中药复方PCSPES Ⅱ抑制人前列腺癌细胞LNCaP增殖及其对AR PSA表达的影响Word文档格式.docx

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2&

/M期，在G&

0&

/G&

1&

峰前出现明显的凋亡峰，随作用时间的增加而升高;

同时采用Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态和AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测凋亡细胞比例，PC-SPESⅡ质量浓度为480mg?

时凋亡细胞比率增加，作用效果均呈一定剂量依赖性;

通过ELISA法检测LNCaP细胞分泌PSA的水平，以25mg?

Bic作为阳性对照药，发现480mg?

PC-SPESⅡ能显著降低细胞分泌PSA;

采用qRT-PCR和Westernblot方法检测AR，PSAmRNA和蛋白表达的变化，结果显示以人工合成雄激素25μg?

R1881诱导LNCaP细胞后，240～480mg?

PC-SPESⅡ能显著下调AR，PSAmRNA和蛋白表达，抑制AR由细胞质转移入细胞核。

以上结果表明，PC-SPESⅡ对LNCaP细胞体外增殖有抑制作用，阻滞细胞周期于G2/M期并诱导细胞凋亡，其机制可能与下调AR，PSA的表达，抑制AR核转位有关。

　　[关键词]前列腺癌;

PC-SPESⅡ;

LNCaP细胞;

抑制增殖;

雄激素受体;

前列腺特异性抗原

　　[收稿日期]2014-07-03

　　[基金项目]上海市博士学位点建设科研项目（K110404）;

国家“重大新药创制”科技重大专项（2012ZX09401-014）

　　[通信作者]陈子?

B，副教授，硕士生导师，研究方向为中药复方配伍规律和肿瘤免疫药理，Tel：

（021）51322187，E-mail：

zjchen21@

　　[作者简介]张碧严，硕士研究生，研究方向为肿瘤和免疫药理，E-mail：

zhang_bi_yan@

　　EffectofcompoundChinesetraditionalmedicinePC-SPESⅡininhibiting

　　proliferationofhumanprostatecancercellLNCaPand

　　onexpressionsofARandPSA

　　ZHANGBi-yan，LIYu-feng，LAIYun，LIYun-sen，CHENZi-jun

　　（1.SchoolofChineseMateriaMedica，ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shanghai201203，China;

　　2.InstitutesofBiologyandMedicalSciences，SuzhouUniversity，Suzhou215006，China）

　　[Abstract]ToinvestigatetheeffectofcompoundChinesetraditionalmedicinePC-SPESⅡIininhibitingproliferationofhumanprostatecancercellLNCaPbasedontheandrogenreceptor（AR）signalingpathway.TheeffectofPC-SPESⅡonLNCaPcellproliferationwasdetectedbyMTTassay.Accordingtothefindings，atthemassconcentrationof180-1440mg?

，PC-SPESⅡsignificantlyinhibitedtheproliferationofLNCaPcells;

theIC&

ofPC-SPESⅡat24hand48hwere311.48，199.01mg?

，respectively.TheflowCytometrydetectionshowed240mg?

PC-SPESⅡarrestedcellsinG&

/Mphase，andanobviousapoptoticpeakappearedbeforeG&

peakandroseovertime.Meanwhile，Hoechst33258stainingrevealedapoptoticcellularmorphology.AnnexinV-FITC/PIstainingmanifestedanincreaseinapoptoticcellratioatthePC-SPESⅡconcentrationof480mg?

inadosedependentmanner.Theprostatespecificantigen（PSA）secretionofLNCaPcellswastestedbyPSAELISAkit.Besides，comparedwith25mg?

Bic，480mg?

PC-SPESⅡsignificantlyreducedthecellsecretionofPSA.TheARandPSAmRNAandproteinexpressionsweredetectedbyqRT-PCRandWesternblot.Accordingtotheresults，aftertheinductionofLNCaPcellswithsyntheticandrogen25μg?

R1881，240-480mg?

