柱层析

净化精制：

沉淀法、柱层析法

鉴识：

层析法、化学法

二、实验原理

根据一般生物碱的亲脂通性及季铵型生物碱易溶于水，不溶于有机溶剂的特性，提取分离脂溶性生物碱和水溶性生物碱，利用汉防已甲、乙素结构上的差别，用吸附柱层析分离二者，利用季铵碱可与雷氏铵盐产生沉淀的性质与其它水溶性成分分离。

本实验涉及的知识点有：

溶剂提取法、两相溶剂萃取法、色谱法等。

三、实验流程

四、实验方法

（一）总生物碱的提取

称取粉防已粗粉200g，用95%EtOH回流提取二次（500ml1小时，400ml45分钟），两次提取液合并，减压回收乙醇至无醇味，得糖浆状物。

（二）分离

1．亲脂性生物碱与水溶性生物碱的分离

在糖浆状总提取物中加入1%的盐酸约200ml，充分搅拌使生物碱溶解，放置过滤。

滤渣用水洗涤2~3次后弃去，滤液合并后移至500ml分液漏斗中加150mlCHCl3。

再滴加浓氨水调PH9-10，振摇萃取（此时再向水层滴加、浓氨水至无沉淀析出），稍静置，放出CHCl3层，碱水层以新CHCl3萃取4次，依次加入80ml×

4，最后一次萃取的CHCl3层中应基本没有生物碱时认为CHCl3萃取基本完全（取CHCl3液滴在滤纸上，Drangedorff试剂显色不明显为止）。

合并CHCl3液即为亲脂性生物碱的提取液。

碱水层则为水溶性生物碱，CHCl3提取液和碱水层分别在下述

（2）、（3）项中处理。

2．亲脂性生物碱中酚性与非酚性碱的分离

上述CHCl3液置分液漏斗中，用2%NaOH水溶液萃取2次，每次50ml，此时碱水层色已很浅，示酚性脂溶性碱已基本被萃取到NaOH层，合并NaOH萃取液，将NaOH层与CHCl3液分置2个分液漏斗中，可同时操作：

（1）NaOH层加固体NH4Cl至PH9左右，然后CHCl3萃取2次（80ml，50ml），第2次CHCl3层生物碱应极弱示萃取基本完全，弃去水相，合并CHCl3层并用蒸馏水洗至中性，加无水Na2SO4脱水24小时以上，过滤，回收CHCl3，得粗酚性生物碱。

（2）CHCl3层用蒸馏水洗至中性，脱水，回收，残留物抽松，得非酚性生物碱的抽松物，称重，取出50mg作第4项，其余用（CH3）2CO结晶（1：

15）。

3．季铵型生物碱的分离纯化

碱水液用正丁醇萃取（50ml×

2），回收正丁醇，水精制得轮环藤酚碱。

4．非酚性碱中汉防已甲素和乙素的分离纯化。

柱层析分离条件：

吸附剂，中性Al2O3300-200目，Ⅱ-Ⅲ级，装柱15cm。

样品：

拌样上样，取非酚性碱的油松物50mg，用少量CHCl3溶液于吸附剂中分散均匀，边加热挥去CHCl3。

装柱：

湿法装柱（干法装柱也可以）

洗脱剂：

环已烷，丙酮2：

1。

将样品加于柱顶，倒入洗脱剂，然后于柱顶加低压层析分离，流速控制在5ml/分，收集各流份（5-10ml/份），各流份回收溶剂，用硅胶GTLC检查，合并相同流份，回收溶剂至干，分别用（CH3）2CO重结晶1-2次，可得汉防已甲素，乙素精品。

