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本发明涉及一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR试剂盒，适用于猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒苗的定量检测以及疫苗质量时实监控，还涉及在检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒苗中的用途。
背景技术
猪瘟是猪的一种高度接触性传染病，常给养猪业造成严重的经济损失。
目前，疫病的早期特异性诊断、染疫动物的扑杀和疫苗接种是有效预防控制猪瘟的重要手段。
传统的猪瘟检测方法主要包括：
病毒的分离和生物学试验、电镜技术、免疫荧光技术、补体结合试验、核酸杂交、聚丙烯酰胺凝胶电泳等，这些方法在病毒病诊断和进出口检验检疫中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如周期长，操作繁琐，特异性和敏感性差，不规范，不适用于大批量检测，给猪瘟的检测带来巨大困难。
中国猪瘟兔化弱毒疫苗（HogCholeraLapinizedVirus，HCLV）以其具有诱生免疫反应快，对种猪、乳猪无残余毒力，免疫猪可抵抗猪瘟强毒株的攻击等特点，成为国际上公认的最安全有效的弱毒疫苗。
多年来，在国内外被广泛应用，对猪瘟的控制起到了重要的作用（王家富,张楚瑜,傅烈振,等.中国猪瘟兔化弱毒NS2－3基因的序列分析[J]。
病毒学报,2000,16:
150-154.）。
疫苗效价的高低是疫苗合格与否的关键指标。
HCLV在细胞中的增殖力较弱，不产生致细胞病变，对其效价的测定一直沿用兔体定型热反应法（中华人民共和国农业部,中华人民共和国兽用生物制品规程[S].2000年版.）。
但该法存在的突出不足是：
不能准确定量；
测毒结果易受兔体个体差异和天气条件影响；
实验周期长、费时费力。
因此，如何快速、准确测定疫苗效价是猪瘟疫苗生产中面临的主要难题之一。
据报道，采用微量细胞培养ELISA（杜念兴,猪瘟的回顾与展望[J].中国畜禽传染病,1998,20:
317-319）和反向间接血凝实验（李宝臣,郭兴福,韩正博,等.运用反向间接血凝方法对猪瘟细胞毒原液效检试验[J].黑龙江畜牧兽,1999,5:
46-46.）测定HCLV效价，可相应缩短检测时间，降低生产成本，但仍不能对毒价准确定量，而且目前也没有在生产实践中普遍应用。
近年来发展起来的荧光定量PCR（FluorogeneticQuantitativePCR,FQ-PCR）技术以其灵敏度高、速度快、特异性强等优点在基因表达水平分析（NellemannC,VinggaardAM,DalgaardM,etal.QuantificationofAntiandrogenEffectDeterminedbyLightCyclerTechnology[J].Toxicology,2001,163:
29-38）、病原体的定性（McGoldrickA,LowingsJP,IbataG,etal.ANovelApproachtotheDetectionofClassicalSwineFeverVirusbyRT-PCRwithaFluorogenicProbe（TaqMan）[J].J.Virol.Methods,1998,72:
125-135.；
BhudeviB,WeinstockD.FluorogenicRT-PCRassay（TaqMan）forDetectionandClassificationofBovineViralDiarrheaVirus[J].Vet.Microbiol.,2001,83:
1-10.）和定量检测（DesireN,DeheeA,SchneiderV,etal.QuantificationofHumanImmunodeficiencyVirusType1ProviralLoadbyaTaqManReal-TimePCRAssay[J].J.Clin.Microbiol,2001,39:
1303-1310.；
MartellM,GomezJ,EstebanJI,etal.High-ThroughputReal-TimeReverseTranscription-PCRQuantitationofHepatitisCVirusRNA[J].J.Clin.Microbiol,1999,37:
327-332.；
KearnsAM,TurnerAJL,EltringhamGJA,etal.RapidDetectionandQuantificationofCMVDNAinUrineusingLightcycler-basedReal-timePCR[J].J.Clin.Virol,2002,24:
131-134；
