过表达sigma1受体对ADAM17和ADAM10功能的抑制作用研究Word文件下载.docx

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ADAM17和ADAM10是一类膜锚定的金属蛋白酶家族的成员，加工和剪切生长因子、细胞因子配体和受体、细胞粘着因子及Notch一!

等多种膜锚定蛋白的胞外结构域，因而与诸如炎症、癌症、阿尔茨海默病等多种疾病的病理过程相关。

目前，有报道ADAM10和ADAM17的功能均与其在脂筏区和非脂筏区的分布相关，然而sigma一1受体是否影响ADAM17/10功能的行使还不清楚。

sigma一1受

体参与了内质网脂质转运，上调sigma一1受体会改变脂筏中脂质部分而影响脂筏。

因其介导质膜中脂筏重组，从而可能影响存在于质膜脂筏中蛋白的功能。

本实验

通过碱性磷酸酶标签底物的报告系统发现，在不同细胞系上过表达sigma一1受体，分别抑制了ADAM17、ADAM10依赖的底物HB一EGF及BTC的剪切释放作用，而两者蛋白表达水平无明显变化。

细胞免疫荧光实验发现，过表达sigma一1受体后脂筏标志蛋白在细胞上的分布发生变化。

关键词:

Sigma一1受体ALSADAM17ADAM10EGFR配体剪切脂筏

中图分类号:

Q25

复旦大学硕上学位论文过表达sigma一1受体对AoAM17和AoAM10功能的抑制作用研究

Abstraet

Thesigma一1reeePtor15animPortantmoleeularehaPeronewhiehinvolvesinER1iPidmetabolisms/transPort，ionehannelandcellssurvive.SuehProfitshaveIinked

5igma一1reeePtorstomanynervoussystemdiseases（suehasALS，dePression，

Alzheimer’5disease），stroke，andeaneer.ALS15aneurodegenerativedisorder

charaeterizedby1055ofmotorneuronsineentraInervoussystem.In3ALS一FTD/FTD

faxnilies，sequencingrevealedamutationintheSIGMARIgeneaffeetingahighly

eonservedaminoaeidloeatedinthetransmembranedomainoftheencodedProtein，5igma一1reeePtor.However，howtllismutationaffectstllemotorneuron15still

unknown.

ADAM10andADAM17aremembrane一anchoredProteasesinvolvedthe

sheddingProeessofmanysubstrates，suehasligandsoftheePidermalgrowthfactorreeePtor（EGFR），Notehl，LIeelladhesionmoleeule，APP，etc.AndtheyhavebeenrePortedtobeinvolvedinmanydiseasesPathology.BothProteasesfonetionseanbeaffeetedbyliPidrafts.Currently，it15not50elearwhethersigma一1recePtorwould

affeetADAM10/ADAM17funetion.AsatransmembraneProteinitself，uPregulationofsigma一1reeePtorsaffeettheIevelsofPlasmamembraneIIPidraftsbyehangingthe1iPideomPonentstherein.Themembranereeonstitutionthusinducedbysigma一l

reeePtorsinturnaffeetsfunetionsofProteinsresidinginPlasmamembraneliPidrafts.Therefore，it15verylikelysigma一1reeePtoreanaffeetADAM10/ADAM17funetions.GiventhecireumstancesthatthosemetalloProteasesfunetioneanbeaffeetedbyliPid

raftwhiehcanbemodifiedbysigma一1reeePtor，it15verylikelythatsigma一1recePtorcanalsoaffecttheirfonetion.ByusinganalkalinePhosPhatasetaggedsubstraterePortersystem，wehaveshowedtllatoverexPressionsiglna一1recePtorindifferentcelllineseandi一nillishADAM17andADAM10dePendentshedding.Meanwhile，theexPressionofADAM17andADAMIOarenotehanged.Further-thedistributionof

Flottin一1azldCaveolin一]areaffectedbyoverexPressingsigma一1recePtor.

Keywords:

siglna一1reeePtor，ALS.ADAM17，ADAM]O，shedding，liPidraft

复旦大学硕士学位论文过表达sigma一i受体对AoAM17和AoAMio功能的抑制作用研究

.引言

1.1ALS与sigma一l受体相关性

肌肉萎缩性侧索硬化症（ALs，Amyotrophiclatera一selerosis），又称肌萎缩性脊髓侧索硬化症，俗称为“渐冻人症”，是一种渐进和致命的神经退行性疾病。

起因是中枢神经系统内控制随意肌的运动神经元（motorneuron）退化所致。

ALS病人由于上、下运动神经元（upper/lowermotorneurons）都退化和死亡并停止传送讯息到肌肉，在不能运作的情况下，肌肉逐渐衰弱、萎缩。

最后，大脑完全丧失控制随意运动的能力，最终因呼吸困难而死亡【’】。

ALS大约有10%为家族遗传性病人，其中约20%存在SODI（superoxideDismutasel）突变，该基因编码Cu/Zn过氧化物歧化酶，然而大部份病人的致病原因不明。

因此，其他致病基因的探索一直是研究的热点之一。

2010年，Luty等的研究发现，在3个ALs一FTD/FTD家族中SIGMARI的3’-端非转录区（UTR）的变体存在常染色体显性遗传模型特征。

他们认为这些变体可能影响sIGMARI转录本的稳定性[2]。

2011年对少年ALs家族基因测定研究发现在编码sigma一l受体蛋白的SIGMARI基因上有一个错位突变，该突变影响定位在跨膜域的高度保守氨基酸，也是配体结合的重要位点。