附：

（1）湿法装柱法。

取吸附30g左右于烧杯中，加洗脱剂一定湿润，搅匀，打开层析柱活塞。

将吸附剂缓缓倒入柱内。

待其自然沉降后即可。

柱顶留5ml左右洗脱剂。

倒入拌好的样品。

敲平（此时洗脱剂不能被样品吸干，应有余量），即可开始层析。

（2）干法装柱法。

打开柱活塞，倒入干的吸附剂装15cm高，敲匀，然后倒入拌样的吸附剂再敲平，沿柱壁均匀加入洗脱剂，待流出第1滴流出液时，加满洗脱剂，开始层析。

（3）硅胶GTLC制备与层析，铺板，一块板用吸附剂1.5g，板规格15×

5cm，每克吸附剂用水3ml，在乳体中研匀后铺板，每人铺板6块，自然干燥后用前在100-105℃活化30分钟。

层析条件：

对照品：

甲素、乙素。

展开剂：

CHCl3：

（CH3）2CO（1：

1）展开前浓氨水饱和15分钟。

显色剂：

改良Drangendorff试剂

（三）鉴识

1．层析鉴识

（1）硅胶GCMC板TLC

条件均与柱层检识TLC条件一致，结果参照柱层析检识的结果，可不重复。

（2）叔胺碱多缓冲纸层析

Ⅰ多缓冲滤纸的制备

取滤纸条（2×

30cm2），离下端6cm处开始用铅笔划一原点线，然后向上每隔2cm划一平行线。

并自下而上在每隔2cm的行间顺次涂布PH值不同的缓冲液（6.0，5.4，5.0，4.6，4.0）。

如图示

涂布时勿使缓冲液渗出线外，涂完后将滤纸悬挂在空中自然干燥。

Ⅱ点样

分别在两条滤纸起始线上点下列样品的氯仿溶液。

汉防已甲素

汉防已乙素

Ⅲ展开

溶剂皿内置展开剂CHCl3:

