马铃薯快速繁殖实验报告参考模板Word格式.docx
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由于不受季节和灾害性气候的影响，材料可周年繁殖。
生长速度快，材料能以几何级数增殖。
②培养条件可控性强。
培养材料完全是在人为提供的培养基质和小气候环境条件下生长，便于对各种环境条件进行调控。
③占用空间小。
一间30m2的培养室可同时存放1万多个培养瓶，培育数十万株苗木。
④管理方便，利于自动化控制。
培养材料在人为环境中生长，省去了田问栽培的一些繁杂劳动，并可利用仪器进行自动化控制，便于工厂化生产。
⑤便于种质保存和交换。
通过抑制生长或超低温贮存的方法，使培养材料长期保存，并保持其生活力，既节约了人力、物力和土地，还防止了有害病虫的传播，更便于种质资源的交换和转移。
（2）马铃薯是高度杂合的，因此它们的种子后代不可能与原种完全相同。
只有由无性繁殖产生的植株，在遗传上才能与其亲本植物完全相同，从而使品种的特性代代相传。
利用植物组织培养技术，在无菌条件下对外植体进行离体培养，使其短期内获得遗传性一致的大量再生植株的方法称为植物离体无性繁殖。
马铃薯试管苗在光照条件下进行自养的程度大于异养。
相反，在高浓度的糖类存在的情况下，以及在无光照的限制条件下，马铃薯向着诱导生成试管薯的过程。
这样生长出来的试管薯称之为原种种薯。
（3）短枝发生型是指外植体携带的带叶茎段，在适宜的培养环境中萌发，形成完整植株，再将其剪成带叶茎段，继代再成苗的繁殖方法。
该方法与田间枝条的扦插繁殖方法类似，故又称为微型扦插。
能一次成苗，遗传性状稳定，培养过程简单，移栽成活率高。
许多花卉、葡萄、马铃薯等试管苗的繁殖常用此方法。
（4）在黑暗环境的诱导下，马铃薯试管苗可以在试管薯诱导培养基中结出种薯，且悬于茎秆上。
马铃薯试管薯是利用茎尖分生组织脱毒技术，在组织培养条件下高倍扩繁脱毒试苗，进而诱导试管苗所形成的块茎。
试管薯具有无病原、体积小、贮藏运输方便、能工厂化周年生产，从而为马铃薯优良种质的保全提供了一条理想的途径。
（5）培养基是植物离体培养组织和细胞赖以生存的营养基质。
配制培养基时，为了减少试剂称取时的工作量和少量称取时出现的误差，以及避免多种营养成分混合导致沉淀产生或相互反应而失去培养效果，预先要将各种营养成分配制为一定倍数的培养基母液，待使用时稀释到要求的浓度。
母液的浓度为培养基浓度的10倍、100倍或更高。
将事先配制好的培养基母液按一定比例稀释至浓度为培养基中规定的使用浓度，再加入琼脂、蔗糖、生长调节物质等，制备成符合要求的培养基。
（6）利用适宜的培养基，诱导带有腋芽的马铃薯单节茎段进行芽生长和根再生形成单苗，从而达到快速繁殖的目的。
（7）培养基配方设计：
①根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。
②确定培养基中各种激素的浓度及相对比例。
本实验中马铃薯试管苗快速繁殖培养基
培养基的配方如下：
MS培养基+C30g/L+A7g/LPH5.8
2.实验流程
（1）实验总体流程
（2）母液配制流程
（3）马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制流程
三实验设备及材料
1.实验设备
果酱瓶、500mL搪瓷杯、三角瓶、烧杯、容量瓶、玻璃棒、25mL量筒、1mL和5mL移液管、洗耳球、PH试纸、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、普通电子天平、酒精棉球、小块纱布、灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、超净工作台、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、电磁炉、记号笔。
2.药品和试剂
（1）母液配制：
硝酸铵、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸铜、氯化钴、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸吡哆素、烟酸、肌醇、2,4-D（2,4-二氯苯氧乙酸）、NAA（
α-萘乙酸）、6-BA、浓盐酸、氢氧化钠、95%酒精、蒸馏水、75%酒精等。
（2）马铃薯快速繁殖培养基及诱导培养基的配制：
事先配好的MS基本培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol·
L-1HCl、1mol·
L-1NaOH等。
3.实验材料：
马铃薯脱毒苗
四实验方法步骤及注意事项
实验步骤：
（一）MS培养基母液和常用试剂的配制与保存
1.大量元素母液的配制
MS培养基中的9种大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2•2H2O、MgSO4•7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制的步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