PC-SPESⅡnotablydown-regulatedtheARandPSAmRNAandproteinexpressionsandinhibitedthetranslocationofARfromcytoplasmtonucleus.Insummary，PC-SPESⅡsignificantlycaninhibittheinvitroproliferationofLNCaPcellsandarrestcellcyclearrestinG2/Mphase.Itsmechanismmaybeassociatedwiththedown-regulationoftheARandPSAexpressionsandtheinhibitionofARnucleartranslocation.　　[Keywords]prostatecancer;

PC-SPESⅡ;

LNCaPcell;

proliferationinhibition;

androgenreceptor;

prostate-specificantigen

　　doi：

10.4268/cjcmm20150531

　　中药复方PC-SPES是由菊花、灵芝、甘草、大青叶、三七、冬凌草、黄芩和棕榈子8味药组成，除棕榈子产自美洲，其余7味药均来自中国[1]。

20世纪90年代PC-SPES从中国引入美国，1996年由BotanicLab（Brea，CA）公司将其投放市场。

1998年NewEnglJMed上首次报道了PC-SPES的生物学活性和临床疗效，表明PC-SPES可以显著降低前列腺癌（PCa）患者血清睾酮和前列腺特异性抗原（PSA），体内外均有显著的抗前列腺癌的活性[2]。

2004年JClinOncol再次指出PC-SPES治疗前列腺癌有显著疗效，与己烯雌酚（DES）相比更易被患者接受。

PC-SPES一度在美国成为PCa替代疗法的代名词，但因其化学成分复杂，作用机制不明，最终撤出了美国市场[3]。

　　为探讨PC-SPES的药效物质基础及作用机制，本研究以PC-SPES为母体，去除了含植物源雌激素的美洲草药棕榈子，以剩余7味中药组方，更名为PC-SPESⅡ[4]。

PC-SPESⅡ以灵芝为君药，配以黄芩、大青叶、冬凌草、菊花共为臣药，三七为佐药，甘草调和诸药为佐使药，共奏补养气血、清热解毒、活血化瘀之功。

前期体内药效学结果显示PC-SPESⅡ能显著抑制激素非依赖性人前列腺癌细胞株PC-3裸鼠移植瘤的生长，降低血清PSA水平[5]。

本实验在前期研究基础上，考察PC-SPESⅡ对激素依赖性人前列腺癌细胞LNCaP抑制增殖的作用，以及对雄激素受体（AR）信号通路相关分子mRNA和蛋白表达的影响，以期进一步揭示PC-SPESⅡ的作用机制。

　　1材料

　　1.1细胞激素依赖性人前列腺癌LNCaP细胞购自中国科学院上海细胞库。

　　1.2药物与试剂PC-SPESⅡ（上海中耀生物科技有限公司，棕褐色干膏粉，批号20120530），美曲勃龙（R1881）（纯度≥99%，上海波以尔化工有限公司，批号20130602），比卡鲁胺（Bic）（纯度≥98%，上海波以尔化工有限公司，批号20120825）。

RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）（美国Hyclone公司），胰蛋白酶、乙二胺四乙酸（EDTA）（国药集团化学试剂有限公司），噻唑兰（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国Sigma公司），PI/RNaseStainingBuffer，AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒（美国BD公司），Hoechest33258（武汉谷歌生物科技有限公司），Trizol（美国Invitrogen公司），OligodT18，dNTP（10mmol?

），M-MLV（RNaseH-），RNaseInhibitor（日本Takara公司），SYBRGreenPCRMAsterMix（美国AppliedBiosystems公司），细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（上海威奥生物科技有限公司），GAPDH一抗（杭州贤至生物科技有限公司），雄激素受体（AR）一抗、人前列腺特异性抗原（PSA）一抗（美国CST公司），anti-RabbitIgG二抗（美国LI-COR公司），人前列腺特异性抗原（PSA）ELISA检测试剂盒（上海西唐科技有限公司）。

　　1.3仪器CO&

培养箱、超低温冰箱（美国Thermo公司），冷冻离心机（美国Sigma公司），倒置荧光显微镜（日本Olympus公司），多功能酶标仪（美国Bio-tech公司），流式细胞仪（美国BD公司），PCR仪（美国AppliedBiosystems公司），实时荧光定量PCR仪（德国Qiagen公司），电泳及转印装置（美国Bio-Rad公司），红外激光成像系统（美国LI-COR公司）。

　　2方法

　　2.1药液配制称取PC-SPESⅡ干膏粉3.6g，溶于10mL70%乙醇，配制成360g?