H2O（1：

1）（水预先饱和过的），将点样后的滤纸悬挂在筒内，密闭，饱和30分钟后展开。

Ⅳ显色

喷以改良Dragendorff试剂

2．衍生物的制备

（1）汉防已甲素苦味酸盐的制备

取甲素10mg溶于（CH3）2COlml中，滴加饱和苦味酸试剂至不再析出黄色沉淀，稍放置。

抽滤收集沉淀，依次用少量H2O，EtOH洗涤，再以乙醇重结晶，得甲素苦味酸盐，mp235~242℃。

3．定性反应

取甲素（乙素）溶于稀HCl中，分置4支试管中，加下列试剂1~3滴。

观察现象。

A碘化汞钾试剂

B碘——碘化钾试剂

C硅钨酸试剂

D碘化铋钾试剂

五、思考题

1．有机溶剂提取必须用什么方式？

为什么？

2．减压回收较常压回收有哪些特点？

影响减压回收速度的关键是什么，如何控制？

3．萃取操作的好坏对实验结果会有什么影响，为什么说分离是影响产品产量及质量的主要因素。

4．怎样防止产生乳化，怎样消除乳化？

5．为什么有机溶剂必须洗至中性方能浓缩或放置？

6．何时有机相需要脱水干燥，何时不必？

7．如何用TLC摸住层条件（包括切割柱层，洗脱柱层）？

8．为什么PC中的展开剂必须用固定相预先饱和？

9．什么叫假阳性和假阴性反应？

有什么意义，能消除吗？

10．粉防已中各种生物碱的分离原理是什么？

11．为什么用NH3或NH4Cl调PH，而不用其它碱和酸。

六、主要参考文献

1．药学杂志（日）48；

107；

1928

77；

807；

1957

82；

741；

1962

87；

316；

1967

2．化学学报23；

405；

3．中成药研究3；

36；

1980

4．中草药通讯1：

10；

2；

8；

1976

5．ScienceRecord3；

1950

6．ChineseJPhysiol9（3）；

267，1935

13

（2）；

167，1938

实验二虎杖蒽醌类成分及白黎芦醇苷的提制和鉴定

虎杖系蓼科蓼属植物polyganumcuspidetumsiebetzucc.（即ReynoutrinjaponicaHouobluyn）的根茎。

又名阴阳莲。

民间用于消炎、杀菌、利尿、通经和镇痛。

近年来用于烫伤、止血、消结石和降血脂均有疗效。

虎杖根茎中含有大量的蒽醌类成分和二苯乙烯类成分。

后者具有降血脂的作用。

一、部分已知成分的物理性质

1．大黄酚（chrysophanol）

金黄色六角形状结晶（丙酮中结出）或针状结晶（乙醇中结出）196℃，能升华。

不溶于水，易溶于苯、氯仿、乙醚、乙醇、冰醋酸，稍溶于甲醇，难溶于Na2CO3和NaHCO3水溶液可溶于NaOH及热水溶液。

2．大黄素（Emodin）

橙黄色长针晶（丙酮中结出者为橙色，甲醇中为黄色），mp256~7℃，能升华，其溶解度如下：