突变的sigma一1受体蛋白在NSC34细胞上表现出异常的亚细胞分布，此外表达突变蛋白的细胞对于内质网压力诱导的凋亡抵抗性下降[3]。

因而，研究者认为sigma一1受体的突变也可能是少年ALS的一个致病原因。

但其中sigma一1受体的功能与致病成因尚

不清楚。

1.2sigma一1受体的结构与功能

sigma受体（sigmarecePtor）曾被认为是阿片样受体的一类，因为镇痛药类阿片样药物的d立体异构物与林，K和6受体没有作用，但可缓解咳嗽症状。

但

是，药理学检测显示，sigma受体可以被完全与阿片样物质无关的药物所激活，它们具有的功能与阿片样受体功能毫不相关。

如苯环己呱睫（phencyclidine，一种麻醉药和致幻剂）以及氟呱丁苯（强安定药）可与这些受体相互作用，但是它们都与阿片样物质没有任何可评估的化学相似性。

sizma受体作为一种非阿片样分子伴侣蛋白，至少存在两种亚型，即Sigma一IR（alR）和Sigma一ZR（。

ZR）。

1982年，alR首先被Su等人作为一种可以结合SKFIOO47（N一烯丙去甲间哇新）的阿片样物质受体的亚型，并于19%年被克隆出来l’]。

当a1R被分离和克隆出来之后，却发现它与阿片样受体也不存在任何结构相似性。

因此，它们被认定为一类独立的受体。

a1R在其他哺乳动物

复旦大学硕士学位论叉过表达Sigma一1受体对AoAM17和ADAM10功能的抑制作用研究

也有许多研究发现，a1R可以调节质膜蛋白上的功能（如K十通道）【8一9]。

1.3sigma一1受体与脂质和脂筏

脑中含有丰富的脂质，包含人体约23%未酷化的胆固醇，高于其它器官。

脑中还含有高浓度的鞘糖脂，如神经节普脂和半乳糖酞基鞘氨醇，两者是髓鞘的基本组成成分。

髓鞘（Myelin）是一种扁平、板状的细胞隔离膜，在周围神经系统（PNS）中由施旺细胞产生，在中枢神经系统（CNs）中由少突胶质细胞生成。

髓鞘包绕在神经元的轴突外部，提供轴突与周围组织之间的电气绝缘，从而调节神经传导和神经递质的释放11仆川。

髓鞘干重中含有70%脂质和30%蛋白，且胆固醇占脑中总含量的70%。

因此，胆固醇和鞘糖脂等脂质在大脑的形态结构和神经传导方面起着重要作用。

人类ALS患者尸体组织的一项研究显示，前外侧柱脊髓中髓鞘分散苍白，伴随小神经胶质细胞渗透和缺少小的6ber，但这些可能是由固有的轴鞘脊髓损伤造成的l’“]。

之后，更多ALS患者髓鞘状态的研究发现，症状发生前的髓鞘存在明显异常，如缺少大量的紧密髓鞘、薄层分离以及脂质含量降低。

在SODI突变大鼠病症阶段，可观察到更多显著的形态学和生物化学上的髓鞘变性「’3]。

GIR也是大脑中丰富表达的蛋白，含有一个固醇结合“口袋”。

引R是内质网的伴侣蛋白，而大部分脂质及其前体主要在内质网中合成。

NG108细胞（小

鼠神经细胞瘤与大鼠神经胶质瘤之融合细胞）内源表达的成R定位在内质网网状和核膜上，进一步研究发现，转染C一端带有EYFP（增强型黄色荧光蛋白）标签的引R，观察到川R明显定位于内质网小泡状结构。

使用filipin和Nifered染色发现，这些小泡内含有适量的游离胆固醇和中性脂质【’4}。

此外，共聚焦显微镜也观察到alR和胆固醇共定位在原代少突胶质细胞的内质网小泡中l’5]。

alR存在于内质网上富含脂质的亚区域小泡内，并与胆固醇和中性脂质共定位。

但在特定条件下（如引R配体结合），引R可以从内质网液体小泡沿内质网网络滑行，并转移至核膜、质膜区域或神经突处。

脂滴是由合并中性脂进入盘状双层内质网膜中形成，当液滴大小达到临界值时，内质网上的脂质则出芽形成胞浆脂滴。

近来，越来越多研究关注脂滴作为内质网和高尔基体或质膜之间一种新的脂转运方式I’“]。

因此，研究者认为alR定位在内质网脂质运输位点（如脂滴），可能参与内质网脂质转运。

当在NG108细胞转入无功能的alR时，它们则不能定位在内质网脂滴和转移，而大量中性脂和胆固醇滞留在内质网中，引起病理性聚集。

进而，无功能的突变引起了高尔基体和质膜上胆固醇含量的降低。

这些实验结果都暗示，内质网上的a1R在脂质分选进入内质网的贮存位点，并转运至周围细胞的生理过程中起着重要作用。

而

复旦大学硕士学位论文过表达sigm。

一1受体对AoAM17和AoAM10功能的抑制作用研究

alR的转移和脂质转运调节之间的功能关系还不清楚。

胆固醇在内质网中合成，转运至质膜上，并和鞘糖脂形成去污剂不溶性的微区域。

细胞质膜是细胞的重要组成部分，它主要是由糖鞘脂类和分布在糖脂蛋白中的蛋白受体微区域（即脂筏）所组成。

这些特化的膜微结构域作为中心组织者，参与了信号分子的组装、影响膜流动性、膜蛋白之间作用、受体之间作用并可调节神经传导，从而在空间上区分了细胞内各个进程【’“一’7]。

脂筏有序且紧密的与周围的磷脂双分子层组装在一起，但可以在膜双分子上自由漂浮移动。

质膜和脂筏之间的关键区别在于脂类的组成。

研究表明，脂筏中通常含有周围脂质双分子层3一5倍的胆固醇含量。

同时，脂筏中富含鞘脂类，如鞘磷脂，它在脂筏中的含量相比质膜中提高了50%;

而