利用当地分离的好氧生物表面活性剂产生菌高强度降解工业废水中油脂讲解Word格式文档下载.docx

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一个现有的替代治疗系统的例子是积水系统的应用，也是最常见的处理系统，马来西亚棕榈油米尔斯用于治疗油椰。

其中对于积水系统最吸引人的特点是较低的资本成本，这可以归因于机械混合、运行控制和监测设备的限制（雅谷等人，2009）。

该系统包括一系列的专门建造的池塘，分别包括厌氧和兼性厌氧结合物理化学和生物处理池，（TongandJaafar，2004；

Vijayaraghavanetal．，2007）。

最近的研究表明，化学氧的去除需求（化学需氧量），以及氧氧化的氧是更高的厌氧消化油椰相比原油椰在稀释水力停留时间（HRT）为60h（Vijayaraghavan等人。

2007）。

单一的文化如不动杆菌属，芽孢杆菌属（kul8）（kul39）和假单胞菌属（klb1）表现出较高的O&

G的去除能力相比，混合培养（bhumibhamonetal．2002）。

产脂肪酶的细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌—情况下，解淀粉芽孢杆菌、粘质沙雷菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌也有报道脂质降解与含废物的强效剂—如棕榈油磨、乳制品、屠宰等所产生的水房子和肥皂行业（Prasad和曼朱纳特，2011）。

目标本研究的可行性，探讨使用固有在特定工业废水中去除油和油脂的细菌油椰、电子电器、食品加工等行业的废水处理系统在小型实验室。

2材料与方法

2．1工业废水

从位于新柔佛区，柔佛，马来西亚三个不同行业的处理厂获取油和油脂废水。

每个行业都有被识别—可将O&

G在某些阶段的操作即米尔斯（棕榈油混合池、油椰），电气和电子—业，E&

E（放电点）和食品工业（放电点）。

废水样品收集清洁和杀菌—利用玻璃容器和样品的pH值进行了调整pH＜2或1MHCl和1MNaOH（防止非生物氧化还原可能改变化学形态的反应过程—工业废水）和制冷实验室—冰柜在黑暗条件下运输保藏（APHA，2005）。

各废水样品，然后立即存储在4℃条件下备用。

这个测定废水中的平均氧含量从1886至14510毫克/升油椰，1.45—10mg/L（E，E）和180—79000mg/L（食品工业）。

2．2油和油脂降解菌的分离筛选

从油椰，E和E食品工业废水中分离油和油脂的降解菌，采用以下步骤：

2.5毫升各废水转化为一系列的250毫升三角瓶含22.5毫升的营养肉汤，营养肉汤（8g/L，Merck）在30℃、200rpm培养24h（certomat，B．布劳恩）。

然后，每一滴培养细菌培养液接种到营养琼脂，营养琼脂平板（20克∕升，Merck）30℃条件下过夜培养（Memmert，USA）。

细菌菌落，然后分培养到新鲜的钠板，使用类似程序，直到得到一个纯培养。

对油椰，分离的细菌进行筛选，O&

G降解性能（脂解）采用吐温80蛋白胨琼脂（Plouetal．，1998）。

选定的细菌分离株评价其细胞表面疏水性使用的细菌粘附烃（BATH）试验（罗森伯格等1980）。

BATH试验进行了使用早期指数第一次用离心法获得的相细胞9500转5分钟（Allegra-TM25-R离心机，贝克曼Coulter）和悬浮在0．01M磷酸钾缓冲液（pH7）为实现外径0.5值600。

然后，加0．5毫升的棕榈油或石蜡油于5毫升细胞悬液中涡旋30S（thermolyne搅拌机II）静止15分钟。

记录水相在600nm的吸光度和微生物粘附到基板的百分比计算，如下：

1－（OD600aqueousphaseaftertheadditionof基板∕OD600initialphasebeforetheadditionof基板）×

100%

（1）

对于从电子和电子废水中分离的所有25个细菌进行了生长分析，细胞浓度（CFU/ml）和养殖混浊（OD600）使用下面的方法：

一滴培养各自的24小时的菌落接种到25毫升含营养肉汤的一系列250毫升三角瓶中。

其次是200rpm，30℃培养24h细菌分离株最短时间达到早期固定相和外径600值大于1，被指定用于随后的实验。

从这个评价，分离出4种菌株，A8、B1、B6和B7菌株进行后续的研究。

细菌应变在最小的基盐介质中生长良好最高细胞数被选为潜在的细菌降解油和油脂因为它有能力在低极低的介质中生长。

这个最小基盐介质的组成如下：

（NH4）2SO4（3g∕L，Univar），MgSO47H2O（0.5g∕L，Merck），K2HPO4（0.5g∕L、BDH）、氯化钾（0.1g∕L，Merck）和酵母提取物

