酒中沙门氏菌的检测技术Word文档下载推荐.docx

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Salmonel~，以及若干出入境标准和农业标准等。

发酵酒及其配制酒标准GB2758—2O12嘲，以及各种果酒、露酒、黄酒、啤酒、米酒等国标、地方性标准均以GB4789．4—2010检测Salmonel~，其优点为直观准确、稳定性好，但整个实验流程需要3～5d，并需要大量人工操作，具有繁琐低效、仅可定性等缺点。

1．2其他标准方法

辛酯酶法（SN0332-1994）、滤膜法（SN1059．1—2002）、垂直膜过滤法（SN／T1059．6-_2008、噬菌体法（GB4789．31—20131等基于传统方法，仅在部分实验环节上进行了方法调整。

相对GB4789．4—2O10和SN0170-1992，上述方法主要区别在于，SN0332-1994只是在SN0170-1992的分离和生化实验之间增加了monella对4一甲基伞形酮辛酯f4一methylumbellifery1．cap—rylate，MUCAP）的显色反应；

SN1059．1—2002在增菌与分离之间，增加了采用0．45IJ．m滤膜进行菌体富集的步骤，其余与传统方法类似；

SN／T1059．6—2008在进行传统的增菌、分离后，采用特异性抗体识别Salmonella相应抗原后显色的方法进行鉴定，代替生化实验和血清鉴定；

GB4789_3l一2013在GB4789．4—2O10基础上，增加了增菌、分离后进行的噬菌体鉴定，之后仍可能需要生化实

验和血清分型等流程。

上述方法与GB4789．4—2010和SN0170---1992相比无明显差异，在缩短检测时间、减少人工操作、提高检测精度等方面上并无显著改善，现在检测机构中很少采用或已经被废止。

1.3生化试纸条及生化鉴定系统

在传统的样品前处理、前增菌、增菌、分离后，生化试纸条相对传统的Salmonella生化实验，具有微量化、系统化、标准化等特点，所检项目数量的提升和分析系统的有效运用也提升了检测准确度。

生化鉴定系统进一步将上述操作进行自动化，节约了人工操作。

黄宝莹等采用纯菌接种培养方式，比对GB4789．4—201O、API20宦试纸

条、Vitek生化鉴定仪、miniVidas荧光酶标仪等方法，检验结果无显著差异。

生化试纸条及生化鉴定系统在国内外获得广泛认可，常作为新型鉴定方法的比对依据。

2蛋白质检测

2．1免疫层析~（Immunochromatographictechnique，ICT）ICT通过固定于固相载体的特异抗体识别结合，_monella抗原后，反应显色以鉴定Salmonel~菌。

可根据精确性或广泛性的要求，选择单克隆抗体或多克隆抗体进行检测；

此外，不同标记物，如胶体金、染料微球、荧光微球、罗丹明、脂质体等的灵敏度也各有不同。

例如

Shuklat等将Typhimurium接种至预粉碎的西红柿样品中，增菌12h后检出限为1．2cells／g。

ICT成本低、操作简单，通常可设计成快速试纸条、快检试剂盒等，商品化较为普及。

2．2免疫磁珠~（Immunomagneticbeads，IMB）

IMB原理是运用核一壳的合成方法合成含有四氧化

三铁超顺磁性的高分子表面，并覆盖稳定性好、能进行后期标记的物质，利用这些物质表面的功能基团，如氨基、羧基、巯基等，通过共价或者非共价偶联形式固定抗体，从而特异性地结合待测抗原。

同时，磁珠在外加磁场引力下可做定向移动，从而达到分离、检测、纯化等目的。

量子点（quantumdots，QDs）是一种新型的半导体纳米材料。

作为一种新型的标记材料，与传统的荧光染料相比，具有稳定性好、激发光谱宽且连续、发射光谱窄而对称、荧光强度高等特点。

李倩倩⋯等将混合菌液接种至新鲜猪肉和牛奶的空白样品中，首先采用免疫磁珠对匀质处理后的样品中的Salmonella等目标菌株进行免疫分离，进而利用量子点标记抗体与Salmonella等目标菌株结合

