微生物学实验指导Word文档下载推荐.docx
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实验八生素效价的生物测定
微生物综合实验柠檬酸发酵及提取
实验一学显微镜的结构及使用
一、实验目的：
人的眼睛只能识别大小为0.1㎜的物体。
显微镜是精密的放大仪器，是生物学研究不可缺少的工具。
我们用它可以观察肉眼看不见的微小生物的结构。
中学最常用的是光学显微镜，为了正确操作、妥善保管和维护显微镜，使之延长使用年限，我们必须首先了解显微镜的结构和功能。
1、了解普通光学显微镜的基本构造，能够规范和较熟练地使用。
2、了解几种特殊光学显微镜的构造、工作原理和用途。
二显微镜的结构：
一台显微镜包括机械装置和光学系统两大部分，注意比较和识别。
1.机械部分
（1）镜筒为显微镜上部圆形中空的长筒，筒口上端安装目镜，下端与物镜转换器相连。
作用是保护成像的光路与亮度。
（2）转换器固着在镜筒下端，分两层，上层固着不动，下层可自由转动。
转换器上有2～4个圆孔，用来安装不同倍数的低倍或高倍物镜。
（3）粗准焦螺旋位于镜臂的上方，可以转动，以使镜筒能上下移动，从而调节焦距。
（4）细准焦螺旋位于镜臂的下方，它的移动范围较粗准焦螺旋小，可以细调焦距。
（5）镜座是位于镜臂的下方，显微镜的底部，呈马蹄形的金属座。
用以稳固和支持镜身。
（6）镜柱从镜座向上直立的短柱。
上连镜臂，下连镜座，可以支持镜臂和载物台。
）
（7）倾斜关节镜柱和镜臂交界处有一个能活动的关节。
它可以使显微镜在一定的范围内后倾（一般倾斜不得超过45°
）便于观察。
但是在使用临时封片观察时，禁止使用倾斜关节，尤其是装片内含酸性试剂时严禁使用，以免污损镜体。
（8）载物台从镜臂向前方伸出的金属平台。
呈方形或圆形，是放置玻片标本的地方。
其中央具有通光孔，在通光孔的左右有一个弹性的金属压片夹，用来压住载玻片。
较高级的显微镜，在载物台上常具有推进器，它包括夹片夹和推进螺旋，除夹住切片外，还可使切片在载物台上移动。
2.光学部分
（1）目镜它是安装在镜筒上端的镜头。
是由一组透镜组成的，它可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如5×
、10×
、15×
、20×
。
（2）物镜是决定显微镜质量的关键部件。
安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。
一般有三个放大倍数不同的物镜，即：
低倍物镜（8×
或10×
）、高倍物镜（40×
或45×
）和油浸物镜（90×
或100×
），根据需要可选择一个使用。
显微镜的放大倍数是目镜倍数乘以物镜的倍数。
（3）反光镜在聚光器的下面有一个一面平另一面凹的双面圆镜。
可作各种方向的翻转，光线较强时使用平面镜，反之使用凹面镜。
（4）聚光器（学生用显微镜一般没有这个装置）是由凹透镜组成的，它可以集中反光镜投射来的光线。
在镜柱前面有一个聚光器调节螺旋，它可以使聚光器升降，用以调节光线的强弱，下降时明亮度降低，上升时明亮度加强。
（5）虹彩光圈又称可变光阑，由多数金属片组成（学生用显微镜一般没有这个装置），在较高级的显微镜上具有此装置。
使用时移动其把柄，可控制聚光器透镜的通光范围，用以调节光的强度。
虹彩光圈下常附有金属圈，其上装有滤光片，可调节光源的色调。
（6）遮光器简单的显微镜无聚光器和虹彩光圈，而装有遮光器。
遮光器呈圆盘状，上面有大小不等的圆孔（光圈）。
光圈对准通光孔，可以调节光线的强弱。
3.显微镜的成像原理（放大原理）
光线→反光镜→遮光器→通光孔→标本（一定要透明）→物镜的透镜（第一次放大成倒立实像）→镜筒→目镜（再放大成虚像）→眼。
三、显微镜的使用方法
（1）取镜安放
取镜右手握住镜臂，左手平托镜座，保持镜体直立。
（特别要禁止单手提着显微镜走，防止目镜从镜筒中滑脱）。
安放放置桌边时动作要轻。
一般应在身体的前面，略偏左，镜筒向前，镜臂向后，距桌边7～10㎝处，以便观察和防止掉落。
安放目镜和物镜。
（2）对光
转动转换器，使低倍物镜正对通光孔。
左眼注视目镜内，右眼同时睁开，用手转动反光镜，面向光源。
在目镜里看见一个圆形、明亮的视野（一定要用非直射光）。
把一个较大的光圈对准通光孔。
（3）低倍镜的使用
观察任何标本都必须先用低倍镜。
①放置切片升高镜筒，把玻片标本放在载物台中央，标本材料正对通光孔的中心，用压片夹压住载玻片的两端。
②调焦两眼从侧面注视物镜，转动粗准焦螺旋，让镜筒徐徐下降，至物镜距玻片2～5㎜处。
然后用左眼注视目镜，右眼同时睁开，（以便绘图），同时用手反方向（逆时针方向）转动粗准焦螺旋，使镜筒缓缓上升，直到看清物像为止。
如果不够清楚，可用细准焦螺旋调节。
（不可以在调焦时边观察边使镜筒下降，以免压碎装片和镜头。
③低倍镜的观察由所用的目镜放大倍数与物镜放大倍数相乘，即为原物被放大的倍数。
如果物像不在视野中央，要慢慢移动到视野中央，适当再进行调节。
4）高倍镜的使用
①选好目标先用低倍物镜确定要观察的目标，将其移至视野中央。
转动转换器，把低倍物镜轻轻移开，原位置小心换上高倍物镜。
（用高倍物镜工作距离较短，操作要十分仔细，以防镜头碰击玻片）。