（0.1克∕升、Oxoid）。

一株从各自的废水显示最高的浊度和最快的增长被确定使用16SrRNA序列分析这是由第一基地实验室进行公司、马来西亚和ktrade企业，马来西亚。

对于食品工业废水，所有10个分离株显示良好的生长与外径1的600以上。

一个菌株，即分离一个被评价为其脂质降解能力的使用吐温80蛋白胨琼脂（蛋白胨10g∕L，氯化钠5g∕L、CaCl2–0.1g∕L，5ml吐温80和琼脂18g∕L）形成不透明的地方在微生物菌落带指示的脂解活性。

分离在1，3和5%（V/V）在30℃和200rpm（certomat，B．布劳恩）下培养24h，而菌株X7、X10采用100%（V/V）培养2天。

分离出的菌株X10、B1和A保持在4℃的存储Luriae-Bertani甘油中，作为生物降解研究。

2．3生物表面活性剂生产和活动

生物表面活性剂生产能力的细菌菌株

采用分离的一个24小时的纯化接种5毫升液分离在500毫升的锥形烧瓶中含有50毫升混合的最小介质（3g∕L（NH4）2SO4，0.5g∕LKH2PO4，0.1g∕LKCl、0.5g∕LMgSO4．7H2O）和5%V/V食用油。

这个混合物，然后，30℃和200rpm培养12h，于10000rpm，20min和4℃收获产生的上清液用氯仿和甲醇（2:

1，V/V）提取。

提取物使用旋转蒸发器浓缩并确定生物表面活性剂的活性，使用下面的过程（Matsumiyaetal．，2007）；

30微升的浓缩提取液用移液管上该中心的一个系列含混合50毫升的培养皿蒸馏水（DW）和食用油100微升。

生物单位—表面活性剂活性（美国）被定义为结算的直径1分钟后形成的表面活性剂的区域形成。

石油位移测试是一种间接测量表面活性的方法生物表面活性剂样品测试油在较大直径表示测试解决方案的更高的表面活性。

2．4油和油脂的生物降解研究

油和油脂生物降解研究利用不同行业工业废水分离，进行如下：

在分离A10%（V/V）为转移到90毫升食品工业废水中，分离B1（10%）V/V）在90毫升于电子和电子工业废水中，分离X1020%（V/V）在80毫升油椰废水中在一系列1L锥形瓶中，进行200rpm，30℃，摇床培养24h。

（certomatM，B布劳恩，（德国）。

油椰在121℃下灭菌15分钟备用（200kPa）现有技术的使用。

在细菌培养是在指定的采样液时间区间（4h-isolateB1，7days-isolateX10and12day-isolateA）油和油脂残渣的含量。

类似的实验中的安装程序进行以下研究：

（1）废水不同pH值的影响（pH3-11,adjustedusingeither1.0MNaOHor1.0MHCl），在每2h到4h（fortheE&

Ewastewater），每24h持续7天（forPOM），每24h持续12天，对食品工业废水进行一次样本分析

（2）营养补充对油和油脂降解的影响，在分离线菌株B1的10%（V/V）接种到在电子与电子工业废水中（80毫升）1g∕L的酸或琥珀酸，葡萄糖，乳糖，蛋白胨，尿素，L-丙氨酸，（NH4）2SO4，或NH4NO3，调节pH7和每4h监测一次（3）初始有机负荷率（OLR）的影响，在分离生长12的菌株A存在于1．08×