储备液;

37℃孵育1h，低速离心取上清，用0.22μm微孔滤膜过滤[6]。

R1881，Bic分别溶于无菌二甲基亚砜（DMSO）中，配制成2.5，100g?

储备液，-80℃保存备用。

　　2.2细胞培养LNCaP细胞常规培养，RPMI-1640培养液，含10%FBS，青霉素100U?

mL&

和链霉素100U?

，置于37℃，5%CO&

的培养箱中，用0.25%的胰酶（含0.02%EDTA）消化传代，每5～6d传代1次。

　　2.3MTT法检测细胞活力取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，以1×

10&

4&

个/孔细胞传于96孔培养板，每孔0.1mL。

待细胞贴壁后，阴性对照组加入含0.5%乙醇的培养液，实验组加入终质量浓度分别为180，360，720，1440mg?

PC-SPESⅡ，每组4个复孔，其中含药培养液中的乙醇浓度均小于0.5%。

分别于37℃，5%CO&

培养箱中培养12，24，48，72h后，弃培养上清，每孔加入不含FBS的RPMI-1640培养液100μL，MTT（5g?

）10μL，继续培养4h后吸去培养液，每孔加DMSO150μL，振荡10min，使蓝紫色甲?

H结晶完全溶解，用多功能酶标仪在490nm处检测吸光度A。

细胞活力=（A&

实验组&

-A&

空白组&

）/（A&

阴性对照组&

）×

100%。

　　2.4流式细胞仪检测细胞周期分布取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，以5×

5&

个/孔的细胞数接种于6孔板中，每孔2mL。

待细胞贴壁后，阴性对照组加入含0.1%乙醇的培养液，实验组加入终质量浓度为240mg?

PC-SPESⅡ，分别于37℃，5%CO&

培养箱中培养0，12，24，48h后，消化收集细胞，用预冷PBS洗1次，加入预冷70%乙醇固定细胞，4℃过夜。

离心弃上清，用预冷PBS洗1次，加入0.5mLPI/RNaseStainingBuffer，室温孵育15min。

使用流式细胞仪检测细胞周期分布。

　　2.5Hoechst33258染色观察凋亡细胞形态取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，以1×

个/孔的细胞数接种于24孔板中，每孔1mL。

待细胞贴壁后，阴性对照组加入含0.1%乙醇的培养液，实验组加入终质量浓度为480mg?

培养箱中培养0，12，24，48h后，弃培养上清，用预冷PBS洗1次，加入预冷95%乙醇固定细胞，4℃过夜。

弃固定液，用预冷PBS洗2次，加入Hoechst33258，37℃染色15min，用预冷PBS洗2次，于倒置荧光显微镜下观察拍照。

　　2.6AnnexinV-FITC/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，以5×

培养箱中培养0，24，48h后，胰酶（不含EDTA）消化收集细胞，用预冷PBS洗2次，重悬细胞于Bindingbuffer中，按照试剂盒说明加入AnnexinV-FITC和PI各5μL，室温孵育15min。

使用流式细胞仪检测细胞凋亡率，其中AnnexinV阳性，PI阴性代表早期凋亡细胞，AnnexinV阳性，PI阳性代表晚期凋亡细胞。

　　2.7ELISA法测定细胞分泌PSA水平取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，分别以1×

个/孔细胞传于24孔板中，每孔1mL。

待细胞贴壁后，阴性对照组加入含0.1%乙醇的培养液，阳性对照组加入终质量浓度为25mg?

Bic，实验组加入终质量浓度为480mg?

