石斑鱼病原与病原反应功能基因研究Word格式.docx
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台灣在亞洲石斑魚水產養殖之科技為大陸、東南亞國家之中心，石斑魚養殖戶也是技術傳播大陸及東南亞國家之橋樑。
然而，環視整個石斑魚水產養殖產業結構，疾病造成的高死亡率與卵質的鑑別是養殖業急待突破之瓶頸。
石斑魚（Epinephelusspp.），分類上屬於硬骨魚綱鱸形目（Percifo0rmes）鮨科（Serranidae）石斑魚屬（Epinephelus）魚類的統稱，本省俗稱亦有"
過魚"
、"
格也魚"
、"
鱸貓"
等。
石斑魚為肉食之暖水性魚類，分佈於熱帶及亞熱帶海域，種類繁多全世界約有400種，喜生活在近岸岩礁分布的海域。
台灣目前所發現的記錄為3亞科29屬110種（臺灣魚類資科庫，2002），此魚由於肉質細嫩豐美，自古以來就被視為桌上佳餚，也因其生活習性，過去無法以先進的科學技術增加漁獲量。
由於市場價值高，所以目前許多東南亞國家如新加坡、印尼、馬來西亞、菲律賓也都盛行養殖石斑魚，因此相當迅速的成為主要養殖魚類，現為台灣與東南亞國家的最主要經濟養殖魚類。
養殖石斑魚苗在以往皆須經由捕撈取得，再養殖成大魚出售。
多年來在台灣養殖業者不斷嘗試及研究改進之下，台灣於1982年首度有人以注射荷爾蒙的方式，成功繁殖馬拉巴（Epinephelusmalabaricus）石斑魚，自此開啟了台灣石斑魚的完全養殖時代，在飼養管理及種苗生產上，目前在世界上居於領先的地位，最大的養殖產地為台灣南部的嘉、南及高屏沿海。
目前台灣約有十餘種石斑魚可供人工養殖，以馬拉巴石斑、點帶石斑（E.coioides）、鞍帶石斑（E.lanceolatus）、及棕點石斑（E.fuscoguttatus）等已具完整發展之繁殖及飼養技術的魚種為主要種苗繁養殖大宗。
但是在近幾年來，在養殖的過程中除了對於卵質無法進行鑑別以瞭解孵育率外，常常可以發現在石斑魚在從卵孵化到吋苗的這段期間內，小魚經常會有不正常如旋轉般的游動情況，稱為飛旋症（Spiralicdisease），而造成此種病徵所之疾病的死亡率極高，有時甚至高達90~100%，造成養殖業者的極大損失。
目前已經知道，造成此一疾病的原因是因為魚類在受到神經壞死病毒（NervousNecrosisVirus,NNV）的感染之後，所引起的魚體不正常游動及大量死亡的現象（Chietal.,1997）。
NNV屬於野田病毒科（Nodaviridae）（Morietal.,1992）的betanodavirus屬（Balletal.,2000），對魚類而言是一個重要的病毒性疾病，通常會感染魚苗，並且在感染後會引起魚的神經壞死（viralnervousnecrosis,VNN）（YoshikoshiandInoue1990），腦脊髓炎（encephalomyelitis）（Blochetal.,1991）和液泡形成、腦病和視網膜病變（vacuolatingencephalopathyandretinopathy,VER）（Mundayetal.,1992;
OIE2000），並造成大量的死亡（Morietal.,1992）。
截至目前為止，已知的有11科、超過22種的魚類有報導過受神經壞死病毒感染的紀錄，其中又以石斑魚（Epinephelusakaara,E.fuscogutatus,E.malabaricus,E.moara,E.septemfasciatus,E.tauvina）、鱸魚（Latescalcarifer,Dicentrarchuslabrax）、河豚（Takifugurubripes）、比目魚（Veraspermoseri,Hippoglossushippoglossus,Paralichthysolivaceus,Scophthalmusmaximus）、鸚哥魚（Oplegnathusfasciatus）和鰺魚（Pseudocaranxdentex）為主（OIE,2000），影響甚大。
神經壞死病毒的病毒顆粒大小在25～30微米左右（Glazebrooketal.,1990），無封套膜、二十面體（YoshikoshiandInoue1990），屬於核糖核酸病毒，具有兩條單股的正股RNA，稱為RNA1與RNA2（Morietal.,1992），RNA1所產生的蛋白質為RNA聚合酶（RNApolymerase）；
