活性氧在酿酒酵母乙醇胁迫中的作用Word文档格式.docx
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Abstract
Saccharomyces
cerevisiaeisastrainusedtoproduceethanolandisappliedintheproductionofethanolfuelandbrewingindustry.Saccharomyces
cerevisiaeisatranditionalyieldethanolstrain,butissensitivetothehighconcentofethanol.Excessiveaccumulationofenthanolcouldinhibitthegrowthandactivityofcells,inducereactiveoxygenspecies，therebyleadtoadamagetoyeastcells.Autophagyisanimportantdegradationpathwayformaintainingthebalanceandmattercycleineukaryoticcells.Althoughwehaveacertainamiyntresearchonethanolstress,themechanismofethanolstressinSaccharomyces
cerevisiae,whichROSplaysaleadingroleunderethanolstress,whetherautophagyisinvolvedinethanolstreesandwhatroleautophagyhasinethanol.Theaboveproblemsarenotyetclear.
TounderstandwhichROShasanimportantroleinethanolstress,SaccharomycescerevisiaefromAngelYeastwasastheexperimentalmaterialinthiswork,westudiedtheeffectofreactiveoxygenspecies（ROS）onSaccharomycescerevisiaegrowthandfermentationunderethanolstress,throughdetectingphysiologicalindicatiorsincludingcellgrowth,themembraneintegrity,superoxideanion（O2·
-）conctent,hydrogenperoxide（H2O2）content,malondialdehyde（MDA）,carbonylcontentandsoon.Theresultshowedthatethanolcouldinhibitthegrowthofyeastcellsinthelogarithmicphase,damagethemembranceintegrity,risethelevelsofO2·
-andH2O2,increasethecontentofMDA（theproductofLipidperoxide）.WeusedexogenousGlutathione（GSH）,Methionine（Met）andN-acetylcysteine（NAC）treatedethanolstressedSacchayomycescerevisiaerespectively,andfoundthattheycouldreducedthelevelO2·
-andH2O2,increasedcellsactivityanddecreasedtheconcentofMDA.ThisindicatesthaethanolcouldinducethegenerationofO2·
-andH2O2,ledingtotheoxidativestress,resultinginthedamagetoyeastcells.Whenthegrowthinhibitedserious,ethanolevencouldleadtothedeath.GSHandMet,NACcouldcleartheexcessofROS,reducetheyeastdamagecausedbyethanolstressandimprovetheethanolyield.
InordertounderstandwhetherautophagywasinvolvedintheethanolstressintheS.cerevisiaeaswellasitwasrelatedwithROS,weused3-MA（autophagyinhibitor）andrapamycin（autophagyinducer）totreatethanol-stressedSaccharomycescerevisiae,themembraneintegritywasbyPIstaining,thelevelofO2·
-andH2O2wasdetectedbyROSfluorescentprobeDHEandDCFH-DAstaining.Theresultsshowedthat3-MAcouldreducetheinhibitionofethanolonyeastcells,improvethemembaneintegrity,reducethelevelsofO2·
-andH2O2.Butrapamycincouldfurtherdeepenthecolonyinhibition,reducethemembraneintegrity,improvethelevelsofO2·
-andH2O2.ThisindicatesthatautophagyinvolvesinSaccharomycescerevisiaeethanolstressbyregulatingthelevelofROS,andplaysaroleofmaintainingcellsurvivalinethanol-stressedSaccharomycescerevisiae.