FlorenceKP,GlauciaPB,MireilleS,etal.QuantitationofHCVRNAusingreal-timePCRandfluorimetry[J].J.Virol.Methods,2001,95:
111-119.）等方面得到广泛应用，并且已经成为当前病毒核酸定量主要方法以，国内目前也已有关于丙肝、乙肝、支原体、爱滋病、结核定量检测的试剂盒上市。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒，该PCR试剂盒不仅可使用目前存在市场上的所有类型荧光定量仪器，更重要的是能快速地对猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗进行定量检测。
本发明的另一个目的是提供一种荧光定量PCR试剂盒在对猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗进行定量检测中的应用。
为了实现上述目的，本发明要用以下技术措施：
一种快速定量检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒包括a）RNA裂解液，b）逆转录酶，c）RNA酶抑制剂，d）TaqDNA聚合酶，e）标准阳性模板，f）逆转录反应液和g）荧光定量反应液，其特征是：
f）逆转录反应液含有反向引物PR为5-ATCAGGTCGTACTCCCATCAC-3（SEQIDNO:
２）所示的核苷酸序列，g）荧光定量反应液含有引物和荧光探针，引物为正向引物和反向引物，分别为5-TAGCCATGCCCATAGTAGG-3（SEQIDNO:
1）和5-ATCAGGTCGTACTCCCATCAC-3（SEQIDNO:
２）所示的核苷酸序列，荧光探针为5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGACGTGA-3（SEQIDNO:
３）所示的核苷酸序列，荧光探针5端标记的荧光报告基团是FAM，3端标记的荧光受体基团为ROX，e）标准阳性模板pGS是含有猪瘟兔化弱毒株5端400个核苷酸片段插入pGEM-T载体构成的，且该载体可在大肠杆菌DH5中增殖。
在本发明的一个优选方案中，逆转录反应液是由反向引物（SEQIDNO:
2），RT5×
buffer溶液，dNTPs溶液和无菌双蒸水组成，在本发明的一个具体方案中，逆转录反应液是10µ
mol/L反向引物（SEQIDNO:
2）3µ
l，RT5×
buffer10µ
l，10mmol/LdNTPs5µ
l，逆转录酶1µ
l，RNA酶抑制剂1µ
l，灭菌双蒸水10µ
l。
在本发明的一个优选方案中，荧光定量反应液是由正向引物（SEQIDNO:
1）和反向引物（SEQIDNO:
２），荧光探针FP，PCR10×
buffer溶液，MgCl2溶液，dNTPs溶液，TaqDNA聚合酶和无菌双蒸水组成；
在本发明的一个具体方案中，荧光定量反应液由PCR10×
buffer2µ
l，10µ
mol/L正向引物（SEQIDNO:
1）和反向的引物（SEQIDNO:
２）各0.5µ
l，1µ
mol/L荧光探针1µ
l，25mmol/LMgCl23.6µ
l，10mmol/LdNTPs0.4µ
l，3U/µ
lTaqDNA聚合酶0.5µ
l，无菌双蒸水9.5µ
l组成。
其中荧光探针为SEQIDNO:
３所示的核苷酸序列，荧光探针5端标记的荧光报告基团是FAM，3端标记的荧光受体基团为ROX。
在本发明的一个优选方案中，标准阳性模板是含有猪瘟兔化弱毒株5’端400个核苷酸片段插入pGEM-T载体，且该载体可在大肠杆菌DH5中增殖。
贮存浓度为5×
1010拷贝/µ
l，使用前系列稀释。
实验所用的标准品为含有目的扩增片段的质粒pGS，该质粒转化大肠杆菌DH5α增殖后用碱裂解法提取，经DNA纯化试剂盒纯化，用分光光度计测A260定量并稀释至5×
l，-20℃保存。
在本发明提供检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒中，有一条两端标记有荧光基团的特异性荧光探针，在探针完整时，两基团在空间结构上距离相互靠近，5’端报告基团产生的荧光因为荧光共振能量转移（FRET）而被3’端淬灭基团淬灭，故体系中没有荧光信号的变化。
在PCR退火和延伸过程中，探针与模板特异性结合，随着引物的延伸，TaqDNA聚合酶利用其5-3外切活性对探针进行切割释放出报告基团，这样破坏了两基团之间的FRET，报告基团所释放的荧光可以被内置在定量检测仪内的荧光计检测，荧光量的增加与PCR产物的积累量呈比例关系。
对HCLV的定量可通过与标准品的循环域值（Ct，ThresholdCycle）相比较得出。
Ct值是PCR过程中，荧光量的积累超过基底荧光量的循环圈数，Ct值与起始模数呈一定比例关系，Ct值越小，起始模板数越多，相反，Ct值越大，起始模板数越少。
利用阳性梯度标准模板的Ct值制成标准曲线，再根据待测样品的Ct值可准确测出该样品的起始拷贝数。
