益生菌的筛选本科学位论文Word下载.docx

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指导教师签名：

益生菌的筛选

中文摘要

益生菌是一类对宿主有益的活性微生物。

它是定植于人体肠道、生殖系统内，能改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。

动物体内的益生菌主要有：

乳酸菌、酵母菌、部分霉菌等。

目前，国内外对各类微生物组成的复合活性益生菌产品比较多研究，其广泛应用于生物工程、食品安全、工农业以及生命健康领域。

本论文从酸奶、酒、酒曲和自制酵素样品中筛选出益生菌，以蛋白酶活力为指标，筛出酶活高的菌株，并对其在酵素中的应用进行初步探究。

研究结果如下：

（1）以酸奶、酒、酒曲和自制酵素为样品筛选益生菌，把样品稀释分别涂布于MRS、PDA和孟加拉红培养基上富集、分离，初步筛得42株菌，并编号保藏。

将菌株再次分离纯化，结合菌落观察和菌体显微镜观察，复筛出了18类形态特征各不相同的菌株，其中有2类乳酸菌，11类酵母菌，5类霉菌。

（2）将初筛得到的42株菌进行蛋白酶活力的测定，得乳酸菌、酵母菌和霉菌中酶活力最高的菌株分别是L4、Y14和M14，酶活为319.769U/mL、237.519U/mL和205.363U/mL。

并将L4进行分子生物学和生理生化鉴定为嗜热链球菌种。

（3）将L4、Y14参考徐祖炎的专利制作成酵素，20天后测得实验组的蛋白酶活力为316.269U/mL，对照组的蛋白酶活力为167.300U/mL。

初步说明L4、L14可以提高酵素中的蛋白酶活力这一指标，对酵素的发酵有一定的促作进用，可以提高酵素的功能性。

关键词：

益生菌，筛选，乳酸菌，酵母菌，霉菌，鉴定，酵素

Screeningofprobiotics

Abstract

Probioticsisakindofbeneficialmicroorganismstoitshost.Itisthegenerictermsofbeneficialmicroorganismthatcanproduceaccuratehealthbenefits,keepmicroecologicalbalanceforitshost,aswellasotherpowerfulfunctionsinhumanintestineandreproductivesystem.Thereareseveralbeneficialbacteriasandfungisinanimals:

lacticacidbacteria,yeastandsomemoulds,etc.Themostpowerfulproductsthatwearestudyingintheworldaremainlyallkindsofactiveprobioticscomposedofmicrobialsthatwehavementionedabove,whicharewidelyusedinbiologicalengineering,industrialarea,agriculturalarea,foodsafetyandhealthlifeareas.Inthisessay,theenzymeofprobioticsispurificatedfromyogurt,wineandhomemadeenzymesamples.Withtheproteaseactivitiesasanindex,enzymesofhighqualityisselected,andisapplicatedinenzymepreliminaryexplorationthen.Thefollowingaretheresearchresults:

（1）Theyogurt,wine,distiller'

syeastandhomemadeenzymearetookasthesample,thenthesampledilutionarecoatedontheredculturemediumMRS,PDAandBangladeshtoenrichandbeseparated,preliminarywegot42screeningisolates,andtheyarenumberedandpreserved.Afterthat,strainispurifiedagainandobservedwithmicroscope.18kindsofmorphologicalcharacteristicsofdifferentstrainsarescreenedoutafterasecondscreening.Therearetwokindsoflacticacidbacteria,11kindofyeastandfivetypesofmoldintotal.

（2）42strainsofbacteriagotintheearlyscreeningareputintheproteaseactivitytestoflacticacidbacteria.Thehighestenzymeactivityoflacticacidbacteria,yeastandthemoldofstrainsrespectivelyareL4,Y14andM14.Andproteaseactivityrespectivelyare319.769U/mLand237.519U/mLand205.363U/mL.AndL4isidentifiedasStreptococcusthermophilusaccordingtothemolecularbiologicalandphysiologicalandbiochemicalidentification.

（3）WiththereferencetoXuZuyan’spatent,L4andY14aremadeintoenzyme.After20days,theproteaseactivityoftheexperimentalgrouparemeasuredtobe316.269U/mLandproteaseactivitytobe167.300U/mLinthecontrolgroup.PreliminaryitshowsthatL4andL14canimprovetheindexofproteaseactivityofenzyme,promotetheenzymefermentationaswellasimprovethefunctionalityoftheenzyme.