10-1kgO&

G∕L∕天或1.46×

10-1kgO&

G∕L∕天的食用油中的，20%分离出的菌株X10（V/V）与20%，40%，60%、80%和100%（V/V）的POME混合，监测7天。

“研究的．最后，确定最后细胞浓度（CFUml-1）和油和油脂的最终剩余残渣量。

一式三份分别进行实验。

对油和油脂含量的测定是使用油和油脂测定方法中所描述的APHA2005-5520B（APHA，2005），与提取正己烷的油溶剂一起使用。

确定每个样本实验前和实验后油和油脂的含量。

所有试验均在周围25℃环境中进行，所有的分析结果为标准偏差—化（S），测量的置信区间和变化描述公式

（2）：

sx¼

（2）

2．5电子显微镜分析

0.5毫升食用油与5毫升磷酸盐缓冲液的混合物中中使用的进行了扫描电子显微镜及透射电子显微镜（透射电镜）分析分离出的菌株A形态。

用扫描电镜制备扫描电镜样品修改后的程序，由萨等人描述。

（2007）如下描述：

-在细菌细胞颗粒9500rpm，4℃，30分钟。

细胞颗粒固定在2.5%（V/体V）戊二醛（磷酸盐缓冲液，pH7.4）1-2h，然后用去离子水洗两次。

然后，它被固定使用2%（V/V）四氧化锇（（Fluka,Switzerland）1小时，然后用去离子水再洗。

细胞颗粒随后脱水,增加使用乙醇的浓度（10%，30%，50%，70%，和100%V/V；

每次5分钟）然后在干燥器中70-80℃条件下通宵干燥。

电镜分析，乙醇脱水细胞嵌入在50%和100%（V/V）在丙酮环氧树脂（Q，Rë

C）15分钟。

然后，细胞颗粒被渗透到第二次用新鲜的100%（体积/体积）环氧树脂，在60℃过夜固化。

90nm厚的标本切片从嵌入式块使用LeicaUltraCutUCTultramictrotome安装在200目铜网中。

标本进行染色，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色后5分钟（Southametal.2001;

Chaerunetal.2004）。

扫描电镜下研究查看之前，所有样品保持在干燥器（日立—4500SEM）和透射电镜（TecnaiG2、飞利浦）下，医学研究所（IMR），吉隆坡，马来西亚。

3结果与讨论

3．1微生物分离

对于电子和电子（电子）工业废水，在铌和钠上成功分离出25种不同的细菌菌落。

经吐温蛋白胨琼脂培养基筛选后的两株（分离X7和X10）有脂解活性。

一细菌分离，即分离B1显示在营养肉汤增长最快与OD600值1.23后2小时的接触时间，以及在盐最小培养基（MM）良好的增长（1．66×

10-8CFU∕ml24h小时后）。

这个分离是一种革兰氏阴性，在营养琼脂30℃生长24小时，形成轻微的奶油，晶莹的菌落。

从从食品工业废水中最初分离的10个细菌里（5），菌株A与其他菌株相比，在基本培养基上培养24h后分离出的OD600大于1.0，具有最高的生长能力。

除了这个功能，是分离的一个也是唯一的分离显示出具脂解活性的（在吐温80蛋白胨琼脂培养基上生长时形成明显不透明区）以及在5%（体积/体积）食用油中表现出良好的生长，细胞浓度达到108CFU∕ml。

吐温，聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，是检测在琼脂培养基分解脂肪的微生物的首选基板（Sierra，1957）吐温80（聚氧乙烯山梨糖醇酐油酸单酯）是最广泛使用的化合物。

它是基于沉淀（如酸钙盐）对脂肪酸的水解作用吐温（Plouetal．,1998）。

微生物降解能力油酸是一种直接指示，其潜在用途降解油和油脂—如油椰废水，富含棕榈酸和油酸含量（吴等人，2009）。

从16SrRNA的结果基因序列分析如表1所示，因此分离B1被称为嗜水气单胞菌（UTM2），分离为粘质沙雷氏菌（C19320）和分离X10为蜡样芽孢杆菌（UTM6）。

完整的沉积基因序列如下，分别为KF049214,EU555434和KJ605415。

3．2微生物特性

3．2．1细菌粘附

根据细菌粘附烃（BATH）油气进行了确定细胞的疏水性程度。

细菌粘附烃指数是重要的，以进行任何烃降解过程中评估一种特殊的细菌菌株的亲和力。

在这项研究中，蜡状芽孢杆菌（UTM6）显示具有最高的细菌粘附烃能力，具有84.51%的值而嗜水气单胞菌（UTM2）为（22.86%）。

高亲油性蜡状芽孢杆菌（UTM6）可以归因于它原来的位置，分离—油椰，即含有高浓度O&

G，与嗜水气单胞菌（UTM2），分离出E和E低浓度的油和油脂的废水。

最初适应生活在高O&

G浓度环境，蜡样芽胞杆菌（UTM6）预计有细胞表面性质，允许油气运移进入菌内细胞区在降解过程中会发生（常和苏，2002）。

油适应细胞的使用是成功的，增加BATH值细菌细胞的粘质沙雷氏菌显示（C19320）适应石油的黏质沙雷氏菌细胞（C19320）显示BATH值81%，与非适应细胞（44%）相比。