②调焦在正常情况下，当高倍物镜转正之后，在视野中央即可见到模糊的物像，只要向反时针方向略微调动细准焦螺旋，既可获得清晰的物像。
在换上高倍物镜观察时，视野变小变暗，要重新调节视野亮度，可升高聚光器或利用凹面反光镜。
（5）油镜的使用（中学生一般不使用，在这里不做详述）
（6）使用后的整理
观察结束，应先将镜筒升高，聚光器下降，再取下切片，然后转动转换器，使物镜与通光孔错开，做好清洁工作。
清洁完毕，再下降镜筒，使两个物镜位于载物台上通光孔的两侧，呈“八”字形，将反光镜转至与载物台垂直，罩上防尘罩，仍用右手握住镜臂，左手平托镜座，按号放回镜箱中。
四讨论：
1．降低镜筒时，操作者最关键的姿势应该是什么？
其重要性是什么？
2．当视野太明亮，光线刺眼时，这样的光线会使人眼的视网膜永久性损坏。
其原因和解决的方法是什么？
一、实验目的
（1）熟悉玻璃器皿的洗涤包装和灭菌前的准备工作。
（2）学习微生物培养基和无菌水的制备，了解培养基配方中各成分的作用、制备流程及各环节的操作技术与应用。
（3）学习并掌握培养基的高压蒸气灭菌原理、操作关键技术和灭菌技术。
二、实验原理
培养基的制备原理：
培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质。
人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件。
把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所。
自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异。
但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等。
此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压。
根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类。
按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基。
根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等。
培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基。
固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化。
琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固。
因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内（25℃-37℃）不会融化而保持固体状态。
高压蒸气灭菌原理：
高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。
待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。
导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。
表Ⅴ-2蛋白质含水量与凝固所需温度的关系
卵自蛋白含水量（%）
30分钟内凝固所需温度（℃）
50
25
18
6
0
56
74-80
80-90
145
160-170
表Ⅴ-3干热与湿热穿透力及灭菌效果比较
温度（℃）
时间（小时）
透过布层的温度（℃）
灭菌
20层
40层
100层
干热130-140
4
86
72
70.5
不完全
湿热105.3
3
10l
完全
在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：
一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低（表Ⅴ-2），二是湿热的穿透力比干热大（表Ⅴ-3）；
三是湿热的蒸汽有潜热存在，每1克水在100℃时，由气态变为液态时可放出2.26kJ（千焦）的热量。
这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
在使用高压蒸汽灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要，因为空气膨胀压大于水蒸汽的膨胀压，所以，当水蒸汽中含有空气时，在同一压力下，含空气蒸汽的温度低于饱和蒸汽的温度。
灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系见表Ⅴ-4。
一般培养基用1.05kg/cm2，121.3℃15-30分钟可达到彻底灭菌的目的。
灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。
例如含糖培养基用0.56kg/cm2（8磅/英寸2），112.6℃灭菌15分钟，但为了保证效果，可将其他成分先行121.3℃，20分钟灭菌，然后以无菌操作手续加入灭菌的糖溶液。