Keywords:
cerevisiae；
ethanolstress；
autophagy；
ROS
缩略词
英文缩写
英文全称
中文名称
BSA
Bovineserumalbumin
牛血清白蛋白
Cvt
Cytoplasmtovacuoletargeting
细胞质到液泡途径
DAB
3,3´
-Diaminobenzidine,tetrahydrochloride
3，3’-二氨基联苯胺四盐酸盐
DCFH-DA
2′,7′-Dichlorodihydrofluoresceindiacetate
2’，7’-二氯荧光素二脂
DHE
Dihydroethidium
二氢溴化非啶
DMSO
Dimethylsulfoxide
二甲基亚砜
DNPH
2,4-Dinitrophenylhydrazine
2,4-二硝基苯肼
EDTA
Ethylenediaminetetraceticacid
乙二胺四乙酸
GSH
Glutathione
谷胱甘肽
Met
Methionine
蛋氨酸
3-MA
3-Methyladenine
3-甲基腺嘌呤
NAC
N-acetylcysteine
N-乙酰半胱氨酸
NBT
Nitrobluetetrazolium
氯化硝基四氮唑蓝
O2·
-
Superoxideanion
超氧阴离子
PAS
Thephagophoreassemblysite
自噬体组装位点
PBS
Phosphatebuffersolution
磷酸缓冲液
PMSF
Phenmethylsulfonylchlorine
苯甲基磺酰氯
Reactiveoxygenspecies
活性氧
rpm
Roundsperminute
每分钟转速
SAM
S-Adenosylmethionine,
腺苷蛋氨酸
SDS
Sodiumdodecylsulfate
十二烷基硫酸钠
TBA
2-Thiobarbituricacid
硫代巴比妥酸
TCA
Trichloroaceticacid
三氯乙酸
Tris
2-AminoAmino-2-（hydroxymethyl）-1,3-propanediol
三羟甲基氨基甲烷
Triton-X-100
曲拉通100
目录
第一章前言1
1.1乙醇对酵母的影响1
1.1.1乙醇对酵母的毒害作用1
1.2活性氧2
1.2.1活性氧的危害3
1.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统4
1.3自噬6
1.4研究内容及目的、意义7
第二章材料与方法8
2.1实验材料、仪器和试剂8
2.2实验主要试剂9
2.2.1实验所用培养基配方9
2.2.2蛋白含量测定试剂配方10
2.2.3荧光试剂配制10
2.2.4自噬相关试剂配制11
2.3实验方法11
2.3.1生长情况检测11
2.3.2粗裂解酶液的制备12
2.3.3点菌落实验12
2.3.4总蛋白含量测定12
2.3.5存活率测定13
2.3.6酒精含量测定13
2.3.7膜完整性测定14
2.3.8H2O2含量测定14
2.3.9O2·
-含量测定（DHE法）15
2.3.10O2·
-含量测定（NBT法）15
2.3.11膜脂过氧化水平测定15
2.3.12线粒体膜电位检测………………………………………………………………15
第三章结果与分析17
3.1乙醇对酿酒酵母生长发育的影响17
3.2乙醇胁迫对酿酒酵母细胞膜完整性的影响18
3.3GSH、Met和NAC对乙醇胁迫酿酒酵母的影响19
3.3.1对乙醇胁迫酿酒菌落形态的影响19
3.3.2对乙醇胁迫酿酒酵母细胞膜完整性的影响20
3.3.3对乙醇胁迫酿酒酵母线粒体膜电位的影响22
3.3.4对乙醇胁迫酿酒酵母中ROS的影响24
3.3.5对乙醇胁迫酿酒酵母中MDA含量的影响28
3.3.6对乙醇胁迫酿酒酵母中乙醇产率的影响………………………………………..28
3.4自噬在乙醇胁迫中的作用29
3.4.1自噬对酵母菌落形态的影响……………………………………………………..29
3.4.2自噬对膜完整性的影响32
3.4.3自噬对ROS的影响33
3.5讨论35
3.5.1ROS增加是乙醇胁迫抑制酿酒酵母生长的主要原因35
3.5.2Met可以恢复乙醇对酿酒酵母的损伤36
3.5.3自噬通过减少ROS降低乙醇胁迫损伤36
第四章结论37
参考文献38
致谢41
个人简历43
第一章前言
1.1乙醇对酵母的影响
酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）是一种重要的工业微生物，由于其在发酵工业中的广泛应用，导致国内外很多学者将其对环境胁迫因素的反应作为研究重点[1]，而提高酿酒酵母对环境胁迫因素的耐受性对食品，酿酒等工业的生产具有重要的实际意义。
