酶工程 110章题目及答案文档格式.docx

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（X）4、RNA剪切酶是催化RNA分子进行剪切反应的核酸类酶。

（V）5、水解酶在水溶液中不能催化其逆反应。

五、简答题

1、何谓酶工程，其主要内容有哪些？

答：

酶的生产与应用的技术过程称为酶工程。

酶的生产是指通过各种方法获得人们所需的酶的技术过程，主要包括微生物发酵产酶，动植物培养产酶和酶的提取与分离纯化等。

酶的应用是在人工控制条件的反应器中，通过酶的催化作用获得人们所需的物质或者除去不良物质的技术过程。

主要包括酶反应器的选择与设计以及酶在各个领域的应用等。

在酶的生产与应用过程中，人们发现酶具有稳定较性差、催化效率不够高、游离酶通常只能使用一次等弱点，为此研究、开发了各种酶的改性技术，以促进酶的优质生产和高效应用。

酶的改性是通过各种方法改进酶的催化特性的技术过程，主要包括酶分子修饰、酶固定化、酶非水相催化、酶定向进化等。

酶工程的主要内容包括：

微生物细胞发酵产酶，动植物细胞培养产酶，酶的提取与分离纯化，酶分子修饰，酶、细胞、原生质体固定化、酶定向进化、酶反应器和酶的应用等。

2、试述酶活力测定的基本步骤。

酶活力测定通常包括两个阶段。

首先在一定条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物的变化量。

一般经过如下几个步骤：

（1）根据酶催化的专一性，选择适宜的底物，并配制成一定浓度的底物溶液。

所使用的底物必须均匀一致，达到酶催化反应所要求的纯度。

在测定酶活力时，所使用的底物溶液一般要求新鲜配制，有些反应所需的底物溶液也可预先配制后置于冰箱保存备用。

（2）根据酶的动力学性质，确定酶催化反应的温度、pH、底物浓度、激活剂浓度等反应条件。

温度可以选择在室温（25℃）、体温（37℃）、酶反应最适温度或其他选用的温度；

pH应是酶催化反应的最适pH；

底物浓度应大于5Km等。

反应条件一旦确定，在整个反应过程中应尽量保持恒定不变。

故此，反应应该在恒温槽中进行，pH的保持恒定是采用一定浓度和一定的pH缓冲溶液。

有些酶催化反应，要求一定浓度的激活剂等条件，应适量添加。

（3）在一定的条件下，将一定量的酶液和底物溶液混合均匀，适时记下反应开始的时间。

（4）反应到一定的时间，取出适量的反应液，运用各种生化检测技术，测定产物的生成量或底物的减少量。

3、简述影响酶催化作用的主要因素。

酶的催化作用受到底物浓度、酶浓度、温度、pH、激活剂浓度、抑制剂浓度等诸多因素的影响。

（1）底物浓度：

在底物浓度较低的情况下，酶催化反应速度与底物浓度成正比，反应速度随着底物浓度的增加而加快。

当底物浓度达到一定的数值时，反应速度的上升不再与底物浓度成正比，而是逐步趋向平衡。

（2）酶浓度：

在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比。

（3）温度的影响：

每一种酶的催化反应都有其适宜的温度范围和最适温度。

在适宜温度范围内，酶才能进行催化反应；

在最高温度条件下，酶的催化反应速度达到最大。

（4）pH的影响：

酶的催化作用与反应液的pH有很大关系。

每一种酶都有各自的适宜pH范围和最适pH。

只有在适宜pH范围内，酶才能显示其催化活性在最适pH条件下，酶催化反应速度达到最大。

（5）抑制剂的影响：

在抑制剂的条件下，酶的催化活性降低甚至丧失，从而影响酶的催化功能。

抑制剂有可逆性抑制剂和不可逆性抑制剂之分。

不可逆性抑制剂与酶分子结合后，抑制剂难以除去，酶活性难以恢复。