并进行荧光显色，Salmonel~免培检出限为10cfu／mL。

相对传统选择培养方法，该法具有免培、分辨率高等优点，有实用价值。

2_3酶联免疫N~（Enzymelinkedimmunesorbentas—

say,ELISA）

ELISA检测Salmonella通常基于普通酶标仪和双抗体夹心法，其原理为：

①将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；

②孵育过程中，固相抗体扑捉菌体抗原，孵育后洗脱未结合物质；

③加入酶标二抗，与待测抗原结合；

④加入底物显色，从而对Salmonella进行定性或定量。

ELISA参考方法如GB22429-2008“，其在按照GB4789．4—20101进行前处理、前增菌和增菌后，用ELI—SA代替分离和生化实验，节省了部分操作及实验时间，适于日常检测。

但阳性结果仍需将选择增菌后的备查样品通过分离培养和生化鉴定进行确证。

很多报道对传统ELISA的方法和材料进行了改造研究。

Jain等03]基于双抗夹心法，首先将多克隆抗体固定于表面氨基化的聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）黑膜，捕捉typhi抗原后，利用辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase，HRP）标记的单克隆抗体来检测typhi含量，

添加底物显色及检测方法同普通ELISA。

免培水样检出限为2x10cells／mL，显著高于常规ELISA检出限10～10’cfu／mL。

该法基于常规ELISA作材料类改进，不需要特殊仪器、具有实用前景。

随着ELISA方法的改进，产生了电化学发光、酶联免疫荧光、时间分辨荧光等多种衍生方法。

其中，在monella检测中通常采用的酶联免疫荧光法，其在酶标显色环节，通过酶促底物激发荧光以进行检测，其余步骤与普通ELISA相同。

Rohonczy等以ISO6579：

2002传统培养方法为基准，通过miniVidas荧光酶标仪检测了超市抽检的141份禽肉样品，在灵敏度、特异性、精确度上均与传统方法100％吻合，有效缩短了传统方法所需检测时间。

2．4质谱（Massspectroscopy1

质谱技术通过制备、分离并检测气相离子来鉴定复杂化合物，但多用于化学领域的小分子物质研究。

其衍生技术，基质辅助激光解吸离子化质谱（Matrix—assistedlaserdesorptionionizationmassspectrometry,MALDI—TOF—MS），由于采用了“软电离”（MALDI1的方式，更适于生物大分子研究。

MALDI的原理是用激光照射样品

与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。

TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即所测离子的质荷比

（M／Z）与离子的飞行时间成正比，从而进行检测。

Spar—bier等以传统培养方法为对照，利用MALDIbiotyper检测4847份粪便样品[11。

在108份阳性样品中，将样品通过SE肉汤（Seleniteenrichmentbroth）增菌后，可检出100份阳性样品；

将样品通过sE肉汤增菌，再利用XLD琼脂分离后，可完全检出108份阳性样品；

且两种途径均无假

阳性。

该法可将f临床所需检测时间由传统方法的2d缩短至1d左右，并节省不少人工操作。

3基因检测

3．1前处理方法

PCR检测的前处理，通常需要进行样品匀质、增菌、菌群DNA提取等过程，虽然上述环节日益自动化，但采用培养方式增菌所需时间仍较长，通常为6-24h。

马凯等将猪肉样品增菌5h后，利用免疫磁珠分离（Immuno．magneticseparation）进行前处理，再利用m—qPCR检测Salmonella、Shigella、Staphylococcusaureus，检出限为2．0cfu／g、6．8cfu／g、9．6cfu／g，对比未采用分离技术的检测方法，其检出限得到提升。

但是，该法在磁分离之前需进行增菌，增加了人工操作和实验时间，可考虑进行免培条件下的免疫磁分离”，再进行PCR检测。

3．2PCR技术

PCR扩增所选择的目的基因，通常为Salmonella的种属特异基因。

根据其基因序列，设计上下游引物，结合Taq酶等相关试剂，利用PCR仪对待测DNA中的目的基因进行扩增。

如BenHassena[”等通过扩增Salmonella属特有的107bp的siiA基因进行鉴定，能区别出76株Sal—monella属和32株非Salmonella属的所有测试菌株。

普通PCR法操作简便，扩增时间通常为2h左右，所需仪器和试剂的成本低，因而在检测领域被广泛采用。

但普通PCR扩增产物通常需用凝胶电泳检测，增加了相关设备和试剂成本以及人工操作与实验时间。

3．3PCR技术

定量PCR（Quantitativereal—timePCRqPCR）在普通PCR扩增的基础上，采用探针或染料，使扩增循环激发荧光信号，并利用qPCR仪采集信号和分析结果，从而实现对目的基因的定性或定量检测。