近年来，以燃料乙醇为代表的生物能源生产受到全球的关注，其中燃料乙醇作为可再生的情节能源，已经率先实现了大规模的工业化生产和应用。
而乙醇是酵母菌发酵糖的重要产物之一，虽然酵母具有较高的乙醇耐受力和乙醇产率，但是当乙醇在培养基中的浓度超过一定值时，就会对酵母细胞生长和乙醇发酵具有强烈的抑制作用，严重时甚至导致细胞死亡。
在发酵过程中，使用酿酒酵母酿酒或者生产燃料乙醇，都会涉及到乙醇的积累对酵母细胞的毒害作用，从而使得乙醇的产量受到限制[2]。
酵母菌对乙醇的耐受性受多种基因的共同调控，这与乙醇能对酵母造成多方面的损伤及毒害作用相一致。
为了鉴别与乙醇耐受性相关的基因，通过观察在含有不同浓度乙醇培养基上的酵母菌单基因突变体的生长发现了137个与乙醇耐性相关的基因[3]，而AuesukareeC等人通过对4828株酵母缺陷型菌株进行全基因筛选，发现与乙醇耐性相关的基因数目为95个[4]，虽然两个实验组得到的数据不同，所揭示的基因在两个报道中也是不完全一致，但是通过对缺失基因分类后发现，大部分基因都涉及到了对液泡H+-ATPase（V-ATPase），细胞骨架合成和细胞壁完整性等功能的可能。
最近的研究结果除了肯定以往的结果以外，还发现了一些新的与酵母细胞的乙醇耐性相关的机制。
1.1.1乙醇对酵母的毒害作用
细胞膜酵母菌的细胞膜是乙醇胁迫时攻击的主要目标，乙醇通过增加质膜的流动性从而对正常的膜结构造成损伤。
而酵母细胞可以改变膜的组成来减少膜的流动性，使质膜处于稳定状态。
这说明质膜的流动性和完整性在乙醇胁迫条件下对细胞有很重要的保护作用[5-6]。
早期的实验发现BEM2，PAT2，ROM2，VSP34和ADA2的基因缺失突变体对乙醇和白色荧光染料都非常敏感。
通过筛选酿酒酵母二倍体纯合子的缺失突变体库，发现单基因缺失的突变体ΔURA7和ΔGAL6在含8%（V/V）乙醇的培养基中的生长速度明显高于野生型。
URA7编码CTP合成酶，主要负责磷脂的生物合成及嘧啶的从头合成。
GAL6编码氨基肽酶，属于半胱氨酸蛋白酶家族。
这2种缺失突变体均对细胞壁溶解酶（β-1,3-葡聚糖酶）的抗性增强，说明了细胞壁的完整性与其乙醇耐性相关。
推测有可能是ΔGAL6中的热击蛋白基因HSP12和HSP26转录水平提高，导致了该突变体乙醇耐性的提高，而ΔURA7的乙醇耐性提高则有可能与URA7参与磷脂的合成有关[7]。
脂肪酸大量实验表明，在乙醇胁迫作用下，细胞内的脂质成分发生了改变，单不饱和脂肪酸的含量明显提高。
酵母的去饱和酶基因OLE1编码的是位于质膜上的去饱和酶，它可以通过氧化作用和依赖NADH的去饱和过程催化酵母中的棕榈酸（C16:
0）和硬脂酸（C18:
0）变为单不饱和脂肪酸棕榈油酸（Δ9Z-C16:
1），油酸（Δ9Z-C18:
1）。
You等将昆虫的膜去饱和酶基因TniNPVE插入OLE1基因突变体的基因组中。
发现表达昆虫去饱和酶基因的转化子乙醇耐性最强，这个转化子在不含乙醇的YPD液体培养基中培养至对数后期时油酸产量是棕榈酸的2倍，在含有5%（V/V）乙醇的YPD液体培养基中油酸和棕榈酸产量的比例提高了4倍，这些结果表明油酸在乙醇耐性中具有重要的作用[8]。
为了探明不饱和脂肪酸各种组成在乙醇胁迫中的作用，分别将使ScOLE1（酿酒酵母∆9脂肪酸脱氢酶基因），CaFAD2（白假丝酵母∆12脂肪酸脱氢酶基因），和CaFAD3（白假丝酵母ω3脂肪酸脱氢酶基因）基因在酵母中过表达。
结果发现，与正常菌株相比，ScOLE1过表达提高了总不饱和脂肪酸的含量和对乙醇的耐性，而过表达CaFAD2和CaFAD3的菌株只是分别生成了亚油酸（18:
2）和α-亚油酸（18:
3），而不饱和脂肪酸总量和乙醇耐性都没有明显改变。
这表明可能是总不饱和酸的含量而非不饱和程度在乙醇胁迫中起重要作用[9]。
1.2活性氧
活性氧自由基（reactiveoxygenspecies,ROS）是指活泼的氧自由基与具有氧自由基反应特性的其它含氧物质的总称，包括O2·
-、HO2·
、·
OH、H2O2、1O2、LO·
、LOO·
和LOOH，具有比氧更活泼的化学性质。
好氧性微生物把氧气作为电子传递链中的的电子受体[10]。
从电子呼吸链中泄露的电子，大概有5%会生成超氧和过氧化氢等活性氧[11-12]。
1.2.1活性氧的危害
在正常情况下，低水平的ROS是细胞行使生物学功能所必需的，因为ROS可参与细胞内许多重要途径的信号转导调控。