Keywords:

Probiotics,Screening,Lacticacidbacteria,Yeast,Mold,Appraisal,Enzyme

目录

第1章绪论1

1.1益生菌概述1

1.1.1益生菌理论的产生1

1.1.2益生菌的定义1

1.1.3益生菌作用基本机理概述1

1.1.4益生菌的来源2

1.1.5益生菌的特征2

1.1.6益生菌的种类2

1.1.7益生菌的作用3

1.2益生菌的应用4

1.2.1益生菌食品4

1.2.2益生菌保健品5

1.3益生菌存在的问题5

1.4酵素6

1.4.1酵素的定义、作用及应用6

1.4.2评价微生物酵素的指标6

1.5本课题主要研究的内容和意义6

1.5.1研究内容6

1.5.2本课题研究的意义7

第2章实验材料与方法8

2.1材料与主要设备8

2.1.1实验材料8

2.1.2培养基8

2.1.3主要试剂8

2.1.4主要仪器设备9

2.2实验方法10

2.2.1菌株筛选10

2.2.2菌株蛋白酶活力的测定11

2.2.3菌株鉴定11

2.3菌株作用于酵素中的初探14

第3章实验结果与讨论15

3.1益生菌菌株的筛选15

3.1.1初筛15

3.1.2复筛15

3.2菌株蛋白酶活力的测定16

3.2.1赖氨酸标准曲线的制作16

3.2.2菌株蛋白酶活力的测定16

3.3菌株鉴定17

3.3.1菌落形态及菌体形态观察17

3.3.2L4菌株分子生物学鉴定25

3.3.3L4系统发育树的构建26

3.3.4L4的生理生化实验26

3.4L4和Y5菌株应用于酵素的初步探究27

结论与展望28

结论28

展望28

参考文献29

谢辞33

附录1磷酸氢二钠–磷酸二氢钠缓冲液配制表34

附录2L4基因序列35

第1章绪论

1.1益生菌概述

益生菌与人类的健康有着密切的关系，是人体的生态调节剂[1]，可以维持肠道的菌落平衡和抑制病原菌的生长[2]。

其有着重要的理论定义和广泛的生理作用，目前有许多关于益生菌的报道[3-4]。

1.1.1益生菌理论的产生

人体含有大量的微生物，定居于人体的各个部位[5]。

微生物与宿主之间有着密切的关系。

微生物对无菌动物的感染比较敏感[6]，因为其免疫系统低下和缺乏“竞争性定植”。

普通动物与无菌动物之间存在着许多差异，这使人们认识到微生物对人体的健康有着重要的意义[7]。

人体内共生的微生物对宿主的影响利弊共存。

利是微生物的某些代谢产物可为人体提供一定能量，可以促进矿物质的吸收和代谢途径；

人体内的微生物可以抵制病原体，防止疾病[6-8]。

弊是有些微生物可能与宿主之间构成病原关系，引起宿主的疾病、衰老或死亡。

微生物的某些代谢产物可具有致癌的活性，积累过多可能导致癌症[7]；

体内微生物菌相平衡遭到破坏时，会使某些有害菌转为优势菌，引起自体感染[9-10]。

正是出于对人体微生物作用的认识和要对微生物区系趋利避害的想法，促使了益生菌理论的产生[11]。

1.1.2益生菌的定义

益生菌（probiotics），也有译为“益生素、原生菌”等，是forlife——对生命有益。

1965年被Lilley和Stillwell阐述为“由一种微生物分泌的刺激其他微生物生长的物质或组织提取物”。

后来Fuller[15]、Guarner[12]等人也提出了差不多的定义。

国际营养学界普遍认可益生菌是一种对人体有益的菌，它们可直接作为食品添加剂服用，从而维持肠道菌丛的平衡[13]。

随着对益生菌研究的深入，益生菌的含义日趋完善，其定义也屡次被修订，益生菌数量及保健功效方面也都得到进一步丰实[14]。

1.1.3益生菌作用基本机理概述

益生菌被摄入宿主肠道后，在复杂的微生态环境中与近400种正常菌群汇合，改变生物体内的微生物群落，促进宿主的健康。

但益生菌的作用机理在理论上还不够成熟，目前主要有3种学说:

①优势种群学说;

②菌群屏障学说;