而RNA2所產生的蛋白質為鞘蛋白（coatprotein），主要是組成病毒外殼，根據鞘蛋白上T4區域（氨基酸204~331）之核酸序列所進行的種源分析（phylogeneticanalysis），可以將25種魚類野田病毒區分為四種基因型，分別是：
SJNNV（stripedjackNNV）、TPNNV（tigerpufferNNV）、BFNNV（barfinflounderNNV）和RGNNV（redspottedgrouperNNV）四個類型（Nishizawaetal.,1997），至於魚類野田病毒與昆蟲野田病毒鞘蛋白之間的相似度則十分地低。
目前用以檢測魚隻是否受到神經壞死病毒感染的方法有幾類，包括：
1.以光學顯微鏡觀察魚的腦部、脊索或視網膜，但是不易觀察；
2.利用電子顯微鏡、血清學方法及分子生物學方法偵測魚體內是否有病毒顆粒、病毒抗原或其核酸的存在；
3.偵測魚血清或體液中是否有抗NNV抗體存在，如以重組的病毒鞘蛋白進行酵素連結免疫分析法（Enzyme-LinkedImmunosorbantAssay,ELISA）（Huangetal.,2001）；
4.對病毒進行細胞培養，目前可用的細胞株有可適用於所有基因型的魚類NNV的SSN-1（Frerichsetal.,1996；
Iwamotoetal.,1999）；
和可適用於石斑魚NNV的GF-1（Chietal.,1999a,b）。
目前最常用來檢測的方法是以免疫學方法偵測感染魚隻組織中是否有NNV抗原存在；
以及利用反轉錄聚合酶鏈所反應（reverse-transcriptionpolymerasechainreaction,RT-PCR）方法，針對神經壞死病毒的RNA2進行RT-PCR，雖然有效，但是所使用的引子的感受性有時會有因為不同病毒間親源關係較遠而偵測不到的問題（Thié
ryetal.,1999）。
由於神經壞死病毒會以垂直感染的方式傳至下一代（Arimotoetal.,1992；
Compsetal.,1996；
Yoshimizuetal.,1997；
GrotmolandTotland2000），並影響卵的孵育率，因此目前對於病毒性神經壞死症的防治方法僅有以臭氧洗卵（Arimotoetal.,1992；
GrotmolandTotland2000）的方式來對魚卵進行消毒，以減少魚卵上之病毒，降低發病之機率，此一方法雖然可以減少魚隻發病，但是一但養殖槽中有魚苗發病，仍會造成該養殖槽多數魚苗也受到感染，大量死亡，加上目前並無法以投藥的方式治療魚類之病毒性疾病，因此在對抗病毒性神經壞死症的研究上，主要是朝免疫的方向進行。
由於免疫系統是生物體為了抵禦外來病原與保護自體安全所衍生出之獨特防禦機制，亦是疫苗可應用於預防疾病之原由。
早在西元1798年英國生理學家EdwardJenner發現，患過牛痘的擠奶工人痊癒後便終身不會再感染天花，從此正式開啟了人類探索免疫機制的大門。
經過一系列的實驗研究發現得知，絕大多數的動物經外來病原入侵後，生物體會被誘發出兩種型態之免疫反應，分別為體液免疫反應（humoralimmunity）與細胞免疫反應（cellularimmunity）。
所謂體液免疫反應就是B淋巴細胞受抗原活化形成漿細胞（plasmacell）後，分泌具專一性之免疫球蛋白（immunoglobulin），即所謂的抗體（antibody）來清除外來物之免疫反應，而細胞免疫反應則是經由已活化之T淋巴細胞直接毒殺特定之入侵病原，以保護宿主之安全。
一般而言，生物防禦外來病原入侵之機制可分為兩種，一種是先天性免疫（innateimmunity）或又稱為非專一性免疫（nonspecificimmunity），包括四種防禦屏障：
（1）物理性屏障（physicalbarriers）：
是身體抵禦外來病原的第一道防線，包括皮膚和黏膜。
（2）生理性屏障（physiologicbarriers）：
包括溫度、pH、氧和一些溶解因子如溶解脢（lysozyme）等。
（3）胞攝及吞噬作用屏障（endocyticandphagocyticbarriers）：
利用膜的凹陷或伸出偽足將外來病原攝入免疫細胞中加以消滅。
（4）發炎反應的屏障（inflammatoryresponse）：