又如盛于试管内的培养基以1.05kg/cm2，121.3℃灭菌20分钟即可，而盛于大瓶内的培养基最好以1.05kg/cm2灭菌30分钟。
表Ⅴ-4灭菌锅内留有不同分量空气时，压力与温度的关系
压力数
全部空气排出时的温度（℃）
2/3空气排出时的温度
（℃）
l/2空气排出时的温度（℃）
1/3空气排出时的温度（℃）
空气全不排出时的温度（℃）
千克
（公斤/厘米2）
（kg/cm2）
磅/英寸2
（1b/in2）
0.35
0.70
1.05
1.40
1.75
2.10
5
10
15
25
30
108.8
115.6
121.3
126.2
130.0
134.6
100
109
115
121
126
130
94
105
112
118
124
128
90
蒸汽压力所用单位为kg/cm2（千克/厘米2），它与1b/in2（磅/英寸2）和温度的换算关系见表Ⅴ-5。
表Ⅴ-5蒸汽压力与蒸汽温度换算关系
蒸汽压力
大气压
压力表读数
蒸汽温度
kg/cm2
1b/in2
1.00
1.25
1.50
2.00
2.50
3.00
0.00
0.25
0.50
0.75
3.75
7.50
11.25
15.00
22.50
30.00
100.0
107.0
112.0
115.0
121.0
128.0
134.5
三、实验器材
1．药品琼脂三种典型微生物的配方药品；
2．材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，电子称，10×
200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳，标签，培养皿。
3．设备高压蒸汽灭菌锅、烘箱、冰箱、电炉等
四、实验步骤
1、称取药品放在大烧杯中，加入蒸馏水用玻璃棒搅拌并加热溶化，等药品溶解
后用pH试纸调节pH至7.4-7.6，如有沉淀应过滤后分装，每支试管约加入9ml。
每组分装30支，加上棉塞，包上牛皮纸，准备灭菌。
装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5，装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限。
在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染。
2、无菌水准备
在试管或瓶内先盛以适量的蒸馏水〔或生理盐水O．85％NaCl），盖好棉塞，包上牛皮纸使其灭菌后，其水量恰为9ml。
每组准备10支与牛肉膏蛋白胨培养基可放在同一试管架上，以一大张牛皮纸包扎写上姓名。
准备灭菌。
3、高压灭菌
手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：
（1）首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。
注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。
三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。
（3）加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。
再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。
（4）用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。
待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。
当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。
本实验用1.05kg/cm2，121.3℃，20分钟灭菌。
（5）灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至0时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
如果压力未降到0时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。
（6）将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。
五、讨论
1、棉塞的作用？
附录培养基的配制
一、牛肉膏蛋白胨培养基（培养细菌用）
牛肉膏3g
蛋白胨10g
NaCl5g
琼脂15—20g
水1000ml
pH7．0—7．2
1．05kg/cm2 ，121．3℃灭菌20分钟。
二、淀粉琼脂培养基（高氏1号培养基，培养放线菌用）
可溶性淀粉20g
KNO3 1g
NaCl0．5g
K2 HPO4 0．5g
MgSO4 0．5g
FeSO4 0．01g
琼脂20g
pH7．2—7．4