注意：
CaCl2•2H2O最后加入
母液
种类
成分
规定
用量/mg.L-1
浓缩倍数
称取量/mg
母液定容体积/mL
配1LMS培养基吸取量/mL
大量元素
KNO3
1900
20
38000
1000
50
NH4NO3
1650
33000
CaCl2.2H2O
440
8800
MgSO4.7H2O
370
7400
KH2PO4
170
3400
2.微量元素母液的配制
MS培养基中的微量元素可由MnSO4•4H2O、ZnSO4•7H2O、H3BO3、Na2MoO4•2H2O、KI、CuSO4•5H2O、CoCl2•6H2O几种无机盐来供应，它们也可配在同一母液中（具体配制见下表）。
配制步骤同大量元素（混合时不要求先后顺序）。
母液种类
规定用量/mg.L-1
微量元素
MnSO4．H2O
16.9
200
3380
5
ZnSO4.7H2O
8.6
1720
H3BO3
6.2
1240
KI
0.83
166
Na2MoO4.2H2O
0.25
CuSO4.5H2O
0.025
CoCl2.6H2O
3.有机成分母液的配制
MS培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制（具体配制见下表）。
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→溶解→定容→装瓶→贴标签→放入冰箱保存。
亦可配制成混合母液（不主张采用）。
母液种类
成分
配1L培养基吸取量/mL
有
机
成
分
甘氨酸
2.0
200
100
250
盐酸硫胺素
0.1
5
盐酸吡哆素
0.5
25
烟酸
肌醇
5000
4.铁盐母液的配制
铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为：
确定母液的浓度和体积→计算各种化合物用量→称量→分别溶解→混合→煮沸数分钟→调节pH值至5.8→定容→装瓶（棕色）→贴标签→放入冰箱保存。
用时每配lL培养基取该溶液5ml。
规定
用量/mg.L-1
铁盐
Na2EDTA.2H2O
37.3
3730
500
FeSO4.7H2O
27.8
2780
5.植物生长调节物质母液的配制
对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用mg·
ml-1或ppm较为方便，一般配制成0.1-1mg·
ml-1的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶。
2,4-D/NAA用少量95％酒精溶解，再加水定容；
6-BA/KT应先溶于少量1mol·
L-1的HCl中，再加水定容。
具体配制见下表：
称取量（mg）
母液定容体积（mL）
母液浓度（mg/mL）
生长素
2,4—D
50
NAA
细胞分裂素
6-BA
10
KT
6.其它常用试剂的配制
盐酸（lmol·
L-1）：
用浓度36.5%、密度1.19g/cm3的浓盐酸配制
氢氧化钠（lmol·
用固体氢氧化钠配制
75%酒精（v/v）：
用95%的酒精来配制
稀铬酸洗涤液：
重铬酸钾50g溶于1000ml蒸馏水中，冷却后缓慢加入工业用硫酸90ml。
配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期。
母液最好在2～4℃的冰箱中保存。
尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严。
贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用。
（二）马铃薯试管苗快速繁殖培养基的配制
基本配方：
MS基本培养基＋0.7％琼脂＋3％蔗糖（每小组配制0.5L）
（１）根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂（3.5g），放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
（２）MS基本培养基配置：
（配置前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。
大量元素母液：
25ml；
微量元素母液：
2.5ml；
铁盐母液：
有机物母液：
各2.5ml。
混匀。
（３）待琼脂完全溶解后，加入规定用量的蔗糖（15g），继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，再加入所需用量的母液（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。
（4）调节培养基的酸碱性至pH5.8：
