细胞工程实验讲义Word文件下载.docx
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实验一骨髓间充质干细胞的分离培养………………………4
实验二软骨细胞的分离培养…………………………………7
实验三大鼠神经胶质细胞的分离培养………………………11
实验四鼠尾胶原的制备………………………………………16
实验五胶质纤维酸性蛋白（GFAP）表达水平检测…………18
实验一细胞培养的基本技术
【实验目的】
1、了解细胞培养室的设置，设备和无菌操作。
2、掌握细胞培养用器械的清洗与消毒方法。
3、掌握含血清细胞培养液的配制方法。
4、掌握胰蛋白酶溶液的配制方法。
【实验材料】
1、实验设备：
高压灭菌锅、电子分析天平、酸度计、超净工作台、滤器、滤泵。
2、实验器材：
不同规格毛刷、烧杯、量筒、搅拌棒、血清瓶（分装培养液用）、0.22μm滤膜。
【实验步骤】
一、器械的清洗
1、玻璃器皿的清洗：
①清水浸泡：
浸泡主要是软化器皿表面所附着的物质。
②刷洗：
将浸泡后的玻璃器皿在洗涤剂中用毛刷反复刷洗，以除去器皿表面的杂质。
烘干后
③浸酸：
将经过刷洗和烘干后的玻璃器皿浸泡在由重铬酸钾、浓硫酸配置而成的清洁液中，利用强氧化作用清除瓶皿表面可能残留的有机物。
浸泡时间要在6小时以上，最好过夜。
④冲洗：
浸酸后的器皿从洗液中取出后，用自来水冲洗10遍以上。
再用蒸馏水、三蒸水各清洗3遍以上，取出置于烤箱内（40-50℃）烘干。
2、金属器械的清洗和消毒：
金属器械不能在清洁液中浸泡，一般用洗涤剂洗刷干净后，再用自来水和蒸馏水反复冲洗干净，烘干。
3、胶塞的清洗和消毒：
细胞培养中使用的胶塞不能用清洁液浸泡。
清洗过程中，要先在水中浸泡，然后2%NaOH溶液煮沸10分钟。
自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟，最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。
注意使用后的胶塞应及时浸泡在清水中。
4、塑料物品的清洗：
塑料物品用后立即用流水冲净或浸入清水中，防止干涸。
一般不用刷洗以防划痕和损伤。
清洗干净的器皿先在2%NaOH溶液浸泡过夜，自来水冲洗晾干后，再用1%的稀盐酸浸泡30分钟。
最后再用自来水、蒸馏水、三蒸水进行常规清洗，烘干备用。
注：
清洁液的配制
成分
强酸溶液
次强酸溶液
弱酸溶液
重铬酸钾（g）
浓硫酸（ml）
蒸馏水（ml）
63
1000
200
120
100
二、器械的消毒灭菌
造成细胞培养失败的主要原因是发生污染，特别是微生物的污染，因此对细胞培养中所用的器械进行消毒灭菌是非常重要的。
最常用的物理消毒方法有如下几种：
1、紫外线消毒：
紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。
目前，多用紫外灯直接照射培养室内空气、地面、工作台表面等进行消毒。
2、高温干热灭菌：
一般在烤箱中进行，主要用于消毒玻璃器皿。
干热灭菌后的器皿干燥，易于存放。
但是，干热传导慢，可有冷空气存留于烤箱内，需要较高的温度和较长的时间才能达到消毒的目的，因此需加温到160℃，保持90-120℃分钟。
消毒后不可马上将烘箱门打开，以免冷空气进入，影响消毒效果和损坏玻璃器皿或发生意外。
3、压力蒸汽灭菌：
一般使用高压蒸汽灭菌锅进行。
为保证消毒的效果，待消毒的物品不应装得太满，以便消毒器内空气流通。
在加热升压之前，打开排气阀门，以使加热后消毒器内的冷空气排出。
冷空气排完后，关闭排气阀门，开始升压，待达到所需压力后，开始计时，一般为40分钟左右。
消毒完毕后，不要立刻打开盖子，应先等压力自行下降到一定程度后，打开排气阀，放气后，再打开消毒器的盖，将物品取出，放入烤箱内烘干。
4、过滤除菌：
是将液体或气体用具有微孔的薄膜过滤，使大于孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的目的。