配制时，先用少量冷水，将淀粉调成糊状，在火上加热，边搅拌边加水及其他成分，溶化后，补足水分至1000ml。
1．05kg/cm2 ，121．3℃灭菌20分钟。
三、查氏培养基（培养霉菌用，实验16）
NaNO3 2g
K2 HPO4 1g
KCl0．5g
蔗糖30g
pH自然
四、马丁氏（Martin）琼脂培养基（分离真菌用）
葡萄糖10g
蛋白胨5g
KH2 PO4 1g
MgSO4 ·
7H2 O0．5g
1/3000孟加拉红（rosebengal，玫瑰红水溶液）
100ml
蒸馏水800ml
0．56kg/cm2 （8磅/英寸2 ），112．6℃灭菌30分钟。
临用前加入0．03%链霉素稀释液100ml，使每毫升培养基中含链霉素30μg。
五、马铃薯培养基（培养真菌用）
马铃薯200g
蔗糖（或葡萄糖）20g
马铃薯去皮，切成块煮沸半小时，然后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补足水至1000ml。
六、麦芽汁琼脂培养基
1．取大麦或小麦若干，用水洗净，浸水6—12小时，置15℃阴暗处发芽，上盖纱布一块，每日早、中、晚淋水一次，麦根伸长至麦粒的两倍时，即停止发芽，摊开晒干或烘干，贮存备用。
2．将干麦芽磨碎，一份麦芽加四份水，在65℃水浴锅中糖化3—4小时，糖化程度可用碘滴定之。
3．将糖化液用4—6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用鸡蛋白澄清，方法是将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至生泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后再过滤。
4．将滤液稀释到5—6波美度，pH约6．4，加入2%琼脂即成。
七、葡萄糖-醋酸盐培养基
葡萄糖1g
酵母浸膏2．5g
醋酸钠8．2g
琼脂15g
蒸馏水1000ml
pH4．8
分装试管，0．70kg/cm2 （10磅/英寸2 ），115．2℃灭菌20分钟后制成斜面。
八、半固体肉膏蛋白胨培养基
肉膏蛋白胨液体培养基100ml
琼脂0．35—0．4g
pH7．6
九、合成培养基
（NH4 ）2 PO4 1g
KCl0．2g
7H2 O0．2g
豆芽汁10ml
pH7．0
加12ml0．04%的溴甲酚紫（pH5．2—6．8，颜色由黄色变紫色，作指示剂）。
十、豆芽汁蔗糖（或葡萄糖）培养基
黄豆芽100g
蔗糖（或葡萄糖）50g
称新鲜豆芽100g，放入烧杯中，加水1000ml，煮沸约半小时，用纱布过滤。
用水补足原量，再加入蔗糖（或葡萄糖）50g，煮沸溶化。
十一、油脂培养基
牛肉膏5g
香油或花生油10g
1．6%中性红水溶液1ml
pH7．2
注：
1．不能使用变质油。
2．油和琼脂及水先加热。
3．调好pH后，再加入中性红。
4．分装时，需不断搅拌，使油均匀分布于培养基中。
十二、淀粉培养基
NaCl5克
牛肉膏5克
可溶性淀粉2g
十三、明胶培养基
牛肉膏蛋白胨液100ml
明胶12—18g
在水浴锅中将上述成分溶化，不断搅拌。
溶化后调pH7．2—7．4。
十四、蛋白胨水培养基（实验42）
十五、糖发酵培养基（实验41）
蛋白胨水培养基1000ml
酸性复红水溶液①2—5ml
另配20%糖溶液（葡萄糖、乳糖、蔗糖等）各10ml。
制法：
1．将上述含指示剂的蛋白胨水培养基（pH7．6）分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使充满培养液。
2．将已分装好的蛋白胨水和20%的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水1．05kg/cm2 ，121．3℃灭菌20分钟；
糖溶液0．56kg/cm2 （8磅/英寸2 ），112．6℃灭菌30分钟。
3．灭菌后，每管以无菌操作分别加入20%的无菌糖溶液0．5ml（按每10ml培养基中加入20%的糖液0．5ml，则成1%的浓度）。
配制用的试管必须洗干净，避免结果混乱。
①0．5%酸性复红水溶液100ml加1mol/LNaOH16ml即成。
十六、葡萄糖蛋白胨水培养基（实验42）
葡萄糖5g
K2 HPO4 2g
将上述各成分溶于1000ml水中，调pH7．0—7．2，过滤。
分装试管，每管10ml，0．56kg/cm2 （8磅/英寸2 ），112．6℃灭菌30分钟。
十七、H2S试验用培养基（实验42）
蛋白胨20g
柠檬酸铁铵0．5g
Na2 S2 O3 0．5g
先将琼脂、蛋白胨溶化，冷至60℃加入其他成分。
分装试管，0．56kg/cm2 （8磅/英寸2 ），112．6℃灭菌15分钟，备用。
十八、柠檬酸盐培养基（实验42）
NH4 H2 PO4 1g
MgSO4 0．2g
柠檬酸钠2g
1%溴麝香草酚蓝酒精液10ml
将上述各成分加热溶解后，调pH6．8，然后加入指示剂，摇匀，用脱脂棉过滤。
制成后为黄绿色，分装试管，1．05kg/cm2 ，121．3℃灭菌20分钟后制成
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