藉由血管擴張、增加血管通透性等加速體內更多淋巴細胞消滅病原。
另一種是後天免疫（acquiredimmunity）或又稱為專一性免疫（specificimmunity），藉由特定之免疫細胞如B淋巴球、T淋巴球針對特定外來物進行消滅，具有抗原專一性（antigenicspecificity）、多樣性（diversity）、記憶性（immunologicmemory）與自我辨識性（self/nonselfrecognition）四大主要特性。
大體而言，目前已知哺乳動物之防禦機制主要是依賴許多特化之免疫器官如︰胸腺（thymus）、骨髓（bonemarrow）、淋巴結（lymphnodes）、脾臟（spleen）等與免疫細胞如B淋巴球、T淋巴球、巨噬細胞（macrophage）等之間複雜的分工合作所擔當；
然而，這些免疫系統之發育過程與作用機制上的知識主要是建築於高等脊椎動物的模式，相對於魚類這些較低等、原始的脊椎動物而言，並不能完全適用。
雖然目前在多種高等脊椎動物體內所知的重要免疫器官如胸腺、脾臟在魚類體內亦有發現，且具備相同功能，但就免疫系統的結構與形態而言仍存在著明顯的差異，如魚類缺乏骨髓與淋巴結，取而代之的是特化的腎臟前端----頭腎（headkidney）來扮演初級淋巴器官（Hansen,1997;
HansenandKaattari,1995;
HansenandKaattari,1996;
Willettetal.,1997a;
Willettetal.,1999），在脾臟與胸線的組織切片觀察中也發現皮質（cortex）與髓質（medulla）的分界並不明顯，顯現並無十分完整的特化（PressandEvensen,1999）。
目前在魚類的免疫相關器官，其確切的免疫作用機制截至目前為止尚未完全明瞭，部分在高等動物所具備之相似器官，在魚類體內亦常被推測具有類似之功能，目前已知的魚類數個重要免疫器官有胸腺（Fishelson,1995;
Willettetal.,1997b）、腎臟（Fange,1986）、脾臟（SecombesandManning,1980）、肝臟、胃腸道、黏膜組織（Dalmoetal.,1997）等。
其他組織如心臟、鰓….等在某些魚類，如鱈魚雖也具有清除血球功能，但地位並不如前幾者重要。
整體而言，魚類的免疫系統雖較高等哺乳動物來的原始，也較缺乏效率，但卻已經具備現今高等脊椎動物免疫系統的雛形。
另一方面除了免疫器官之不同外，後天免疫（acquiredimmunity）藉由特定之免疫細胞如B淋巴球、T淋巴球針對特定外來物進行消滅，其中B淋巴球會產生免疫球蛋白（immunoglobulin）又稱為抗體（antibody），可分為細胞膜上的抗原結合蛋白（附著型,membraneform），或活化之漿細胞（plasmacell）分泌至循環系統中的蛋白產物（分泌型,secretoryform）。
存在於血液循環系統中之抗體，是生物體抵禦外來病源菌入侵、保護個體安全的重要成員之一。
高等哺乳動物的免疫蛋白可區分為五種不同形態，分別是IgG、IgA、IgM、IgE、IgD，其彼此之間的大小、電荷、胺基酸組成及免疫功能均不盡相同。
相較於高等哺乳動物，位居脊椎動物演化最原始地位的魚類，其免疫球蛋白相關研究一直遲到1970年代才逐漸被重視，至目前為止已有數種硬骨魚類與軟骨魚類如虹鱒、鮭魚、鱈魚、鯊魚等（NavarroandQuesada,1993;
PilstromandPetersson,1991）的免疫球蛋白被純化、分析。
由研究結果發現，除了低等無顎魚類（agnathanfish）如盲鰻（hagfish）、八目鰻（lamprey）不具有抗體外，所有的軟骨魚類（chondrichthyanfish）與硬骨魚類（osteichthyanfish）的免疫球蛋白僅表現一種免疫球蛋白，其結構與組成類似於高等哺乳動物的IgM。
IgM是目前已知抗體中被認為是最原始的抗體，原因主要是在低等的脊椎動物體中僅存在著IgM一種抗體。
細觀這些已知物種的IgM序列將會發現，序列相似性在哺乳動物間大約有60～70%，但在非哺乳動物間則降到了約40～50%，至於魚類間則僅僅約30～40%的相似性，顯示IgM序列的歧異度與物種演化地位有絕對的關係。