目前，多数实验室采用微孔滤膜滤器除菌。
三、细胞培养液DMEM的配制
细胞培养使用的培养液一般由合成培养基和新生牛血清配制而成。
合成培养基有商品出售，根据不同的细胞种类，可以选择不同的合成培养基。
本实验仅以DMEM为例，介绍其配制方法。
1、按包装袋上的说明，将一袋DMEM粉剂用新鲜三次蒸馏水溶解。
2、按包装袋上的说明，将一定量的NaHCO3加入DMEM溶液中。
3、加入抗生素，使青霉素钠的终浓度达到100μg/ml，硫酸链霉素的终浓度达到100U/ml。
4、调培养液pH至7.0～7.2。
5、超净台内过滤除菌。
6、加入经灭活处理的新生牛血清，其中浓度为10%-20%。
7、分装，-20℃贮存备用。
四、胰蛋白酶溶液的配制
1、D-Hanks溶液的配制：
准确称取NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H2O0.716g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，溶解于三次蒸馏水中，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。
高压灭菌后，于超净台内加入滤过除菌的青霉素、硫酸链霉素，使其终浓度分别为100U/ml，100μg/ml。
4℃冰箱保存待用。
2、胰蛋白酶消化液的配制：
用D-Hanks溶液将胰蛋白酶配成浓度为0.25%的工作液，过滤除菌后，-20℃贮存备用。
实验二动物细胞的传代培养
1、掌握传代细胞培养的原理及操作方法。
2、了解细胞冻存的方法。
【实验原理】
传代培养是组织培养的常规保种方法之一。
也是几乎所有细胞生物学实验的基础。
当细胞在培养瓶中培养时，细胞不断生长增殖。
对于贴壁生长的细胞，单层细胞互相汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。
对于悬浮生长的细胞，细胞相互汇集成团。
这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足，营养障碍而死亡。
细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶中的过程称为传代。
传代可获得大量细胞供实验所需。
体外培养的细胞，随着传代次数的增加，其各种生物特性会渐渐发生变化。
为此，需将培养的细胞及时冻存。
直接冻存细胞会导致细胞内外环境形成冰晶，从而使细胞内部发生一系列变化，进而引起细胞死亡。
因此，冻存细胞时常向培养液中加入适量的甘油和DMSO（二甲基亚砜），从而使冰点下降，通过缓慢冻存，避免或减少冰晶的形成。
超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、台式离心机、恒温摇床等。
吸量管、培养皿、离心管、冻存管、细胞记数板、细胞计数器、微量移液器等。
3、实验试剂：
D-Hanks溶液、含10%新生牛血清的DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶溶液、细胞冻存液。
一、细胞传代
1、贴壁生长的细胞
⑴取80%汇合或刚汇合形成单层的细胞，吸弃旧培养液，用平衡盐溶液洗去残留的培养液。
⑵加入少量的胰蛋白酶液，37℃放置3-5分钟，显微镜下观察，细胞变圆后，进行吹打，使细胞脱离培养瓶壁。
⑶终止消化，吸弃消化液，加入含有血清的培养液。
⑷用吸管吸取培养皿内的培养液溶液，反复吹打培养皿底壁，使细胞分散。
⑸吹打获得的细胞悬液经1,000rpm离心5分钟，弃上清，将细胞沉淀用培养液重新悬浮后记数。
⑹按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养皿中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。
2、悬浮生长的细胞
⑴将细胞悬液转入离心管内，1,000rpm,离心5分钟。
⑵弃上清，加入新鲜的培养液到离心管中，反复吹打，使细胞分散。