PC-SPESⅡ，培养0，12，24，48h后，分别收集每孔细胞培养上清，按照人前列腺特异性抗原ELISA试剂盒说明操作，多功能酶标仪在450nm处检测吸光度A。

　　2.8qRT-PCR检测细胞AR，PSAmRNA的表达取对数生长期的LNCaP细胞经胰酶消化后，以5×

待细胞贴壁后，阴性对照组加入含0.1%乙醇的培养液，实验组均加入终质量浓度25μg?

R1881，分别加入终质量浓度为240，480mg?

PC-SPESⅡ或25mg?

Bic，于2%FBSRPMI-1640中培养24h后，消化收集细胞。

按照Trizol试剂说明提取细胞总RNA，所提取的RNA用NanoDrop2000（美国Thermo公司）测定浓度，并根据A&

260&

/A&

280&

（1.8～2.0）确定总RNA提取的纯度。

根据RNA浓度取1μgRNA逆转录，合成cDNA，所得逆转录产物用于PCR扩增。

通过Primer-Blast和PrimerPremier5.0设计引物，引物序列及扩增产物长度见表1，引物由上海生工合成。

qPCR反应条件为95℃预变性10s;

95℃变性15s，60℃退火60s，72℃延伸30s，40个循环。

β-actin作为内参基因，目的基因的相对表达量根据2&

-ΔΔCT&

计算，同时参考溶解曲线确保扩增产物的特异性。

　　2.9Westernblot检测AR，PSA蛋白的表达取对数生长期的LNCaP细胞，分组及加药同2.8项，于2%FBSRPMI-1640中培养24h后，刮刀刮下细胞，预冷PBS洗1次，加含1%PMSF的裂解液充分裂解细胞，提取细胞总蛋白，或按照细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒说明分别提取细胞浆蛋白和核蛋白，4℃，12000×

g离心15min，转移上清。

BCA法测定蛋白浓度，调整样品至相同浓度，与5×

Loadingbuffer混合，99℃蛋白充分变性10min。

取20μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳分离蛋白，转印蛋白至PVDF膜;

TBS漂洗后在5%脱脂奶粉封闭液中室温封闭1h，按GAPDH（1∶1000），AR（1∶2000），PSA（1∶1000）一抗孵育，4℃过夜;

用TBST于室温洗膜3次，每次10min，加入IRDye800CWanti-RabbitIgG二抗（1∶15000），室温孵育1h;

用TBST于室温洗膜2次，每次10min，再用TBS于室温洗膜1次，10min;

使用红外激光成像系统扫描图像，分析灰度，以目的蛋白/GAPDH表示各蛋白的相对表达强度。

　　2.10统计学分析各项实验均重复3次，所有数据采用±

s表示。

运用Flowjo软件分析流式细胞仪检测数据，LI-CORImageStudio软件进行Westernblot结果的灰度分析，GraphPadPrism5软件作图，SPSS18.0软件进行数据统计分析。

符合方差齐性条件下，2组数据间比较采用独立样本t检验，多组数据间比较采用单因素方差分析。

P&

0.05表示差异有统计学意义，P&

0.01表示较有显著性差异，P&

0.001表示极有显著性差异。

　　3结果

　　3.1PC-SPESⅡ对LNCaP细胞抑制增殖的作用采用MTT方法考察PC-SPESⅡ对LNCaP细胞增殖的影响，结果显示180～1440mg?

PC-SPESⅡ作用于LNCaP细胞，随浓度升高，细胞活力降低，与对照组相比，能显著抑制细胞增殖，并且呈明显的浓度依赖性;

PC-SPESⅡ作用24，48h的IC&

分别是311.48，199.01mg?

。

360，720mg?

PC-SPESⅡ随作用时间的增加，均能显著抑制细胞增殖（P&

0.001），呈明显的时间依赖性（图1）。

　　3.2PC-SPESⅡ对LNCaP细胞周期分布的影响流式细胞仪检测结果显示，240mg?

PC-SPESⅡ对LNCaP细胞的G&

/M期有阻滞作用，作用0，12，24，48h，G&

/M期细胞比例分别为7.63%，10.23%，12.27%，13.30%，随作用时间增加而升高，并呈一定的时间依赖性。

同时与对照组相比，PC-SPESⅡ作用下