近年來一些研究也發現，魚類免疫球蛋白的親合力（affinity）與多樣性（diversity）相較於目前已知的高等脊椎動物明顯低了許多（WilsonandWarr,1992）。
目前存在於魚類體內的IgM，其存在的形式與其他高等哺乳動物相同，主要有兩種，一種為分泌型（secretedform），主要存在於血液循環系統中，另一種為附著型（membraneform）主要存在於B淋巴細胞的膜上，兩者差別在於免疫球蛋白的C端是否有疏水片段（transmembranemotif；
TM）的存在。
魚類IgM重鏈（heavychain）的組成與其他高等脊椎動物一樣，是由可變區（variable；
V）、變異區（diversity；
D）、連接區（joining；
J）與固定區（constant；
C）四個區域所組成；
然而，在魚類B細胞成長過程中，這四個區域進行重組的模式卻與高等脊椎動物不同，在高等脊椎動物是以線行重組（lineararrangement）方式來進行，如（VH）n-（D）m-（JH）x-（CH）y（Hardingetal.,1990），在低等軟骨魚類主要是以”串（multicluster）”為單位進行重組，如︰（VH-D-D-JH-CH）n（Hardingetal.,1990）；
而魚類單一IgM輕鏈（lightchain）的種類也不同於高等脊椎動物有κ與λ兩種，這些結構差異上的證據也暗示了魚類抗體多樣性的數目為何遠少於哺乳類動物。
高等脊椎動物的免疫系統最值得注意的特徵之一，就是能對非常多的外來抗原有反應。
據估計哺乳動物的免疫系統可製造超過108種不同的特異性抗體，以保護動物防禦大量病源。
在1983年Tonegawa等人發現，B淋巴球的免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）與T淋巴球的T細胞受器（Tcellreceptor,TCR）具有多樣性（diversity）的現象主要是基因隨機重組（randomrearrangement）的結果（HozumiandTonegawa,1976;
Tonegawa,1983），至此才真正解答了免疫學上的一大難題。
然而進行基因隨機重組之功能基因Rag基因，其全名為重組活化蛋白基因（recombination-activatinggene），會產生一種特殊的RAG蛋白質，此RAG蛋白質會將原本位於不同基因座（loci）上的V（variable）、D（diversity）、J（joining）基因片段以隨機方式接合在一起，以產生數百萬種不同的免疫球蛋白（Ig）與T細胞接受器（TCR）。
這些基因座在B細胞主要是μ、κ、λ，在T細胞主要是α、β、γ、δ（Altetal.,1992）。
這些可由RAG蛋白質催化進行重組反應的基因片段，其端點區均含有一段特殊DNA序列以指引RAG蛋白質進行切割、接合反應（Yancopoulosetal.,1986），此特殊DNA序列稱為重組訊號序列（recombinationsignalsequence,RSSs）（McBlaneetal.,1995），主要位於每個V基因片段的3’端、每個J基因片段的5’端與每個D基因片段的3’與5’端。
在1990年代初期科學家藉由基因剔除（geneknockout）實驗發現缺乏rag-1或rag-2基因的老鼠均無成熟的淋巴球細胞產生，主要是這些老鼠無法引導免疫球蛋白的DNA自重組訊號序列（RSSs）及譯碼序列（codingregion）之間斷裂，故無法使V、D、J基因片段進行重組排列，而使得這些淋巴球細胞生長期均停滯在先驅細胞階段（progenitorstage）（Mombaertsetal.,1992;
Shinkaietal.,1992），造成這些rag-1或rag-2基因有缺損的老鼠患有嚴重的混合性免疫不全症（severecombinedimmunodeficiency,SCID）。
這些實驗更加確定了RAG蛋白質在免疫機制上所扮演的重要角色與地位。
近年透過對於斑馬魚免疫系統研究之瞭解，RAG蛋白質在魚類免疫機制上所扮演的重要角色與地位亦逐步獲得釐清。
由先前的免疫器官與機制的研究結果說明了，在生物的演化過程中，毫無疑問地，免疫反應提供了生物一種良好、有效的保護機制。
魚類在分類學上是最原始的脊椎動物，然而相較於陸生脊椎動物詳盡且完整的免疫知識，魚類相關免疫機制則一直缺乏深入的研究與探討。