③微生物夺氧学说。

1.1.4益生菌的来源

益生菌的来源相当广泛，新鲜的果蔬中、人体粪便、母乳、发酵乳制品、传统发酵植物食品等都存在益生菌。

但其主要来源是动物肠道正常生理性菌和非肠道菌。

许多研究人员认为，益生菌来源与其特殊的商业化应用有着非常密切的关系；

但FAO/WHO专家建议，益生菌特定的生理作用比其来源更加重要。

因为婴儿出生时肠道实际上是无菌的，人体肠道菌群的来源具有很大的不确定性。

到现在为止，市场上还未出现基因工程改造的益生菌。

1.1.5益生菌的特征

益生菌有一些共同的特征，并非所有益生菌都必须具备所有特点，但其应尽量多地满足以下特征，为益生菌鉴定环节提供很好的标准[15-18]。

其特征如下：

源于宿主并对宿主健康有一定的促进作用；

能抵抗人体内各种酶及胆汁的消化作用，能正常生活于胃肠道中；

能抑制肠内病原体活性；

通过产生细菌素或抗菌的代谢产物等，选择性的调节微生物区系的组成；

是公认安全的微生物；

准确识别菌及其特性，有己被证明的安全性；

其制品按合理剂量服用时能具有临床有效性；

能是益生菌产品保持活性和稳定性，同时能用于大量生产并具有经济价值。

1.1.6益生菌的种类

目前已确认适用于生产的益生菌菌种较少，研究最多的是乳酸菌[13]。

大体上益生菌可分为乳酸菌、酵母菌和霉菌3大类。

已经发现的益生菌分别是双歧杆菌类：

长双歧杆菌、短双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等，乳酸杆菌类：

短乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等，链球菌类：

嗜热链球菌属等。

此外，还有一些酵母菌，如酿酒酵母菌、布氏酵母菌等，部分霉菌和非致病性大肠杆菌也可以是益生菌[19]。

1.1.6.1乳酸菌

乳酸菌（Lacticacidbacteria），是一类通过发酵糖类获得能量，从而产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏阳性细菌的总称，包括乳杆菌和乳链菌[20]。

乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、酒、腌渍食品等。

我国发酵剂中使用的乳酸菌有保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌、两歧双歧杆菌等，在生产中最常用的是保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌种纯培养发酵剂[21-22]。