可逆性抑制剂与酶的结合是可逆的，只要将抑制剂除去，酶活性即可恢复。

（6）激活剂的影响：

在激活剂的影响下，酶的催化活性提高或者由无性得酶原生成有催化活性的酶。

4、举例说明酶催化的绝对专一性和相对一性。

一种酶只能催化一种底物进行一种反应，这种高度的专一性称为绝对专一性。

当酶作用的底物含有不对称碳原子时，酶只能作用于异构体的一种。

这种绝对专一性称为立体异构专一性。

例如，天冬氨酸氨裂合酶【EC4.3.1.1】，仅作用于L-天冬氨酸，经过脱氨基作用生成延胡索酸（反丁烯二酸）及其逆反应都一概不起作用。

一种酶能够催化结构相似的底物进行某种相同类型的反应，这种专一性称为相对专一性。

相对专一性可分为键专一性和基团专一性。

键专一性的酶能够作用于具有相同化学键的一类底物。

如，酯酶可催化所有含酯键的酯类物质水解生成醇和酸。

基团专一性的酶则要求底物含有某一相同的基团。

如，胰蛋白酶【EC3.4.31.4】选择性地水解含有赖氨酰-或精氨酰-

羰基肽键的物质，不管是氨酰、酯或多肽、蛋白质都能被该酶水解。

六、综合分析题,试述木瓜蛋白酶的生产方法。

木瓜蛋白酶可以采用提取分离法、基因工程酶发酵法、植物细胞培养法等多种方法进行生产。

（1）提取分离法：

从木瓜的果皮中获得木瓜乳汁，通过各种分离纯化技术获得木瓜蛋白酶。

（2）发酵法：

通过DNA重组技术将木瓜蛋白酶的基因克隆到大肠杆菌等微生物中，获得基因工程菌，再通过基因工程菌发酵获得木瓜蛋白酶。

（3）植物细胞培养法：

通过愈伤组织诱导获得木瓜细胞，再通过植物细胞培养获得木瓜蛋白酶

第二章微生物发酵产酶

名词解释

1、酶的发酵生产2、转录3、翻译4、酶的诱导

5、酶的反馈阻遏6、分解代谢物阻遏7、发酵动力学

1、转录是以　DNA 

为模板，以　核苷三磷酸 

为底物，在_依赖DNA的RNA聚合酶 

的作用下生成　RNA 

的过程。

2、微生物产酶方式可以分为同步合成型，　延续合成型 

中期合成型，　滞后合成型 

四种。

3、生长因素是　细胞生长繁殖 

所必需的　微量有机化合物 

。

4、莫诺德常数Ks是指生长速率达到　最大比生长速率一半 

时的　限制性基质浓度 

5、发酵动力学是研究发酵过程中细胞生长速率，　产物生成速率 

，基质消耗速率及其影响因素的学科。

1、可以通过添加（C）使分解代谢物阻遏作用解除。

A、诱导物B、激活剂C、cAMPD、ATP

2、在酶发酵过程中添加表面活性剂可以（D）。

A、诱导酶的生物合成B、阻遏酶的生物合成C、提高酶活力D、提高细胞透过性

3、有些酶在细胞进入平衡期以后还可以继续合成较长的一段时间，这是由于（A）。

A、该酶所对应的mRNA稳定性好B、该酶所对应的DNA稳定性好C、细胞自溶后使酶分泌出来D、培养基中还有充足的营养成分

4、莫诺德常数是指（B）

A、反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。

B、比生长速率达到最大比生长速率一半时的限制性基质浓度。

C、产酶速率达到最大产酶速率一半时的限制性基质浓度。

D、细胞生长速率达到最大细胞生长速率一半时的限制性基质浓度。

（X）1、固定化细胞在一定的空间范围内生长繁殖，由于细胞密度增大，使生化反应加速，所以能够提高酶活力。

（V）2、某些酶的催化反应产物可以诱导该酶的生物合成。

（V）3、在酶的发酵生产中，为了提高产酶率和缩短发酵周期，最理想的酶合成方式是延续合成型。

（X）4、氨酰-tRNA合成酶具有识别mRNA和tRNA的功能。

（X）5、固定化原生质体与固定化细胞一样可以进行生长繁殖和新陈代谢。

　　五、简答题