但在某些特殊的情况下，比如细胞自身氧化还原代谢紊乱或外界离子辐射等原因就会造成细胞内ROS的大量积聚，这种超过了细胞抗氧化防御缓冲能力的ROS可以攻击蛋白质、脂质及DNA等细胞组分而造成生物大分子的损伤，进而影响细胞的功能甚至造成细胞死亡[13-15]。
任何有机生物体的组织在水匮乏时都能存活下来一段时间，对亲水性蛋白缺失菌株进行筛选时发现，STF2在维持细胞存活方面有重要作用[16]。
进一步研究发现STF2基因缺失促进了ROS的积累，导致细胞凋亡。
过表达STF2可以减少氧化应激后ROS的积累，表明STF2p通过降低活性氧积累提高了细胞在脱水胁迫下的存活率。
蛋白质损伤[17]在ROS产生的部位附近的氨基酸残基、肽链、蛋白质、酶是ROS首先攻击的目标。
活性氧通过对蛋白质的氧化修饰使得蛋白质构象改变，肽链断裂、聚合或交联，从而引起蛋白质功能丧失，酶和受体的功能下降，正常的生理活动受到影响。
蛋白质侧链氨基酸的氧化是生命系统的一个重要信号，其侧链羰基的形成是蛋白质受到损伤的一个标志[18]。
脂质损伤脂质过氧化作用（LipidPeroxidation）是自由基生物学的一个分支，是指脂类多不饱和脂肪酸（PUFA）与自由基反应，形成中间体自由基，再与分子氧化反应形成脂质过氧化自由基，引起酸败作用。
生物膜还有较多的多不饱和脂肪酸，由于不饱和脂肪酸双键电子云密度大，化学性质很不稳定，容易发生脂质过氧化，从而导致膜功能和结构的损伤[19]。
DNA损伤核酸同样易受ROS攻击，ROS能使DNA双链断裂和单链断裂，使DNA的碱基变成自由基，并生成稳定化合物，对核酸造成氧化性损伤。
羟自由基和单线氧可以直接攻击DNA，而超氧阴离子和过氧化氢是通过产生羟自由基对DNA造成损伤的[20-21]。
检测DNA单链或双链断裂（DNAsingleordoublebreaks,SSBsandDSBs,respectively）的程度是目前检测DNA损伤水平的主要方法[22]。
研究已经表明，氧化损伤是引起DNA损伤的一个主要原因，在一定程度上被认为是造成SSBsandDSBs的前提因素[23]。
在正常条件下，Yap1通过与核外运受体Crm1构成了核外运蛋白，主要存在于细胞质中。
为了探明Yap1在DNA损伤中的作用，LoriA.Rowe等人[24]通过添加DNA损伤试剂MMS和UV-C（这两种试剂可以产生不同的DNA损伤且都不直接引起ROS的产生）发现，MMS处理使Yap1聚集于细胞核内，但是UV-C没有出现类似现象，检测ROS水平发现，MMS中的ROS水平高于UV-C结果表明DNA损伤通过诱导ROS造成Yap1在核内积累，而Yap1在核内的积累会上调参与BER和ROS清除途径的基因，从而激活DNA修复，预防对DNA的进一步伤害，维持细胞基因组稳定。
1.2.2常见抗氧化剂ROS防御系统
当酵母细胞从厌氧呼吸转换到有氧呼吸，或是暴露在H2O2以及低浓度氧化性药物中时，就会全面启动氧化防御系统，来保护胞内组分从而维持其氧化还原状态。
ROS防御系统主要分为非酶类和酶类两种。
1.2.2.1非酶防御系统
酵母细胞中的非酶防御系统主要包括像蛋白质、氨基酸衍生物、维生素、脂肪酸、糖类和起缓冲平衡调节作用的离子等的一些小分子，它们可以从溶液中直接清除氧化产物。
谷胱甘肽（glutathione,GSH）是酵母细胞中最丰富最重要的抗氧化剂分子，它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸三种构成的一种含有巯基的生物活性肽，在体内主要以还原态的GSH和氧化态的GSSG两种形态存在。
其中GSH存在于所有生物细胞中，是机体内重要的活性物质。
具有多种生理功能，主要体现在：
清除自由基，保护细胞；
参与氨基酸转运；
解除外源性物质的毒性；
参与转甲基反应，维持肝细胞正常功能；
维持DNA的生物合成，细胞的正常生长及细胞免疫等多种生理功能等。
N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是细胞内还原性谷胱甘肽的前体，是一种含有巯基的抗氧化剂。
它可以通过增加GSH含量间接发挥重要的生理功能，主要体现在：
抗氧化作用；
减少NO的生成；
抑制炎症因子的表达；
保护DNA，减轻DNA损伤，抑制NDA修复相关的突变；
抑制细胞凋亡等。
甲硫氨酸（Met），又名蛋氨酸，以腺苷蛋氨酸（S-Adenosylmethionine,SAM）活性形式广泛存在于动物、植物和微生物体内。
主要功能是参与蛋白质的合成。
在生物体内Met先从ATP接受腺苷变成SAM，再进行甲基转移。
如果Met缺乏
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