⑶细胞记数。
⑷按照一定的细胞密度将部分细胞接种于新培养瓶中，补给一定量的新鲜培养液，继续培养。
二、细胞冻存：
1、配置冻存液：
即含10%DMSO及20%小牛血清的某种细胞培养液。
2、依照传代的方法把消化好的细胞收集于离心管中，计数后离心。
3、去除离心后的上清，加入冻存液，使细胞密度达到5×
106-1×
107/ml。
4、吹打细胞制成悬液，分装入冻存管中。
5、细胞分级冷冻要点——缓慢逐步降温：
●4℃冰箱1小时；
●-20℃冰箱1小时；
●-80℃冰箱24-48h；
●液氮罐中长期保存。
实验三细胞融合
[实验目的]：
1、掌握杂交瘤技术的原理和细胞融合的基本方法。
2、了解筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定。
[实验原理]:
杂交瘤技术主要是由免疫动物，细胞融合，筛选杂交瘤细胞，克隆化培养，单克隆抗体的制备与鉴定等一系列实验组成的实验系统，其核心是细胞融合。
用特异性抗原致敏小鼠，将小鼠产生抗体的脾细胞与小鼠的骨髓瘤细胞融合在一起产生杂交细胞，这种细胞既获得了亲代脾细胞分泌特异性抗体而又是永生化的杂交瘤细胞。
将这种杂交细胞经克隆后接种于小鼠腹腔，由杂交瘤细胞分泌抗特异性抗原的单克隆抗体，以上过程就是杂交瘤单克隆抗体技术。
1．实验动物：
7-12周龄BALB/C小鼠。
2．实验细胞：
骨髓瘤细胞MOPC-21。
2．手术器械：
大钩镊、眼科剪。
3．实验器皿：
玻璃平皿、吸量管、50ml离心管、孔径45μm尼龙纱网、96孔培养板。
4．实验试剂：
碘棉、75%乙醇、HAT选择培养基、PEG1000溶液、D-Hanks溶液、无血清RPMI－1640培养基。
D-Hanks溶液的配制：
准确称取NaCl0.8g、KCl0.4g、Na2HPO4•12H2O0.716g、KH2PO40.06g、NaHCO30.35g，溶解于三次蒸馏水中，调pH至7.0～7.2，定容为1000ml。
RPMI－1640培养液的配制：
按包装袋上的说明，用新鲜三次蒸馏水配制。
内含10%新生牛血清，2mmol/L左旋谷氨酰胺、100μg/ml青霉素钠、100U/ml硫酸链霉素，调pH=7.0～7.2，过滤除菌，分装，-20℃贮存备用。
HAT培养液：
在含10%小牛血清的RPMI－1640中，加次黄嘌呤136
μg/ml，氨基喋呤0.19μg/ml，胸腺嘧啶3.88μg/ml，冷冻避光保存（氨基喋呤对光敏感）。
PEG1000溶液（50%）：
取25mlPEG1000溶液加入25ml无小牛血清的RPMI－1640溶液，常温保存。
5．实验设备：
超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、台式离心机、电子分析天平、酸度计等。
[实验步骤]：
1、制备饲养层细胞（小鼠腹腔渗出细胞）
BALB/C小鼠脱颈处死后，75％酒精浸泡5min，无菌暴露腹腔，腹腔内注射10mlHAT选择培养基，吸出腹腔渗出细胞调整浓度到0.5×
105/ml，接种96孔板，每孔100μl。
2、脾细胞制备
BALB/C小鼠脱颈处死后，75％酒精浸泡5min无菌暴露腹腔取脾，放入洗液（无血清RPMI－1640培养基）进行研磨，尼龙纱网过滤，吸取脾细胞悬液进行离心（1500rpm，5min），弃上清，加少量培养液重悬细胞并计数，一般一个脾脏平均可得1×
108个脾细胞
3、细胞融合
（1）融合前一天将PEG放入CO2培养箱中调整pH至7.2-7.4。
（2）将PEG和培养液置37℃水箱中温热。
（3）将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞以1：
5的比例（2×
107个骨髓瘤细胞和
1×
108个脾细胞混合），用小玻璃棒轻轻地混合无血清培养液中的细胞，避免用吸管强烈地吹吸以免损伤细胞，离心1500rpm，5min
（4）弃掉所用的上清（PEG的浓度是严格的，若遗留上清液将影响PEG浓度），不要旋动或敲打试管，保持细胞团完整。