　　1、为什么属于滞后合成型的酶要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期以后才开始合成？

　　答：

属于滞后合成型的酶，之所以要在细胞生长一段时间甚至进入平衡期后才开始合成，主要有两个原因：

一是由于酶的生物合成受到培养基中阻遏作用，只有随着细胞的生长，阻遏物几乎被细胞用完而解除阻遏以后，酶才开始大量合成；

二是由于该类型酶对所对应的mRNA稳定性好，可以在细胞生长进入平衡期后的相当长的一段时间内，继续进行酶的生物合成。

　　简述微生物发酵产酶培养基的主要组分及其作用。

培养基的主要组成包括：

碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

　　碳源是指能够为细胞提供碳素化合物的营养物质。

在一般情况下，碳源也是为细胞提供能量的能源。

碳是构成细胞的主要元素之一，也是所有酶的重要组成元素。

所以碳源是酶的生物合成法生产中必不可少的营养物质。

　　氮源是指能向细胞提供氮元素的营养物质。

氮元素是各种细胞中蛋白质。

核酸等组分的重要组成元素之一，也是各种酶分子的组成元素。

氮源是细胞生长、繁殖和酶的生产的必不可少的营养物质。

　　无机盐的主要作用是提供细胞生命活动所必不可缺的各种无机元素，并对细胞内外的PH、氧化还原电位和渗透压起调节作用。

　　生长素是指细胞生长繁殖所必需的微量有机化合物。

主要包括各种氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生素等。

氨基酸是蛋白质的组分；

嘌呤和嘧啶是核酸和某些辅助酶或辅基的组分；

维生素主要是起辅酶作用。

　　简述微生物发酵产酶过程中工艺条件的限制性。

微生物发酵产酶的过程中，必须根据需要和变化情况，适时进行PH、温度、溶解氧等发酵工艺条件的控制。

（1）PH的调节控制：

培养基的PH与细胞的生长繁殖以及发酵产酶关系密切，不同的细胞，其生长繁殖的最适PH有所不同，细胞发酵产酶的最适PH与生长最适PH也往往有所不同，所以必须根据不同的细胞特性和发酵的不同阶段进行PH的控制。

　　有些细胞可以同时生产若干种酶，在生产过程中，通过控制培养基的PH，往往可以改变各种酶之间的产量比例。

　　随着细胞的生长繁殖和新陈代谢产物的积累，培养基的PH往往会发生变化。

所以在发酵过程中，必须根据变化的情况对培养基的PH进行适当的控制和调节。

　　调节PH的方法可以通过改变培养基的组分或其比例；

也可以使用缓冲液来稳定PH；

或者在必要时通过流加适宜的酸、碱溶液的方法，调节培养基的PH，以满足细胞生长和产酶的要求。

（2）温度的调节控制：

细胞的生长繁殖和发酵产酶需要一定的温度条件，不同的细胞有各自不同的最适生长温度。

　　有些细胞发酵产酶的最适温度与细胞生长的最适温度有所不同，而且往往低于最适生长温度。

要在不同的发酵阶段控制不同的温度。

即在细胞生长阶段控制在细胞生长的最适温度范围，而在产酶阶段，控制在产酶最适温度。

　　在细胞生长和发酵产酶过程中，由于细胞的新陈代谢作用，会不断放出热量，使培养基的温度升高，同时，由于热量的不断扩散，会使培养基的温度不断降低。

两者综合结果，决定了培养基的温度。

由于在细胞生长和产酶的不同阶段，细胞新陈代谢放出的热量有较大的差别，散失的热量又受到环境温度等因素的影响，使培养基的温度发生明显的变化。

为此必须经常及时地对温度进行调节控制，使培养基的温度维持在适宜的范围内。

　　温度的调节一般采用热水升温、冷水降温的方法。

为了及时地进行温度的调节控制，在发酵罐或者其他的生物反应器中，均应设计有足够传热面积的热交换装置，如排管、蛇管、夹套、喷淋管等，并且随时备有冷水和热水以满足温度调控的需要。