这个油与油界面处形成明显的白层含水层清楚地表明粘质沙雷氏菌对油相的亲和力（C19320），因此其BATH值高。

通过介绍从石油资源丰富环境中分离的如粘质沙雷氏菌（C19320）作为解决方案，可以预期的是，细胞膜的脂肪酸成分增加。

此条件收益由于细菌细胞改变其膜顺式脂肪酸的能力，可以从顺式到反式不饱和脂肪酸。

细胞表面分泌的生物表面活性剂直接辅助分离出油中的粘附性液滴。

表1鉴定分离B1，X10和16SrRNA基因序列分析。

3．2．2生物表面活性剂的生产

由于其具最高的BATH值，粘质沙雷氏菌（C19320）是使用食用油作为衬底，进一步评估生物表面活性剂的活性。

在早期固定的形成小油滴表示生长期分泌表面活性剂（数据未显示）的初始点。

对照组（未接种菌株）表现出更大直径的油滴少了很多。

原油生物表面活性剂进行了评价使用驱油试验，结果清楚地表明作为原油的生物表面活性剂的粘质沙雷氏菌C19320的380±

42.4U∕ML表面活性剂活性优于比较商业的表面活性剂，吐温80（79±

0.93U∕ML）。

对照组（包括食用油的混合物）没有显示任何生物表面活性剂的活性。

高等生物表面活性剂的活性会导致较大和更快的结算区形成速度。

生物表面活性剂由细菌辅助乳化和包装通过降低表面张力形成小液滴的油（Kosaric，2001）。

这实际上，增加有机基板溶解率，因此它的利用率的分离（PapanikolaouandAggelis,2011）。

高生物活性理想的石油和油脂的生物降解过程中的生物—表面活性剂的活性会导致较高的表面疏水性，通过增加依次递增疏水性化合物的生物利用度，从而增加整体油脂废物（罗森伯格和罗恩，2002）。

电镜分析，在油滴里培养24h后的粘质沙雷氏菌（C19320）细胞形态和细胞崩解，大孔和细胞解体形成胞外聚合物矩阵，将导致细胞的相互连接形成复杂网络（图1）。

由于细胞分泌的生物表面活性剂对于细胞锚定的油滴以及产生降解。

从透射电镜照片看，半透明油滴的水珠（100-200nm）在内有生长的粘质沙雷氏菌（C19320）中油珠中清晰可辨（Fig.1a）。

这些小球是没有细菌没有油滴存在细胞（图2B）。

Fig.1.SEMmicrographsof（a）Serratiamarcescens（C19320）withoutoil（control）and（b）S.marcescens（C19320）inthepresenceofoil.

Fig.2.TEMmicrographsofS.marcescens（C19320）growing（a）inthepresenceofoiland（b）withoutoildroplets;

arrowindicatesthepresenceoftranslucentglobulesofoil

droplets.