在本发明提供检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒中，针对猪瘟兔化弱毒疫苗检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物和探针浓度、Mg2+浓度、退火温度等的优化，并将FQ-PCR技术和定量检测系统（包括LigthCycler系统，Roche;
ABIPrism系统，PEAppliedBioasystems;
）相结合，将其用于猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的定量检测。
通过优化方案，反复实验，以及与传统兔体定型热反应法进行比较，建立了定量检测HCV和HCLV方法，并研制出猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒苗定量检测的试剂盒，该试剂盒的灵敏度可在每个反应体系中检出200Copies，完全可以满足猪瘟病毒的快速特异性检测和检测猪瘟兔化弱毒疫苗是否合格的要求。
在本发明的另外一个方面，还提供了使用本发明的试剂盒对猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗进行检测的方法，该方法包括下列步骤：
A）用e）标准阳性模板制备阳性标准品，并用紫外分光光度计定量；
B）用a）RNA裂解液从待测标本中提取RNA，然后加b）逆转录酶，c）RNA酶抑制剂和f）逆转录反应液逆转录成cDNA；
C）分别取B）步中的cDNA和同样量的系列稀释的A）步中的阳性标准品加入到含d）TaqDNA聚合酶和g）荧光定量反应液的PCR反应体系中用荧光定量检测仪进行PCR检测；
D）通过比较待测样品和标准品的循环域值而对待测样品的起始拷贝数进行定量。
在本发明中提供的检测猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒可对猪瘟病毒和猪瘟兔化弱毒疫苗进行定量检测以及疫苗质量的时实监控，并可替代一直沿用的猪瘟病毒传统检测方法和猪瘟兔化弱毒疫苗检测的兔体定型热反应法。
本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：
1、定量准确；
2、检测速度快，仅1小时，加上核酸的提取和cDNA的制备，共仅需3－4小时；
3、步骤简单；
4、可同时进行高通量的样品检测；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围，下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：
J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南（第二版）；
D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；
吕鸿声，科学出版社，1982，或接照制造厂商所建议的条件。
实施例1猪瘟弱毒疫苗的荧光定量PCR试剂盒组成与配制
A）.试剂组成：
TRIZOLRNA提取试剂盒为GIBCOL公司产品。
dNTPs（10 mM）、TaqDNA聚合酶（3U/µ
l）、RNA酶抑制剂（40U/µ
l）、MgCl2（25mM）均购自华美公司。
MMLV逆转录酶（200U/µ
l）购自Promega公司。
B）.MMLV 5×
Buffer组成：
50mMTris-HCl（PH8.325℃）、3mMMgCl2、75mMKCl、10mMDDT;
C）.荧光PCR10×
500mMKCl、100mMTris-HCl（PH9.025℃）、
1.0%TritonX-100；
D）.逆转录反应液：
反向引物PR（SEQIDNO:
2）3µ
l（10µ
mol/L），RT5×
l，dNTPs5µ
l（10mmol/L），无菌双蒸水10µ
E）.荧光定量反应液：
PCR10×
l，正向引物PF（SEQIDNO:
1）和反向引物PR（SEQIDNO:
2）各0.5µ
l（10µ
mol/L），荧光探针1µ
l（1µ
mol/L），MgCl23.6µ
l（25mmol/L），dNTPs0.4µ
l（10mmol/L），TaqDNA聚合酶0.5µ
l（3U/µ
l），无菌双蒸水9.5µ
荧光探针FP序列为SEQIDNO:
3，其5端标记的荧光报告基团是FAM，3端标记的荧光受体基团为ROX。
使用浓度为1µ
mol/L。
F）.自备试剂：
氯仿、异丙醇、DEPC处理的灭菌双蒸水、用DEPC处理的灭菌双蒸水配制的75%乙醇。
实施例2用猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR试剂盒检测猪瘟兔化弱毒苗
A）.取三种不同类型（兔子都产生定型热反应；
一个兔子有定型热，一个不产生定型热；