　　（3）溶解氧的调节控制：

细胞的生长繁殖和酶的生物合成过程需要大量的能量，为零获得足够多的能量，细胞必须获得充足的氧气，使从培养基中获得的能源物质经过有氧降解而生成大量的ATP。

　　在培养基中培养的细胞一般只能吸收和利用溶解氧，由于氧是难溶于是的气体，在通常情况下，培养基中的溶解的氧并不多，在细胞培养过程中，培养基中原有的溶解氧很快就会被细胞利用完，为了满足细胞的生长繁殖和发酵产酶的需要，在发酵过程中必须不断供给氧，使培养基中的溶解氧保持在一定的水平。

　　溶解氧的调节控制，就是要根据细胞对溶解氧的需要量，连续不断地进行补充，使培养基中的溶解氧的量保持恒定。

　　溶解氧的供给，一般是将无菌空气通入发酵容器，再在一定的条件下，使空气中的氧溶解到培养液中，以供细胞生命活动之需。

　　培养液中溶解氧的量，决定于在一定条件下氧气的溶解速率，溶氧速率与通气量、氧气分压、气液接触时间，气液接触面积以及培养液的性质等有密切关系。

一般来说，通气量越大、氧气分压越高、气液接触时间越长。

气液接触面积越大，则溶氧速率越大。

培养液的性质，主要是黏度、气泡、以及温度等对于溶氧速率有明显影响。

　　随着发酵过程的进行，细胞耗氧速率发生改变时，必须相应地对溶氧速率进行调节。

　　调节溶解氧的方法主要有调节通气量，调节氧的分压，调节气液接触时间，调节接触面积，改变培养液的性质等，可以根据不同菌种，不同产物、不同的生物反应器、不同的工艺条件下的不同情况选择使用。