Et2O0.14%，CCl40.01%，CHCl30.0718%，CS20.009%，几乎不溶于水，易溶于乙醇，可溶于NH4OH、Na2CO3和NaOH水溶液。

3．大黄素-6-甲醚（physion）

金黄色针晶。

熔点207℃。

能升华，溶解性质与大黄酚相似。

4．虎杖苷（polygonln）

为大黄素的苷。

结构未明，可能是混合物，浅黄色针状结晶。

203~5℃。

以甲醇、乙醇或乙酸乙酯重结晶时，若急速冷却，呈胶冻状，多次重结晶后慢慢冷却，得浅黄色针状结晶，不溶于乙醚，难溶于丙酮，可溶于热的乙酸乙酯、热的甲醇或乙醇，冷后均较难溶，可溶于NaHCO3水溶液，冷水中溶解度不大。

5．大黄素β—D—葡萄糖苷（Emodinmonoglycoside）

mp190~1℃，为浅色针晶（稀乙醇中结出，含一分子结晶水）。

6．大黄素6—甲醚—8—D葡萄糖苷

mp230~2℃，为黄色针晶（稀甲醇中结出）。

7．白黎芦醇（resveratrol）

无色针状结晶，mp256~7℃，261℃，264℃，能升华，易溶于乙醚、氯仿、甲醇、丙酮等。

8．白黎芦醇葡萄糖苷（polydatin,peceid）

又名3，4，5一三羟基芪—3—B—D—葡萄糖苷，mp225℃，232℃，易溶于甲醇、丙酮、热水，可溶于EtOAC，稍溶于冷水，但可溶于NaCO3和NaOH水溶液，难溶于乙醚。

（附注：

此化合物具顺，反二种异构体，能够互相转化，所得常是二者的混合物，以反式为多，故前人工作中所报导的熔点有所不同，按本实验方法所得的白黎芦醇苷结晶仿呈分子结晶水，在130~140℃时先融化，继续加热又固化，至225~6℃全熔）。

二、实验目的

1．学习用PH梯度萃取法分离本性不同的蒽醌类成分。

2．学习脂溶性成分和水溶性成分的分离方法。

3．了解蒽醌类成分的一般性质和鉴别反应。

三、实验原理

虎杖中的蒽醌类成分由于结构中羧基和酚羟基数目及位置不同而呈现不同强度的酸性，根据此性质，在乙醚萃取出脂溶性成分后，碱度递增的水溶液（5%NaHCO3，5%NaCO3，2%NaOH）自乙醚中提出游离蒽醌类成分，达到分离目的。

本实验涉及的知识点：

溶剂提取法、萃取、pH梯度萃取法、色谱检识、重结晶等。

四、实验流程

TLC，定性反应

五、实验方法

1．乙醇总提取物的制备

取虚仗粗粉200g，用95%乙醇回流提取二次（500ml回流1hr，450ml回流30’）。

合并乙醇液。

放置如有沉淀。

抽滤一次，减压回收乙醇至糖浆状（要求乙醇回收至无醇味。

）

2．总游离蒽醌的提取

将上述提取转移至三角瓶中，加入30ml水，溶解后加100ml乙醚，不断振摇后放置，将上层乙醚倾入另一500ml三角瓶中（切勿将水倒出），或用吸管吸出，瓶中糖浆状物再以乙醚多次萃取，每次萃取的乙醚用量顺序为50ml，40ml×

