蛋白表达纯化实验步骤Word文档下载推荐.docx

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离心。

沉淀为包涵体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出，尽量不要倒出沉淀。

（此时可以测量一下pH值，pH值最好在7.5左右。

平衡buffer的pH是7.8左右，裂解后上清就会在7.5左右。

）

9、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。

将1ml镍柱吸入空层析管中，待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上，并将过柱的样品重复上样3次。

（若是流速慢可以在柱子下面加一个针头，或者用1ml的枪将胶体吹散。

）取20μl过柱后的样品，以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。

每个梯度分别的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。

每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中，以备跑胶。

理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度，直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。

实际上测不到零，怎么都会有一点的，上面说的量已经做够洗脱了。

4）加ElutionBuffer将目的蛋白洗脱。

上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP管，再将后面的4ml接入另外两个EP管），留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。

MES加10ml，流完后再加10mlMiliqH2O。

流完后保存于2倍体积的20%乙醇中，镍柱至少能重复利用6次。

（尿素可能对NI柱有损伤。

所有溶液使用前都要确定其pH是否正确，pH对挂柱及洗脱影响较大。

镍柱所用溶液MES的ph=5.0，其余EquilibrationBufferpH=7.8，上清pH=7.5，WashBufferpH=7.0，ElutionBufferpH=7.2。

10、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶，把所有的样品都加上去，注意两块胶的浓分离比要相同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序：

负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右，160V分离样品50min左右。

（也可以300V,30min，只是图没有160V好看。

4）考马斯亮蓝染色。

一般染色2h即可。

5）脱色。

先用脱色剂1脱15min，再用脱色剂2脱过夜。

11、纯化上清---收集目的蛋白

1）将重生的镍柱再次平衡（即加EquilibrationBuffer3ml）。

2）重复步骤12中的操作，只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

12、跑胶验证。

同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V），保存好。

13、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1），并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min，用MILIQH2O充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢），将洗脱的蛋白样品加入其中，置入提前预冷的500ml透析液（20mMPBS+50mMNaCl）中。

冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°

冰箱1.5h后换液。

透析3次即可。

用广口瓶装透析液，将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。

冰浴以防活性降低。

14、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中，用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除，加入新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次，一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4）透析袋用完后，洗净，保存于20%乙醇中4°

存放。

浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现，由于透析袋使溶液成薄层状，透明度较高，不易发现小颗粒或絮状沉淀，要看仔细。

如果看不到，可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。

用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉，吸取其中的溶液分装后-20度保存。

15、超滤法浓缩、透析蛋白。

使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4mlElution得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2）配平。

3）7400g，30min，4°

离心，结束时4ml变为1ml左右。

浓缩4倍。

可根据需要选择不同的离心时间，以达到不同的浓缩倍数。

可以几次的Elution液一起浓缩。

4）加入需要的蛋白储存液至4ml，离心。

重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋白储存液。

蛋白储存液一般用20mMPBS+*mMNaCl或适当浓度和pH的tris-HCl溶液。

如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

5）收集。

将溶液从超滤管中收集到EP管中，标记好储存液的成分，蛋白名称，蛋白浓度（测量后），制备日期。

超滤管的使用方法见附件4

16、蛋白浓度测定。

见附件3

17、蛋白活性测试。

转染细胞测量荧光。

18、抗原处理。

蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

19、注射兔子。

选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

20、收集免疫血清。

提取抗体。

21、抗体效价评定。

附件1

所需溶液配方：

1）20mMPBS:

20mMsodiumphosphate,300mMNaClpH7.4

试剂名称

NaH2PO4-2H2O

Na2HPO4-12H2O

NaCl

用量（g）1L

0．5928

5.802192

17.532

2）EquilibrationBuffer（平衡缓冲液）:

PBSwith10mM咪唑pH7.4

3）WashBuffer（清洗缓冲液）:

PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH7.4

4）ElutionBuffer（洗脱缓冲液）:

PBSwith250mM咪唑pH7.4

5）MES（再生缓冲液）:

20mM2-（N-morpholine）-ethanesulfonicacid,0.1Msodiumchloride;

pH5.0。

即0.3904gMES+0.5844gNaCl.