由于培养基的pH值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大影响。
此外，琼脂培养基的pH值还影响到凝固情况。
所以，当培养基配制好后应立即进行pH值的调整。
最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH试纸。
培养基若偏酸时用lmol·
L-1NaOH来调节，偏碱则可用lmol·
L-1HCl来调节。
一般来说，当pH值高于6.0时，培养基将会变硬；
pH值低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。
（5）培养基的分装：
配制好的培养基要趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注。
试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的1/4～1/3为宜，果酱瓶每瓶20～30ml，太多既浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；
太少又会因营养不良影响生长。
培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。
本次实验中500ml分装到10个果酱瓶，每人两瓶，剩余两瓶备用。
（6）培养基的灭菌：
培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌。
消毒灭菌时，压力表读数约为1.06kgf·
cm-2或0.105MPa（可在0.105～0.12MPa间，但不得超过0.14MPa），温度121℃时保持15～30min左右即可。
为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
排净冷空气的办法有两种：
A、可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；
B、也可采用先关闭放气阀，待压力升到约0.04MPa，温度超过108℃时打开放气阀排出空气，待压力表指针回到0时再关闭放气阀。
（三）马铃薯试管苗的接种和快速繁殖
A、准备工作：
①接种室的清洁和消毒
②超净工作台的开机和消毒
③剪刀、镊子、已灭菌培养皿、酒精棉球、酒精灯、待用培养基等的准备
④实验材料的准备。
B、马铃薯试管苗单节茎段繁殖无菌操作：
①实验操作前，操作人员洗手及手和小臂消毒。
②使用的镊子、解剖刀等用95％酒精浸泡，之后放在酒精灯上灼烧灭菌，再放在灭菌后的培养皿中冷却后使用。
③培养瓶外壁用酒精拭擦消毒
④将马铃薯试管苗剪为单节茎段后接种到培养基中，在植入材料的前后，培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌。
⑤封口、标记、将培养瓶置于培养架上，在温度20-25℃，光照强度2000-3000lx，光照时间14-16小时/天的条件下培养。
⑥观察：
2-3周之后每个茎段上都已生根长芽，随后苗逐渐长高，叶片数目增加。
为下一步微型薯诱导提供足够材料。
与此同时，培养基也越来越少。
（四）马铃薯试管薯诱导培养基（条件培养基）的配制
A培养基配方及配制体积：
MS基本培养基＋3mg/mL6-BA＋8％蔗糖（每小组配制0.5L）采用固液培养法诱导。
结薯率=总结薯个数/植株总数×
100%
单薯的重量=总重量/总薯数*100%
B培养基配制:
（１）MS基本培养基配制：
（配制前先检查各母液情况，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用）。
有机物母液；
（２）0.5mg/mL6-BA取3ml，或是1mg/mL6-BA取1.5ml
（３）根据需要配制的培养基的量称取40g蔗糖放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水（估计加入母液后不超过配制总量）置于电磁炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动。
再加入所需用量的母液和植物激素（可事先取好放于一烧杯中），最后加蒸馏水至所需体积，即500ml。
（4）调节培养基的酸碱性至pH6.2
配制好的培养基500ml分装到10个三角瓶（100ml），每人两瓶，剩余两瓶备用。
培养基分装完后，用不透气的封口膜封严瓶口，并用棉线扎紧。
（五）试管薯诱导
A.准备工作：
（1）接种室的清洁和消毒
（2）超净工作台的开机和消毒
（3）实验材料（已培养5周的马铃薯快繁试管苗）的准备。
B.马铃薯试管薯的诱导：
（1）在无菌条件下，在超净工作台内严格按无菌操作步骤要求，打开马铃薯培养基，将液体微型薯诱导培养基倒入果酱瓶中，封口。
（2）更换培养基后，将果酱瓶放在室温25-27℃完全黑暗的条件下静止培养，不需要摇动或者摆动。
（六）马铃薯幼苗的移栽