4，合并乙醚液为总游离蒽醌，乙醚提取的剩余物含水溶性成分，上继续分离，在第4项中做。

3．游离蒽醌的分离

（1）强酸性成分的分离

上述乙醚液移至分液漏斗中，用5%NaHCO3水溶液（测定pH值）取3-4次（40，30×

2），合并碱液，在搅拌下慢慢滴加6NHCl调PH为2。

放置，抽滤，水洗沉淀至近中性，干燥，得深褐色粉末，为强酸性部分。

（2）中等酸性成分——大黄素的分离

以上用NaHCO3取过的乙醚液用5%（测定pH值），取5~9次（40×

3，30×

4）。

碱液用量视碱水层萃取液色较浅为止。

合并碱液。

加浓HCl调PH2。

稍放置。

抽滤。

沉滤以水洗至中性，干燥，称重，用丙酮结晶一次（1：

再用甲醇重结晶（1：

15~20）。

得大黄素结晶。

mp.256~7℃。

（3）弱酸性成分——大黄酚和大黄素6—甲醚的分离

以上用Na2CO3萃取过的乙醚液用2%NaOH（测pH值）萃取4—5次。

每次20ml合并NaOH液。

同

（2）法处理。

干燥后粗品以CHCl3—MgOH（1：

1）重结晶，再用乙醇重结晶。

（4）中性成分——甾醇类化合物的分离

上述NaOH萃取过的乙醚液，用水洗至中性，以无水Na2SO4脱水，回收乙醚得残留物，即得β-谷甾醇粗品。

用甲醇少量溶解β-谷甾醇，作TCL鉴识用。

4．白黎芦醇葡萄糖苷的分离

取“2”中乙醚提取过的糖浆状物，挥去乙醚，置烧杯中加500ml水，搅拌混合后，直火加热20~30’。

倾出上层液，稍冷过滤。

滤液加活性炭煮沸10’。

趁热过滤。

滤液置蒸发皿中。

水浴浓缩至15~20ml。

水液用乙酸乙酯（约30ml）萃取。

回收乙酸乙酯。

5．鉴识

层析法鉴定

（1）游离蒽醌的硅胶GTLC

大黄素甲醚与大黄酚的混合物。

大黄素、大黄素甲醚。

强酸性部分。

苯：

乙酸乙酯（8：

2），石油醚—已烷—甲酸乙酯—甲酸（1：

3：

5：

1，5：

0.1）加0.5ml水，上层。

5%KOH喷色。

（2）甾醇类成分的硅胶GTLC。

β-谷甾醇粗品

β-谷甾醇

环已烷：

丙酮（8：

2）

10%磷钼酸乙醇溶液120℃烘烤数分钟。

定性反应

（1）游离蒽醌的反应

分别取大黄素、大黄素甲醚少许，用乙醇溶解，做如下反应：

A．Borntragor反应，取试液1ml，滴加2%NaOH液观察颜色。

B．Mg（AC）2试验，取试液1ml，加入0.5％Mg（AC）2溶液2～3滴，观察颜色。

（2）甾醇类显色反应

Liebberman-Burchard实验：

取样品少许，加1mL醋酐溶解，加浓硫酸1滴，观察颜色变化（此试验可在蒸发皿或点滴板上进行）。

（3）白黎芦醇苷的呈色反应

取样品少许，用乙醇溶解，做如下反应

A．荧光反应：

将试液滴在滤纸上，在紫外光下观察荧光。

B．三氯化铁一铁氰化钾反应

将试液用毛细管滴在滤纸上，喷上述试剂观察颜色。

C．偶合反应

取试液1ml，加0.5ml5%Na2CO3然后滴入新配制的重氮化试剂1~2滴，观察颜色。

D．Molish反应

取试液1ml，加入等体积的10%α—萘酚乙醇液，摇匀，沿试管壁滴加2~3滴浓H2SO4，观察两液界面颜色。

E．Gibb’s反应

取试液1ml，滴加0.5%2，6二氯苯醌4—亚胺氯化物的乙醇溶液2~3滴，并加Na2CO3调PH10左右，观察颜色（Gibb’s试剂需临用前配制）。

六、思考题

1．PH梯度萃取法的原理是什么？

适用于哪些中草药成分的分离？

2．根据TLC结果，分析各蒽醌类成分的结构与PH值的关系。

3．试说明各显色反应的机制。

4．此实验在操作方面应注意什么？

5．试总结萃取操作程序及注意事项？

6．重结晶操作的关键步骤是什么？

7．过滤方式有几种？

怎样选用？

8．活性炭脱色在什么溶剂中效率最高？

为什么加入活性炭时要求溶液不能太热？

9．试述有机溶剂和溶液的一般浓缩方式。

10．在水与亲脂性有机溶剂萃取时，为什么样品中不能有醇，体会乙醇总提取液浓缩至无醇味一句的意义。

七、参考文献

1．上海药物研究所；

中草药有效成分的提取和分离。

2．中国医科院药物研究所：

中草药有效成分的研究（第一分册）。

3．药学杂志（日）73：

100；

1953

74：

379；

1954

76：

323；

1956

83：

988；

1963

4．中草药通讯2：

6；

1974

5．中药材2：

；

实验三槐花米黄酮苷元的提制和鉴定

槐花米系豆科槐属植物SophorajaponicaL.的花蕾。

历来用作止血药物治疗痔疮、子宫出血、吐血、鼻血等症，其主要化学成分为芦丁（亦称芸香苷Rutin），含量可高达23.5%。

药理证明芦丁有调节毛细血管渗透作用，临床上用作毛细血管性止血药，作为高血压症的辅助用药。

芦丁广泛存在于植物中。

现已发现含有芦丁的植物达70种以上。

由槐米提取芦丁的方法有水或醇浸取法，热、冷碱浸取酸沉淀法，每法各有优缺点。

前者所用时间长，后者有一定水解产物存在。

为克服这些缺点，目前已有超声提取的新技术，利用强力超声波发生“空化”现象瞬间所产生的强大冲击力，使药料组织中的分子在不破坏结构的情况下，更快的与组织剥离，继而分散溶解在溶剂中，从而提高溶出的速度和溶出率。