一直到西元1903年在鯉魚血液中證明有對細菌產生凝結反應的抗體存在時，才逐漸開啟人類研究魚類免疫機制的殿堂。
但是相對於陸生脊椎動物清晰研究成果，魚類免疫作用器官及分子機制截至目前為止尚未完全明瞭，部分在高等動物所具備之相似作用器官及分子機制，在魚類體內亦常被推測具有類似之功能，並無完整與系統性研究。
雖然魚類具有記憶性的後天免疫系統與功能是無庸置疑的，因此以疫苗方式來預防及治療魚類疾病，成為目前解決水產養殖疾病危害的最佳利器。
早在十九世紀初人們就懂得接種疫苗來預防疾病，當時只知道事先注射感染弱毒性或死亡的病毒或細菌可以防止再次被感染而致命。
隨著免疫學的發展而逐漸了解疫苗的作用方式，並發展出多元化的疫苗，包含死菌疫苗（inactivatedvaccines）、減毒疫苗（attenuatevaccines）、次單位疫苗（subunitvaccines）、以及去氧核醣核酸疫苗（DNAvaccines）等。
但是疫苗必須施用於能引起免疫反應的階段，並是需要定期追加注射以加強免疫反應的記憶性，以提供免疫保護效果，但是這些資料於魚類仍然非常缺乏整體性研究與瞭解，因此對於免疫分子指標之研究與瞭解可增進施用疫苗之成效並可提供免疫成效之追蹤，同時對於優質石斑種苗之育成可提供選育標準。
另一方面，卵質的重要指標為孵育率多寡，由於卵之孵育率取決於卵發育的能力，而卵發育的能力定義為具有可授精及完全發育形成正常的胚胎，特別是指胚胎發生基因表現之前。
同時根據先前研究指出卵生成期間（oogenesis）卵的數量、各種生長因子累積、及胚胎發育過程是決定卵質的主要關鍵。
對於較低等的脊椎動物，特別是魚類，卵累積大量的營養於卵黃為胚胎發育至孵出化到第一次開始攝食所需。
因此，許多研究證明卵質和卵黃生成期間（vitellogenesis）藉由卵從母系來源隔離出卵脂蛋白營養，維生素，或荷爾蒙因子可能有重要相關性。
雖然於卵孵化過程有限因子的角色如前所訴述，但目前可利用作為於卵質可信的分子指標非常少，同時對於如何決定卵質好壞尚無法提供合理之生化基礎。
因此卵質好壞的不確定性，對於養殖魚業造成嚴重的經濟損失。
由於許多基因表現及環境因素會影響卵生成期間基因表現及早期胚胎發育，但相對於先前專注於卵黃的組成研究，目前仍缺少有關於魚類母系訊息RNA（mRNA）累積於卵中所扮演的角色與瞭解，雖然他們推測與決定卵質是具有相當的重要性（Brooksetal.,1997）。
一些具代表性基因對於早期發育期間品質好壞可藉由real-timePCR檢視卵內mRNA含量度。
如類胰島素成長因子I和II（IGF-I和-II）是多肽分子，已知可刺激許多脊椎動物細胞增生和分化。
使用目標物突變生成顯示IGF-I和-II對於老鼠的胚胎發育是重要的（DeChiaraetal.,1990;
Liuetal.,1993）。
IGF系統的基因被推斷為包含於最早期的胚胎發育。
於牛的胚胎兩個細胞時期，IGFI表現與第一次胚胎分割的時間有關，反應出胚胎發育的能力（Lonerganetal.,2000）。
除此之外，IGF基因的表現也被提出具有人類胚胎品質的指標之潛力（Liuetal.,1997）。
最後，IGFmRNAs也出現在硬骨魚未受精的卵和早期的胚胎中（GreeneandChen,1999;
Perrotetal.,1999），但他們與硬骨魚中發育能力之間關係目前還未知。
另外，腫瘤抑制子p53於已分化的細胞中的細胞週期和細胞凋亡扮演一重要的角色及其似乎對於細胞正常的發育所必須的。
比如Xenopus胚胎包含大量p53mRNA知母系儲存物為胚胎分化所必須（Wallingfordetal.,1997），報告亦指出老鼠（Musmusculus）在p53缺乏的突變情況下發育發生不正常（Armstrongetal.,1995），且於硬骨魚中母系來源的p53轉錄子表現豐富於卵和早期的胚胎中（Chengetal.,1997），但對於包含於卵發育的能力仍未知。
於卵成長期間，CyclinBmRNA於卵生長期間的儲存對於許多種類，包括老鼠（Audicetal.,2001），Xenopus（Hartleyetal.,1996），和海星（Asterinapectinifera）（Okano-Uchidaetal.,1
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