3．3油脂生物降解

3．3．1接触时间和浓度的影响

嗜水气单胞菌（UTM2）显示进行完整的降解油和油脂的能力（初始浓度为5.186毫克每升）从电子和电子工业废水中30℃培养4h。

通过生物降解的研究表明，油性环境中生长适应性好细胞的保持高细胞浓度，超过108CFU每毫升（图3）。

有趣的一点是，虽然嗜水气单胞菌（UTM2）是从一个低O&

G分离出来的（1.5-10mg/L浓度的电子及电子工业废水），显示高适应能力，生存和利用废水中含有的油和油脂，表明其应用于生物降解过程的潜能。

用于食品工业废水，PH值为7和5%（V/V）食用油中培养12天之后的粘质沙雷氏菌（C19320）显示出最大的油和油脂的去除能力达到89%（图4）。

石油去除随细胞浓度的增加而逐渐增加。

培养2天后，39%的油降解，72%（4天），80%（6天），84%（8天），85%（10天）和89%（12天）天）。

整个实验研究维持高细胞浓度约为108CFU∕ml。

食用油中的复杂性的化合物存在诱导某一脂肪酶的分泌或生物表面活性剂促进细胞吸收复杂营养物质进入的过程（DumoreandMukhopadhyay,2012）。

对油椰，蜡状芽孢杆菌（UTM6）随着油椰浓度显示出高降解O&

G能力。

超过90%的油和油脂被完全去除了，用（20-100%v/v）20%、80%和100%（V/V）浓度的油椰200rpm，30℃经过6天的接触时间。

一个需要注意的一点是，蜡样芽胞杆菌（UTM6）在最高使用浓度即100%（V/V）油椰（相当于14510mg∕L）具有高的降解O&

G的能力，相比于20%（体积/体积）80%（v/v）油椰。

如图5所示，细胞浓度在整个实验过程中始终保持较高的值3.25×

108CFU∕ml（油和油脂去除能力达100%）和1.88×

109CFU∕ml40%（v/v）油椰（最低O&

G的去除能力达90.53%）。

即使这项研究清楚地表明了这个角色蜡状芽孢杆菌（UTM6）实施O&

G降解过程使用预先灭菌的油椰，更多的研究需要进行使用过滤（除去悬浮物），但不消毒油椰对固有的微生物降解O&

G的潜在作用。

这将有更好的表明蜡状芽孢杆菌（UTM6）于应用领域的可行性。

这是因为在非无菌的油椰，总是有可能存在固有微生物在油椰中增殖并参与降解O&

G的生物以及消耗的营养物质（SalihuandAlam,2012）。

这种情况可能会或可能不会工作，蜡状芽孢杆菌的优势（UTM6）在试图评估其在一个规模较大环境（开放式处理系统/应用）下降解O&

G能力的效果，在其他环境因素，如在PH值，温度，可能引入其他污染物，对水环境的波动会更高。

观察到类似油和油脂降解的条件下，从食品工业废水油和油脂的消除高达90%，获得最高的有机负荷率，即146mgO&

G∕L∕天。

其次分别是85%和82%的去除OLR的1.20×

10-1KgO&

G∕L∕天、1．08×

G∕L∕天，（图6）。

此外，初始负荷与HRT，因此这2个参数之间的必须良好平衡得到良好的降解操作（Khemkhaoetal．，2011）。

Fig.3.BioticandabioticdegradationofO&

Ginelectricandelectronicwastewaterby

Aeromonashydrophila（UTM2）.

Fig.4.PercentageremovalofO&

Gandbacterialsurvivalduringbiodegradationoffood

industryeffluentatdifferenttimeintervals.

Fig.5.EffectofdifferentPOMEconcentrationsonO&

GremovalandCFUml?

1by

Bacilluscereus（UTM6）:

（a）20%,（b）40%,（c）60%,（d）80%and（e）100%

Fig.6.EffectofinitialOLRontheremovalofoilandgreaseforS.marcescens（C19320）

duringbiodegradationoffoodindustryeffluent.

3．3．2PH值的影响

PH在油和油脂的生物降解中起着非常重要的作用。

这很显然，在这项研究中，从油椰废水证明，初始PH值为6，6.5和7，出现油和油脂的完整的降解，在初始PH值小于5．5，而无意义的油和油脂的降解（油和油脂降解率小于10%），即5和5.5，表明不存在活的细胞（图7）。

这种情况与油椰废水中可以完全降解油和油脂的细胞数量直接相关，细胞浓度超过108CFU∕ml时，油和油脂的降解总是微不足道的（小于10%），细胞浓度小于105CFU∕ml（Ahmadetal.2009）建议，最小细胞浓度105CFU∕ml是细菌为基础有效的生物修复过程中所需的细胞浓度。

油椰废水中高浓度油的存在导致了非常低的水活动以及低的PH值，直接影响细菌的生存（NwucheandOgbonna,2011）．类似的条件下显示，电子和电子工业废水中的嗜水气单胞菌（UTM2）在初始PH为7时有100%的油和油脂的降解率（图8）。

增加或减少的电子和电子工业废水初始pH，导致油和油脂的降解率在90%（pH值11）和75%（PH值3）之间波动。

然而，这如此高的油和油脂的降解值可以归因于由于由于低/高PH值引起油和油脂的的结构的变化，将允许非生物