两只兔子都不产生定型热反应）的经兔体定型热反应重复检测验证的疫苗液（由武汉中博生化有限公司生产）各100µ
l，分别加RNA裂解液1ml混匀，室温静置10分钟，加0.2ml氯仿，室温静置3分钟，于4oC12000g/min离心15分钟，上清液转移到另一个离心管，加0.5ml异丙醇，室温沉淀10分钟，4oC12000g/min离心10分钟，轻轻倒出上清，加1ml75%乙醇于4oC7500g/min离心5分钟，弃上清，RNA沉淀在室温下自然晾干，加DEPC处理过的20ul。
B）.取A）步所提RNA20μl，85oC孵育5min，迅速置冰上5min，然后加逆转录反应液28μl，RNA酶抑制剂1μl，MMLV逆转录酶1μl。
42oC60min，95oC5min灭活MMLV。
C）.将阳性标准模板系列稀释为5×
105拷贝数/μl、5×
104拷贝数/μl、5×
103拷贝数/μl。
D）.分别取荧光定量PCR反应液各18μl，取第B）步所得cDNA和第C）步稀释的阳性标准模板各2μl，分别加入不同的PCR反应管，在荧光定量检测仪上平行做PCR检测。
循环条件为：
95℃预变性2min；
95℃15s，65℃40s，扩增40个循环。
把荧光检测的程序设置在每个循环的第二步结束时进行，检测波长为530nm。
循环结束后，运用仪器自带软件，读取待检样品拷贝数。
结果为：
标准阳性模板5×
103拷贝数/μl的Ct值分别为21.20、24.77和28.62；
使两个兔子都产生定型热反应疫苗样品的Ct值为26.96，换算后每ml疫苗样品拷贝数为7.13×
106拷贝数/ml；
一个兔子有定型热，一个不产生定型热疫苗样品的Ct值为28.63，换算后每ml疫苗样品拷贝数为3.35×
两只兔子都不产生定型热反应的疫苗样品的Ct值为31.86，换算后每ml疫苗样品拷贝数为4.70×
105拷贝数/ml。
实施例3猪瘟兔化弱毒苗的荧光定量PCR试剂盒与传统兔体定型热反应法检测猪瘟兔化弱毒苗的比较
1．取15份不同批次收获的疫苗液（由武汉中博生化有限公司生产），经兔体定型热反应法检测为5份为两个兔子都产生定型热反应；
5份为一个兔子有定型热，一个不产生定型热；
5份为两只兔子都不产生定型热反应。
分别编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。
1－5为两个兔子都产生定型热反应疫苗液；
6-10为一个兔子有定型热，一个不产生定型热疫苗液；
12-15为两只兔子都不产生定型热反应疫苗液。
经用本试剂盒检测，结果如下表：
疫苗样品
兔体定型热反应法
荧光定量PCRFQ-PCR
病毒量（copies/ml）
1
++
4.63×
106
2
1.42×
107
3
5.63×
4
6.28×
5
1.36×
6
+-
2.19×
7
1.47×
8
6.50×
9
1.99×
10
3.44×
11
--
5.52×
105
12
4.34×
13
9.25×
104
14
1.22×
15
8.21×
＋＋：
两个兔子都产生定型热反应疫苗样品
＋－：
一个兔子有定型热，一个不产生定型热疫苗样品
――：
两只兔子都不产生定型热反应
第8号样品兔体定型热反应法检测为+-，而荧光定量PCR检测为6.50×
106病毒粒子/ml，病毒粒子量已经达到使兔体产生定型热反应的量;
12号样品兔体定型热反应法检测为--，而荧光定量PCR检测4.34×
106病毒粒子/ml，病毒粒子量已经达到使兔体产生一个产生定型热反应，一个不产生定型热反应的量;
我们对这两份样品重新用两种方法检测，结果是8号样品兔体定型热反应法检测为++，荧光定量PCR检测为6.94×
106病毒粒子/ml;
12号样品兔体定型热反应法检测为+-，而荧光定量PCR检测3.95×
106病毒粒子/ml。
2．取15份不同批次收获的疫苗液，先用荧光定量PCR检测试剂盒测定病毒粒子数，然后再经兔体定型热反应法检测。
编号分别为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15。
结果如下表：
5.17×
7.42×
7.53×
6.55×
3.27×
2.55×
1.48×
3.17×
6.36×
1.17×
5.33×
4.70×
9.55×
1.98×
8.33×
第2号样品兔体定型热反应法检测为+-，而荧光定量PCR检测为7.42×
106病毒粒子/ml，病毒粒子量已经达到使两个兔体产生定型热反应的量;
9号样品兔体定型热反应法检测为+-，荧光定量PCR检测为6.36×
106病毒粒子/ml，病毒的量已经能够使两个兔体产生定型热反应;
12号样品兔体定型热反应法检测为--，而荧光定量PCR检测4.70×
106病毒粒子/ml，病毒粒子量已经达使一个兔子产生定型热反应，一个不产生定型热反应；
14号样品兔体定型热反应法检测为+-，而荧光
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