从实验原理看，采用探针法可进一步增加PCR扩增的特异性；

而DNA染料无任何特异性的特点，能节约部分实验成本。

在实际检测中，从提高检测准确性角度出发，通常选用探针法；

如SN／T1059．7—20l0”，通过对食品进行匀质和前增菌后，直接提取DNA进行检测，检出限为240cfu／mL增菌液。

学术报道一般较标准的检出限更高，如闫琳等使用Taq—mail探针检测人工污染鸡肉样品中Salmonella的特异性基因inxA，增菌12h后检出限为1cfu／25g鸡肉样品，相比传统培养方法检出限提升10倍雎。

3．4m—qPCR技术

m—qPCR基于互不干扰的多对引物及不同信号的荧光探针，可同时对多个目的基因进行定性或定量检测。

Maurischat等对鸡颈皮肤样品进行匀质、增菌后，采用5重qPCR检测Enteritidis、Typhimurium、Typhimurium变种4，15]，12：

i：

一等菌株的多个特异性基因[211，准确检出61份人工污染样品和31份疑似天然样品；

与ISO6579：

2002传统培养方法相比较，准确度一致。

其检出限3～5cfu／25g鸡肉样品。

m—qPCR结合了mPCR缩短检测时间、qPCR快速定性定量的优点，日渐成为致病菌检测主要发展趋势之一，经过验证的商品化检测系统也已成熟。

3．5环介导等温扩增（1oop—mediatedisothermalamplifi—

cation，LAMP）

环介导等温扩增（1oop—mediatedisothermalamplifica—tion，LAMP）属于恒温扩增技术，当前被广泛用于致病菌的现场检测。

Soli等㈣应用羟基萘酚蓝、SYBRGreenI等染料作为扩增指示剂以提升LAMP灵敏度，与qPCR方法比对无显著差异。

LAMP成本低、操作简单，但难于定量、不可测序；

利用该技术设计的商品化试剂盒较为

普及。

3．6基因芯片（Microarray）

基因芯片通过固定于芯片的探针与待测基因杂交，产生光电信号以作检测。

Zou等利用GenePix4000B芯片仪和ArrayTrack数据库，建立了对食品样品中Sal—monella的快检方法。

Guo等根据SalmonellaO型抗原基因设计探针，可完全鉴定所有46种O血清型f其中6种需要PCR或培养辅助确认），2～8cfu／g番茄样品通过匀

质、增菌后可被检测。

基因芯片具有快速精确、原位检测等优点，但远比生化鉴定仪、qPCR等方法成本高，尚未在检测机构中广泛采用。

4生物传感器（biosensor）

生物传感器可通过对Salmonella蛋白或基因进行检测。

Song等设计切口酶生物传感器（Nickingenzyme—assistedbiosensor）对饮水和牛奶中Enteritidis检出限为10cfu／mL。

Ma等口采用适体电化学传感器对Salmonel一检出限为3cfu／mL。

Kim等拉采用微流体纳米生物传感器对鸡肉提取物中Typhimurium检出限为10cfu／mL。

生物传感器识别元件、信号转换方式多种多样，多数具有快速精确、原位检测、成本合理等优点，但仍处于实验室验证阶段，尚未确认其稳定性、耐用性以进行广泛普及。

5小结

随着发酵酒及其配制酒的产量和种类日益增长，以Salmonella为代表的食源致病菌污染风险逐步加大，生产企业、检测机构所面临压力的也在增加。

生化试纸条、蛋白试纸条、LAMP等方法方便快捷、成本较低，适于现场初检和企业自检。

传统培养、生化鉴定、PCR技术等作为当前的主要检测方法，被广泛应用于检测机构和生产企业。

qPCR技术、m—qPCR技术、基因芯片等技术兼有快速、灵敏的特点，且相关仪器和实验耗材的成本逐渐下降，今后可能逐渐成为对Salmonella的主要检测手段。

生物传感器稳定性有待检验，未来也将被逐步完善。

为保障消费权益、根据实际选择检测方法，具有重要的现实意义和科学价值。