6）透析袋处理液：

2%（w/v）碳酸氢钠和 

1 

mmol/L 

（pH8.0） 

EDTA

7）透析液：

20mMPBS+50mMNaCl（2.92g）

2.92g

TIPS:

1—4的溶液可以一起配制。

先配10ml8M的咪唑。

再配1L的PBS，用500ml水将试剂溶解，取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中，作为WashBuffer、ElutionBuffer和EquilibrationBuffer，再向其分别加入适当体积的8M咪唑。

最后，定容。

WashBuffer、ElutionBuffer各配了100ml，EquilibrationBuffer配了300ml。

PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1.摇10ml菌，加0.5%葡萄糖和相应抗性。

培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心,在原来LB中直接加IPTG）。

在离心前取500μl菌液作为负对照，诱导完成后取500微升作为正对照。

正负对照不用超声波裂解，直接煮沸10min跑胶。

2.诱导完成后，用2mlEP管6000rpm，2min，4度，收集10ml菌液。

1.5mlPBS（50mMPBS,300mMNaCl）重悬细菌。

3.裂解细胞。

用超声波破碎细胞直到悬液变清亮，一般15到30min。

裂解3s，停止6s，裂解时冰上放置。

4.分离上清。

5000rpm，4min，4°

除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。

然后，10000rpm，10min，4度。

取上清于新的1.5mlEP管中。

取其中的20微升于200微的EP管中，加5微5*SDSloadingbuffer混匀，煮沸10min。

5.重悬包涵体。

用1000微PBS震荡重悬包涵体，取20微于200微的EP管中加5微5*SDSloadingbuffer，煮沸10min。

6.正负对照的收集。

离心收集正负对照菌体，0.5ml上清留下40μl,加入10μl5*SDSloadingbuffer,煮沸10min裂解。

7.跑聚丙烯酰胺凝胶。

将正负对照及实验样品一起跑胶。

一般顺序是:

-,+,上清,包涵体.

附件3

蛋白浓度定量测试方案

1．将染色剂稀释。

稀释5倍，取4ml染色剂于50ml离心管中，加16mlmiliqH2O.充分溶解后用0.44μm的滤膜过滤于另50ml离心管中。

（此剂量可测4个样品。

2．牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备

1）将冻干的BSA溶于去离子水中，溶解成浓度为1mg/ml，分装为400-500μl/支（可以室温放置60天，-20度长期保存）。

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml，各180μl，另外加一管水为零对照。

浓度

0.2mg/ml

0.4mg/ml

0.6mg/ml

0.8mg/ml

BSA（1mg）

36μl

72μl

108μl

144μl

H2O

3．染色。

1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。

4个梯度各做一个重复，共8支，另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank，共10支EP管（或10+n支），分别对应标记。

2）将30μl样品和30μl标准BSA及30μlH2O分别加入上述EP管中。

涡旋混匀。

3）室温孵育5min到60min。

5min后即开始测量，在60min内测完，越快越好，因为Absorbancewilincreaseovertime。

4.吸光度的测量。

600nm处测量，并记录吸光度。

1.blank是染色液加30微升的水。

2.从低浓度测量到高浓度。

根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围，据此决定sample的测量顺序。

5.比色皿的洗涤。

用100%乙醇浸泡洗涤。

6.标准曲线的制作。

利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.

4mlmillipore超滤离心管使用注意事项

1.用前用miliq水润湿。

2.4度预冷。

3.离心力不能超过7500g。

加速度设定为8.

4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心，以使两膜所受的压力一致。

5.使用完毕后，用miliq水洗净，加入1ml0.1NNaOH泡24h，后加入1ml20%乙醇保存。

如果要短期保存几天，也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备及使用方法

附件6.

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处：

在EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中各加了6M尿素或盐酸胍。

尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。

在裂解完后，离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片，再10000rpm15min离心，沉淀就是包涵体。

用加了6M尿素或盐酸瓜的EquilibrationBuffer溶解包涵体。

后面的步骤跟提上清蛋白一致，只是所用EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中都含有6M尿素或盐酸胍。

另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀，影响跑胶。

这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。

如果要做包涵体，建议用尿素做，因为盐酸胍的毒性较大，必须除去，除去后蛋白可能就析出了。

尿素毒性相对较小，可以不用除去。

这样可以省去很多麻烦。

尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好，较难溶解，可以用超声波破碎仪帮助溶解：

6mm变幅杆，15%功率，3s/6s，10min左右即可。

也可以加上1%---5%的甘油助溶。

甘油是加在EquilibrationBuffer中的。

另外，做包涵体可以直接37度快速摇菌，无需低温，加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl100%乙醇，乙醇要-20度预冷，涡旋。

2、-20度放置10min。

4度，15000rpm，10min，小心弃去上清，尽量去干净。

此时管底可见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl1.5*SDS-loadingbuffer。

（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。

4、上样，跑胶。

如有错误，敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后，室温自然凝固后立即4500g，10min离心，分离出血清。

抗血清保存有三种方法：

第一种是4℃保存，通常可保存3个月～半年，效价高时可保存一年左右；

第二种是-20℃～-40℃低温保存，可保存5年左右，但需防止反复冻融；

第三种是真空冰冻干燥保存，可保存5～10年。

耳缘静脉采血，为防止溶血请勿吸取流到外面的血，直接从静脉吸取的血液不会溶血。