以便根据发酵过程耗氧速率的变化而及时有效地调节溶氧速率。

4、固定化细胞发酵产酶有哪些特点？

固定化细胞发酵产酶与游离细胞发酵产酶相比，具有下列显著特点：

1）提高酶产率：

细胞经过固定化后，在一定的空间范围内生长繁殖，细胞密度增大，因而使细胞反应加速，从而提高酶产率。

例如，固定化枯草杆菌生产淀粉酶，在分批发酵时，其体积产酶率达到游离细胞的122%，在连续发酵时，产酶率更高。

再如，转基因大肠杆菌细胞生产酰胺酶，经过固定化后的细胞比没有选择压力时游离细胞的产酶率提高10~20倍。

　　2）可以反复使用或连续使用较长时间：

固定化细胞固定在载体上，不容易脱落流失，所以固定化细胞可以进行半连续发酵，反复使用多次；

也可以在高稀释的条件下连续发酵较长时间。

例如,固定化细胞进行酒精、乳酸等厌氧发酵，可以连续使用半年或者更长的时间；

固定化细胞发酵产生淀粉酶等，也可以连续地使用30d以上。

　　3）基因工程菌的质粒稳定，不易丢失：

基因工程菌经过固定化后，由于有载体的保护作用，质粒的结构稳定性和分裂稳定性都显著提高。

　　4）发酵稳定性好：

细胞经过固定化后，由于受到载体的保护作用，使细胞对温度、PH的适应范围增宽；

对蛋白酶和酶抑制剂等的耐受能力增强，所以能够比较稳定地进行发酵生产。

这一特点使固定化细胞发酵的操作控制变得相对容易，并有利于发酵生产的自动化。

　　5）缩短发酵周期，提高设备利用率：

固定化细胞，如果经过预培养，转入发酵培养基以后，很快就可以发酵产酶，而且能够较长时间维持产酶特性，所以可以缩短发酵周期，提高设备利用率。

若不经预培养，第一批发酵时，周期与游离细胞基本相同，但是第二批以后，其发酵周期将明显缩短。

例如，固定化黑曲霉细胞半连续发酵生产糖化酶，第一批发酵时，周期为120h，与游离细胞发酵周期相同，但是从第二批发酵开始，发酵周期缩短至60h。

若采用连续发酵，则可以在高稀释的条件下连续稳定地产酶，这就更加提高设备利用率。

　　6）产品容易分离纯化：

固定化细胞不溶于水，发酵完成后，容易与发酵液分离，而且发酵液中所含的游离细胞很少，这就有利于产品的分离纯化，从而提高产品的纯度和质量。

7）适用于胞外酶等胞外产物的生产：

由于固定化细胞与载体结合在一起，所以固定化细胞一般只是用于胞外酶等胞外产物的生产。

　5、固定化微生物原生质体发酵产酶有哪些特点？

（1）变胞内产物为胞外产物：

固定化原生质体由于解除了细胞壁的扩散障碍，可以使原本存在于细胞质中的胞内酶不断分泌到细胞外。

变革了胞内酶的生产工艺。

例如，笔者等人采用固定化黑曲霉原生质体生产葡萄糖氧化酶，使细胞内葡萄糖氧化酶的90%以上分泌到细胞外。

（2）提高酶产率：

由于出去了细胞壁，增加了细胞的通透性，有利于氧气和其他营养物质的传递与吸收，也有利于胞内物质的分泌，可以显著提高酶产率。

例如，笔者等人的研究表明，固定化枯草杆菌原生质体发酵生产碱性磷酸酶，使原来存在于细胞间质中的碱性磷酸酶全部分泌到发酵液中，产酶率提高30%。

　　（3）稳定性好：

固定化原生质体由于有载体的保护作用，具有较好的操作稳定性和保存稳定性，可以反复使用或者连续使用较长时间，利于连续生产。

　　（4）易于分离纯化：

固定化原生质体易于和发酵液分开，有利于产物的分离纯化，提高产品质量。

　6、试述酵发酵动力学的主要内容。

　答：

发酵动力学的主要内容包括细胞生长动力学，产物生成动力学和基质消耗动力学。

　　细胞生长动力学主要研究发酵过程中细胞生长速率以及各种因素对细胞生长速率的影响规律；

产物生成动力学主要研究发酵过程中产物生成速率以及各种因素对产物生成速率的影响规律；

基质消耗动力学主要研究发酵过程中基质消耗速率以及各种因素对基质消耗速率的影响规律。

　六、综合分析题

　1、在酵发酵生产过程中，为了提高酶的产率，可以采取哪些措施？

在酶的发酵生产过程中，要使酶的产率提高，必须采取一系列的措施，主要的有：

（1）使用优良的产酶细胞：

通过筛选、诱变、原生质体融合、基因重组、定向进化等手段，获得生长快、产率高、稳定性好的产酶细胞。

（2）使用优良的发酵生产设备：

通过精心设计或者选择使用高产、低耗的发酵罐等发酵生产设备。

　　（3）采用先进的分离纯化技术和设备：

采用操作简便、收得率高的分离化技术设备，以达到高产丰收的效果。

　　（4）控制好工艺条件：

在发酵过程中，要根据菌种特性，确定培养基和发酵工艺条件，进行工艺优化，并根据需要和变化的情况及时加以调节控制。

　　（5）此外还可以采取某些行之有效地措施，诸如添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂等。

　2、从如下实验方法和结果分析酶生物合成的调节作用。

　　实验方法：

将大肠杆菌细胞接种于营养汤肉培养中，于37℃振荡培养，当OD550达到0.3左右时，将培养液分装到4个小三角瓶中，每瓶17mL培养液。

于4个三个瓶中分别添加（A）3mL无菌水；