（1）将培养瓶从培养室中移出，把生根发育良好的马铃薯幼苗从培养瓶中取出，洗去根部残留的培养基质。
（注意保留根的完整性，以便于提高移栽的成活率）
（2）把洗净后的马铃薯幼苗移栽到无病虫害的土壤基质中。
（3）控制光照强度、及温度、湿度，定期观察马铃薯生长状况，并记录数据。
注意事项
1.玻璃器皿的洗涤和天平的使用。
2.配制大量元素时溶液的混合。
混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。
同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。
3.铁盐的配制。
要先将Na2EDTA•2H2O和FeSO4•7H2O分别加热溶解后再混匀。
4.注意培养基配方中各组分的含量
5.灭菌需注意事项：
1）灭菌前检查锅内是否有足够的水。
2）装锅不可过满。
3）为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。
4）培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；
否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固。
5）当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基。
切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员。
6）在实验过程中注意无菌操作的要点，培养瓶外壁的消毒以及培养瓶的瓶口须在酒精灯火焰上烧烤灭菌，封口膜一定要绑好。
6.扦插的无菌马铃薯苗要适当的深度，不要过深也不要过浅。
7.在单节茎段繁殖过程采用的是光照培养，在微型薯的诱导是在黑暗条件下培养的。
8.接种时注意倾斜瓶口，以免带入病菌，引起污染。
接种时切勿倒插马铃薯的单节茎，若不小心倒插，单节茎短期内虽不会死亡，但因违背了植物的生理性极性，因此不会生根。
9.在马铃薯脱毒试管苗的快速繁殖，在选取枝条时必须注意每个枝条要留一个芽，这样才能正常进行生长。
10.将培养瓶从培养室中移出，把生根发育良好的马铃薯幼苗从培养瓶中取出，应洗去根部残留的培养基质。
五实验现象与结果
实验结果记录表：
马铃薯试管苗培养情况：
（已培养5周）
总接种瓶数
2瓶
总接种茎段数
一瓶5根，一瓶5根
污染瓶数
0瓶
未污染瓶数
生长情况
根分生多，白色，粗短，且有结节状膨大，叶片多片呈墨绿色。
苗茎长势情况良好。
马铃薯试管薯诱导结果（条件培养基培养七周）
实验结果
苗株
1
2
3
4
6
7
高度（cm）
1.8
3.7
3.1
4.2
3.5
3.0
5.2
叶片数
8
长势
良好
共接种茎段数10，有7根茎段正常生根，且瓶内无菌污染，但有三根茎段未能正常的生长，可能的原因：
1.由于扦插时，违背了其形态学特性，故不生根。
2.由于扦插时，用力太大，把马铃薯茎段插入培养基太深，以至于不能生根。
六对实验现象、实验结果的分析及其结论
1、光照对苗的快繁影响较大。
中期观察发现，苗未直立生长，且整体向一个方向倾斜，有较明显的向光生长趋势。
后期对培养瓶移位，改变捕光方向和位置后，有明显改善。
这是由于培养架内各处光照不均匀，以至偏向角落的苗向光生长。
2、马铃薯试管苗快繁过程中发现，有些同学的苗始终不长高，且不生根。
这是由于扦插时，违背了其形态学特性，故不生根。
3、避光才能诱导微型薯的产生。
在培育过程中，不时会有同学打开挡光布，甚至直接将培养瓶拿出来观察，这对试管薯的诱导是及其不利的。
4、有些同学快繁培养基耗尽后未及时更换或补充新的培养基，以致快繁苗因营养缺乏而死。
七实验总结
通过本次实验，我能能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂，巩固相关理论基础知识；
掌握配制培养基的步骤，能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方；
熟悉了马铃薯快繁培养基及试管薯诱导培养基的配置方法，移栽的过程和原理，掌握马铃薯幼苗移栽的技术和操作方法，进一步掌握无菌操作技术。
实验过程中仍然有许多的不足之处，但这次试验还是比较成功的，快繁和移栽后的马铃薯幼苗长势良好，此外，在培养基的配制过程中，小组成员合理分工，各行其职，严谨认真，时刻不忘小组利益，尽最大努力避免实验差错，这也是我们本次实验取得成功的基础之一。
总之，通过本次实验，我们学到了很多操作技能，体会到了小组合作的重要性。
最重要的是，本次实验使我们树立了正确的科学观，实验态度也大有改观了。
八参考文献
（1）植物组织培养教程李俊明朱登元中国农业大学出版社2005.9
（2）植物组织和细胞培养中国科学院上海植物生理研究所细胞室上海科学技术出版社1978
（3）植物细胞工程实验技术孙静三桂耀林北京科学出版社1995
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