本实验的提取部分用超场提取新技术和传统的水煎煮提取两种方法进行提取并对提取效率。

一、主要黄酮类成分的物理性质

1．芸香苷（Rutin）

淡黄色针状结晶，熔点：

含三分子结晶水物174~178℃，无水物为188℃。

溶解度：

溶剂

溶解度（%）

注

水

MeOH

EtOH

吡啶

冷

0.0013

1.0

0.36

8.5

热

0.55

11.2

3.5

易溶

不溶于乙醚、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、丙酮等溶剂。

易溶于碱液中呈黄色，酸化后复析出。

可溶于浓硫酸和浓盐酸呈棕黄色。

加水稀释后又析出。

2．槲皮素（quercetin）

黄色结晶。

熔点：

含两分子结晶水物313~4℃。

无水物316℃。

乙醇1：

290，无水乙醇1：

23（沸时）。

可溶于MeOH、EtOH、冰HAc、吡啶、丙酮等溶剂。

不溶于水、乙醚、苯、氯仿、石油醚。

1．通过两种提取芦丁方法的对比，了解超声提取的新技术。

2．了解黄酮类化合物的一般性质。

3．学习聚酰胺TLC法在黄酮类化合物中的应用。

4．掌握由黄酮苷水解制取黄酮类苷元的方法。

5．通过测定芦丁槲皮素的紫外光谱，进一步了解如何利用紫外光谱对黄酮类化合物进行结构测定。

1．利用芦丁可溶于热水，难溶于冷水及易溶碱水、难溶难水的性质进行提取。

2．黄酮苷可通过酸水解，得到苷元及糖，并可通过TLC、PC及乙酰化物制备进行鉴识。

3．不同类酮类化合物对紫外光有特定吸收，可利用此特点对其进行定性、定量测定。

4．本实验涉及的知识点：

超声提取、重结晶、聚酰胺色谱、水解法测定苷的结构等。

1．芦丁的提取

称取槐花米30g，研碎后投入70℃石灰水中，迅速搅拌均匀，调控PH10~11，浸润20min，然后超声提取30min（保持PH不变）二次，合并过滤液，以盐酸酸化至PH4~5，放置，滤取沉淀即得芦丁粗品。

2．芦丁的精制

上述沉淀称重后（湿品）加入30~40倍量的热水溶解，趁热过滤，放冷析出结晶、过滤、结晶自然干燥（或在红外灯下干燥），得芦丁精品。

再取1g芦丁水精制品用MeOH重结晶（1：

10~15）得芦丁精品。

3．芦丁的水解

称取芦丁水精制品1g，置250ml圆底烧瓶中加1%H2SO4100ml直火回流30min（注意观察现象）。

放冷过滤（滤液留作糖的检识）。

沉淀物为芦丁苷元——槲皮素的粗品。

用甲醇重结晶。

干燥称重，得槲皮素精品。

4．糖的检识

取芦丁水解后的滤液20ml。

加Ba（OH）2，溶液（或固体BaCO3）中和至中性，不断搅拌下进行。

滤去白色的BaSO4沉淀。

滤液浓缩至2~3ml作纸层析的样品溶液。

条件：

鼠李糖、葡萄糖

n—BuOH—HAc—H2O（4：

1：

5）上层液

苯胺——邻苯二甲酸盐试剂，喷后在105℃加热5-10’。

5．芦丁及槲皮素的聚酰胺层析

1%芦丁、槲皮素甲醇液

80%乙醇

显色方法：

用浓氨水或1%AlCl3醇溶液显色后，日光及荧光灯下观察。

6．槲皮素乙酰化物的制备及熔点测定

称取精制槲皮素150mg置25ml三角瓶中。

加10ml醋酐和一滴浓H2SO4振摇，完全溶解后放置24hr，倾入60ml冷水中，不断搅拌，至油滴消失，则板出白色沉淀，滤取沉淀并洗涤，以95%乙醇重结晶。

得槲皮素五乙酰化物的白色结晶。

mp.193℃。

7．芦丁及苷元的定性反应

A样品制备：

取芦丁及槲皮素精制品少许用MeOH溶解。

B定性试验：

取上述两试液1ml分别量小试管中，按下列方法进行试验。

比较苷与苷元的反应情况。

①Molish反应

加10%α—萘酚溶液1ml，振摇后斜置试管。

沿管壁滴加0.5ml浓H2SO4静置观察液面交界处颜色变化。

②盐酸锌粉（Mg粉）

芦丁（槲皮素）分别于2支试管中加浓HCl，再各加入Mg粉和锌粉，观察颜色变化。

③FeCl3反应

分别加FeCl3醇溶液1—2滴，观察颜色。

④Mg（Ac）2纸片反应

取三张滤纸条，分别滴2滴芦丁，槲皮素甲醇溶液，然后各加1%Mg（Ac）2甲醇溶液2滴。

于紫外灯下观察荧光变化。

⑤AlCl3纸片反应

2条纸片上分别滴加芦丁、槲皮素后，各加1%AlCl3乙醇溶液2滴，紫外灯下观察荧光变化。

⑥锆盐——柠檬酸反应

分别加入2%ZrOCl2甲醇溶液3~4滴，观察颜色，然后加入2%柠檬酸甲椁溶液3~4滴，观察颜色。

8．槲皮素的碱降解

称取槲皮素50mg，置50ml磨口三角瓶中，依次加入10mlH