（B）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）和2mL无菌水；

（C）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mL无菌水；

（D）1mL乳糖溶液（0.1mol/L）、1mL葡萄糖溶液（0.1mol/L）和1mLcAMP钠盐溶液（0.1nmol/L）。

然后在相同的条件下于于37℃振荡培养2h，分别取样测定B-半乳糖腺酶的活力。

实验结果：

（A）瓶和（C）瓶样品的B-半乳糖腺酶活力为0，（B）瓶和（D）瓶

样品的B-半乳糖腺酶活力达到1000U/mL左右。

从实验方法和结果可以进行下列分析，并得出如下结论：

（1）（A）号瓶为对照，只加入无菌水，结果没有半乳糖苷酶产生，表明半乳糖苷酶不是组成酶，而是诱导酶。

（2）（B）号瓶加入半乳糖，结果在2h内半乳糖苷酶大量合成，表明乳糖是半乳糖苷酶的诱导剂。

　　（3）（C）号瓶与（B）号瓶相比，在含有乳糖的基础上增加了葡萄糖，结果也没有半乳糖苷酶产生，表明半乳糖苷酶的合成受到葡萄糖的阻遏作用，由于葡萄糖是一种容易利用的碳源，其对半乳糖苷酶的阻遏作用属于分解代谢物阻遏作用。

　　（4）（D）号瓶与（C）号瓶相比，增加了cAMP结果半乳糖苷酶又大量合成，表明cAMP可以使分解代谢物阻遏作用解除。

第三章动植物细胞培养产酶

1、动物细胞培养产酶

2、植物细胞培养产酶

3、端粒酶

4、抗体酶

5、半抗原

6、超氧化物歧化酶

7、纤维酶原激活剂

1、植物细胞培养主要用于生产色素、香精、　药物、酶 

、等次级代谢产物。

2、动物细胞培养主要用于生产疫苗、激素、单克隆抗体、多肽因子、酶等　功能性蛋白质 

　　3、抗体酶的主要获得方法有修饰法、半抗原诱导法 

、酶蛋白抗原诱导法。

4、植物细胞和微生物细胞的特性差异主要有细胞体积大，生长倍增时间长，营养要求较简单，大多数需要光照，对剪切力敏感 

等显著特点。

5、动物细胞培养方法主要有悬浮培养，贴壁培养、固定化细胞培养 

1、半抗原（B）

A、可以诱导抗体生成，但不能与抗体特异结合B、可以与抗体特异结合，但不能诱导抗体生成

C、可以诱导抗体产生，也可以与抗原特异结合D、不能与抗体特异结合，也不能与抗体特异结合

2、端粒酶是（C

A、催化端粒水解的酶B、存在于端粒中的酶C、催化端粒生成和延长的酶D、催化RNA生成和延长的酶

3、抗体酶是（B）

A、具有催化活性的抗体分子B、具有催化活性的RNA分子C、催化抗体水解的酶D、催化抗体生成的酶

4、纤溶酶原激活剂是（D）

A催化纤溶酶水解反应的酶B催化纤维蛋白水解反应酶C催化纤维蛋白原水解反应酶D催化纤溶酶原水解反应的酶

四、简答题与计算题

1、什么是端粒酶？

简述其催化过程。

端粒酶（Telomerase）是催化端粒合成和延长的酶。

端粒酶的催化过程主要包括下列3个步骤：

（1）结合：

端粒酶分子的RNA重复序列与DNA端粒末端按照互补原则结合。

（2）延伸：

以端粒酶分子的RNA为模板，通过反转录作用，使DNA分子上的端粒延伸。

（3）移位：

端粒酶移动到延伸后的端粒末端。

重复上述过程，反复进行，使端粒不断延。

2、何谓抗体酶？

试述获得抗体酶的主要方法。

抗体酶（abzyme）又称为催化性抗体（catalyticantibody）,是一类具有生物催化功能的抗体分子。

抗体酶的制备方法主要有诱导法，修饰法等。

修饰法是对抗体进行分子修饰，在抗体与抗原的结合部位引进催化基因，而成为抗体酶的方法。

诱导法是利用特定的抗原诱导抗体酶合成的方法，根据所采用的抗原不同，诱导法有半抗原诱导法和酶蛋白抗原诱导法。

半抗原诱导法是以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白（如牛血清蛋白等）偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备、分离、筛选得到所需的抗体酶。

酶蛋白抗原诱导抗体酶的生成是以某种外源酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。

首先选定一种酶蛋白作为抗原免疫动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体，再将获得的酶抗体免疫动物，并采用单克隆抗体技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。

那么，抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同，对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体酶。

3、植物细胞培养有何特点？

植物细胞培养具有如下显著特点：

（1）提高产率：

使用优良的植物细胞