1.1.6.2酵母菌

酵母菌是一种细胞形状呈圆形、卵圆形、椭圆形或柱形，无性繁殖的单细胞真菌。

主要有酿酒酵母及产脂酵母，酵母菌在酒精发酵阶段有着重要角色，为后续的醋化阶段提供底物—乙醇，但是进入酿醋发酵阶段后，数量则急剧减少，发酵结束后，几乎完全消失。

优良酵母菌的特性为[23]：

发酵前期繁殖速度快、发酵产酒精能力强、有一定的后繁殖能力、能产生较好较多的香味物质、生理耐性好等[24]。

分离鉴定酵母菌，可以为研究酵母菌在酵素等产品发酵过程中的生物特性的研究提供了一定的基础[25]。

1.1.6.3霉菌

霉菌是丝状真菌的通称。

其菌落一般较大，菌丝呈长管、分枝状，无横隔壁，具多个细胞核，并会聚成菌丝体。

霉菌通常用孢子的颜色来称呼，如黑霉菌或红霉菌。

在许多产品生产过程中，霉菌起着非常重要的作用。

霉菌能产生许多酶类，在酒类酿造过程中起糖化作用[26-28]。

1.1.7益生菌的作用

1.1.7.1预防或缓解腹泻

据报道，饮食习惯不良或服用抗生素会引起肠道菌群失衡，从而导致腹泻等症状。

若经常服用含益生菌的保健食品，有助于恢复正常的肠道pH值和肠道菌群的平衡，可预防或缓解腹泻症状[29]。

1.1.7.2促进肠道消化系统健康

许多益生菌可在胃肠道内产生消化酶，这些酶可使人体更好地消化食物及其营养成分。

益生菌可以抑制有害菌在肠道内的繁殖和进入血液循环系统，减少毒素，促进肠道蠕动，从而提高肠道机能，改善排便状况。

如嗜酸乳杆菌可分泌乳糖酶，分解乳糖，从而缓解乳糖不耐症。

1.1.7.3增强人体免疫功能

肠道内存在非常发达的免疫系统，但人体的免疫功能会随着年龄的增长而降低。

研究表明，益生菌可以通过刺激肠道内的免疫机能，将过低或过高的免疫活性调节到正常状态[30]。

益生菌的免疫调节作用有助于抗癌与抑制过敏性疾病。

益生菌对细胞免疫调节作用、体液免疫调节作用和非特异性免疫调节作用都有一定的影响。

如双歧杆菌在动物体内能够刺激B淋巴细胞活化、增殖和分泌抗体，来发挥体液免疫功能[31]。

科学研究表明，益生菌对宿主细胞免疫系统具有正面作用如增强抵抗力。

1.1.7.4降低血脂胆固醇[32]

益生茵可吸附食物中的胆固醇，促使其排出体外[33]。

益生菌还能吸附肠内的胆汁酸，增强胆固醇转化成胆汁酸，从而减轻血清中胆固醇的含量[34]。

Kawase等研究证实，乳酸菌属和链球菌属的发酵产物能降低血液中总胆固醇水平，增加高密度脂蛋白水平。

Kanagawa等从啤酒酵母和瑞士乳酸杆菌发酵乳中分离的三肽物质具有抑制血管紧张素转移酶活性的作用[35]。

大量科学研究证实酸牛奶中富含益生菌，可降低胆固醇水平，长期补充益生菌还可预防骨质疏松。

已申报具有降低血脂脂胆固醇功能的专利菌株非常多，如：

L.ucidophilusRP32等[36]。

研究表明，益生菌降低血脂胆固醇水平的作用机制可能包括胆盐的脱结合、胆固醇掺入细胞膜、益生菌对胆固醇的吸收、菌体对胆固醇的吸附、菌体对胆固醇的转化等。

1.1.7.5预防阴道感染

酸牛奶中的嗜酸乳杆菌可抑制阴道内白色念珠菌的繁殖。

在欧洲所做的双盲对照试验证实了益生菌有预防阴道感染的作用。

1.1.7.6产生重要的营养物质

益生菌能产生维生素、短链脂肪酸、氨基酸等，对骨骼成长和心脏健康起重要作用。

益生菌可分解脂肪、蛋自质和糖，有利于消化吸收[37]。

李新红[38]等在健康成体獐的基础口粮中添加了复合酶和益生菌制剂进行消化代谢试验，发现添加复合酶和益生菌后，能够显著提高獐对粮食中粗蛋自、粗纤维和矿物质等营养物质的利用率。

1.2益生菌的应用

双歧杆菌、乳杆菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和酵母菌等益生菌是目前应用最广的。

益生菌的功效越来越受关注,已在食品工业特别是发酵乳品工业中得到了广泛的应用[39]。

益生菌理论的研究己在国内外进入高潮的同时，益生菌的应用也已形成了强大的产业。

目前国内外益生菌的应用主要有以下几方面。

1.2.1益生菌食品

益生菌食品指含有存活且有益于人体健康益生菌的食品。

益生菌较多应用于发酵乳制品。

另外在一些面包、饼干等食品中也有添加。

1.2.1.1益生菌酸奶

益生菌酸奶是以益生菌为主要菌种所生产的发酵乳。

它可缓冲胃液和胆汁的pH，服用其制成的片剂或胶囊，益生菌更容易通过人体消化道，促进健康作用。

1.2.1.2益生菌乳制品

益生菌乳制品指在一般乳制品中添加益生菌的食品。

应用于奶粉制品比较多，如欧美国家在发酵乳饮料和液态奶中添加乳杆菌和双歧杆菌。

有研究表明向干酪中添加粪肠球菌，有保健作用的同时，还可改善其品质[40]。

1.2.1.3益生菌谷物制品

益生菌在80年代中期前后应用于谷物制品，由于其生产较复杂，所以品种不多。

美国威斯康星大学的学生为M&

M公司开发了一种松脆曲奇，里面加有长双岐杆菌和嗜酸乳杆菌等益生菌的[41]。

1.2.2益生菌保健品

保健品是用益生菌配合其他物质制成的，主要包括益生菌保健食品和益生菌药品。

我国益生菌制品主要以药品形式被大家接受。

微生态调节剂可用于健康人，增进健康素质，提高健康水平，同时也会产生治疗与防病的目的。

我国现有益生菌制剂有妈咪爱、促菌生、金双岐、益菌生、乳康生等品牌。

1.3益生菌存在的问题

益生菌的作用已被人们接受，其在发酵食品或食品添加剂有许多的应用，但也存在许多有待解决的问题，如:

①目前已经确认的适宜的益生菌菌种不多，仅有乳酸杆菌、链球菌、芽抱杆菌、双歧杆菌及酵母等种属；

②一些产品中的益生菌在加工、运输过程中易失活；

③有些活菌难以经受低PH值的胃酸、胆汁酸及胰液等的作用，数量少，难以发挥作用；

④关于益生菌在体内的作用机理的还不明确，许多学说相互矛盾。

1.4酵素

1.4.1酵素的定义、作用及应用

酵素（enzyme）又称为酶，是产生于生物体中具有催化作用的活性大分子[42]。

酵素可催化生物体内几乎所有的生理生化反应。

人体的能量摄取、新陈代谢、成长和繁殖等生命现象，都必须通过酵素的帮助才能完成。

体内酵素含量和活性的高低，影响着人体的病变和衰老。

随着年龄的增大，人体内的酵素数量与活力呈下降趋势。

患病者体内的酵素代谢往往是紊乱的，应适当补充特定种类的酵素，可使人体恢复健康且维持良好的状态。

因此，现在酵素已被广泛应用于食品和保健品当中。

此外，酵素具有分解老化细胞、清洁皮肤、淡化皱纹、消除青春痘、彻底改善肌肤状况等美容功效，还有去除油脂等减肥作用。

因此，酵素已经开始应用于化妆品行业。

1.4.2评价微生物酵素的指标

微生物酵素含有丰富的酶、维生素、矿物质和次生代谢产物等。

微生物酵素中的功效酶有蛋白酶、脂肪酶和超氧化物歧化酶等。

蛋白酶能催化蛋白质水解，在人体中的主要作用是分解食物中蛋白质和死亡的细胞，促进营养物质的吸收，有美容效果。

脂肪酶是一类水解油脂的酶，起分解油脂的作用，有减肥、保健效果。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种特殊的金属酶，可以清除机体内超氧阴离子，可防衰老、抗辐射、抗炎和防治肿瘤等。

因此，评价微生物酵素的指标主要是以上3种酶的含量和活力。

除此之外还有总酚含量、还原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力等都可以作为指标，可以系统的考察微生物酵素的抗氧化活力[43]。

1.5本课题主要研究的内容和意义

1.5.1研究内容

（1）初筛：

把酸奶、酒、酒曲和自制酵素[44]样品稀释后分别涂布于MRS、PDA、孟加拉红培养基上倒置培养，富集、分离出乳酸菌、酵母菌和霉菌，并编号保藏。

（2）复筛：

对初筛得到的菌株进一步分离纯化。

（3）菌种鉴定：

菌株形态学观察、分子生物学鉴定、生理生化鉴定。

（4）应用初探：

测定初筛菌株的蛋白酶活力，得酶活高的乳酸菌和酵母菌，参考徐祖炎[45]的专利制成酵素，探究其蛋白酶活力的变化。

1.5.2本课题研究的意义

（1）研究结果有助于进一步了解酸奶、酒、酒曲、自制酵素中微生物的种类；

（2）对改良酵素生产工艺及设备，提高产品产量与功能性及技术创新有重要的参考价值；

（3）筛选的菌株是实验室科研工作上宝贵的资源，为进一步研究提供菌种。

第2章实验材料与方法

2.1材料与主要设备

2.1.1实验材料

（1）蒙牛酸奶；

（2）福建省三明市尤溪县的酒和酒曲；

（3）自制酵素[44]：

红糖：

水果：

蒸馏水=1：

3：

10，自然发酵60-90天，得棕黄色上清即为果蔬酵素。

2.1.2培养基

（1）MRS培养基：

10g蛋白胨，10g牛肉浸膏，5g酵母浸膏，20g葡萄糖，5g醋酸钠，1mL吐温-80，2g柠檬酸氢二胺，2gMgSO4·

7H2O，0.05gMnSO4·

4H2O，2gK2HPO4，蒸馏水1000mL，琼脂20g，2%CaCO3，pH6.2-6.6。

121℃高压蒸汽灭菌20min。

（2）PDA培养基：

马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL，琼脂20g。

（3）孟加拉红培养基：

蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