（5）将试管放在恒温干浴中，保持37℃温热，用1ml吸管慢慢地将37℃预温的50%PEG1000溶液0.8ml加至密集的细胞团中，用吸管尖端慢慢搅动，使PEG与细胞混合，但不要吹吸。
（6）试管仍放在干浴中，用吸管尖端继续缓缓搅动1分钟。
（7）在1分钟内加完1ml预温的培养液，试管仍放在干浴中以保持温度，重复一次此操作。
（8）于2分钟内加入10ml37℃预温的培养液。
（9）1500r/min离心10分钟。
（10）缓慢加入PEG（分子量1000）1min内加0.8ml，——静置90S——加1ml洗液（1min内加完）——加洗液至20ml——离心（1000rpm，5min）——弃上清
（3）加入选择培养基HAT10ml
（4）接种于含饲养细胞的96孔板，每孔100μl，CO2培养箱培养。
[思考题]
制备杂交瘤细胞的关键是什么？
实验四、肿瘤细胞的诱导分化实验
[实验目的]
掌握肿瘤诱导分化模型的选择与建立，掌握肿瘤细胞分化过程中各分化指标的鉴定。
[实验原理]
肿瘤细胞在分化诱导剂作用下，由不成熟状态向成熟状态分化，同时伴随细胞一系列的生理生化改变，包括形态学、生物化学、膜表面标志物、功能及细胞增殖情况等。
通过检测这一些指标的变化，建立肿瘤细胞分化模型，为研究肿瘤细胞分化的生物学特性提供研究依据。
本次实验以PMA（乙酸肉豆蔻佛波脂）诱导U937分化为模型，通过观察细胞的形态学变化，细胞吞噬功能，膜表面标志物CD11c的变化，NBT还原实验，细胞克隆形成试验等来检测这一系列肿瘤分化的过程。
[实验内容]
包括细胞分化诱导、细胞形态学观察、克隆形成试验（软琼脂克隆形成试验）、硝基蓝氮唑（NBT）还原实验、细胞吞噬功能测定、免疫荧光测定CD11c表达
一、细胞分化诱导
实验原理
U937细胞为前单核细胞肿瘤细胞株，可在PMA诱导下向成熟的单核巨噬细胞分化，是研究细胞分化的良好体外模型。
实验器材与试剂
1、培养瓶、吸管、离心管、微量吸液管、微量移液器
2、胎牛血清、IMDM培养基、PMA
3、离心机、CO2培养箱
实验步骤
1、培养的U937细胞吸入一离心管内，离心去上清。
2、将离心管内加入2mlPBS，取0.1ml进行记数。
3、按1x107每瓶细胞数接种到100ml的培养瓶内，液体为4ml。
4、按10ng/ml加入PMA。
5、将细胞放入5%CO2，37度培养箱培养，24小时后，进行下面实验
二、细胞形态学观察
在倒置显微镜下观察细胞形态学改变：
生长状态，颗粒多少，细胞膜改变等。
三、克隆形成试验（软琼脂克隆形成试验）
克隆形成试验是测定单个细胞增值能力的有效方法之一，其原理是单个细胞在体外连续增值六代以上，其组成的细胞群体称为克隆或集落。
肿瘤细胞在分化过程中将丧失在软琼脂培养基上形成集落的能力。
1、烧杯、吸管、24孔培养板
2、含10％FCS（胎牛血清）IMDM培养基、0.25％胰酶、5％琼脂溶液
3、CO2孵箱、倒置生物显微镜
1、制备细胞悬液：
将PMA作用的U937细胞用胰酶消化，分散成单个细胞，与未诱导细胞进行一同记数，调整细胞浓度至1x103/ml，然后根据实验要求再作梯度倍数稀释。
2、制备低层琼脂：
取5%琼脂置沸水浴中使琼脂完全溶化，取出1份5%的琼脂，移入小烧杯中，待冷至50度，迅速加入9分预温的37度的新鲜培养基，混合均匀，立即浇入24孔板内，每孔0.8mL，置于室温使琼脂凝固备用。
3、制备上层琼脂：
取37度保温的不同密度的细胞悬液9.4ml，移入小烧杯中，加入50度的5％琼脂0.6mL，迅速混匀，即配成0.3%琼脂培养基，立即浇入铺有底层琼脂的24孔板，每孔加0.8ml，置于室温凝固。
一般情况下，可调整细胞数为每孔含23、50、和100个细胞
4、培养：
把培养板移入CO2孵箱，在37度，5%CO2的情况下，培养2-3周。
5、计数：
把培养板放置在倒置显微镜上，镜下计数直径大于75um或含50个细胞以上的克隆，根据公式：
克隆形成率：
=（克隆数/接种细胞数）x100
注意事项：
1、胞悬液中的细胞要充分分散，单个细胞的百分率至少在90%以上。
2、隆时间较长，要注意无菌操作。
3、养液与琼脂液务必混匀，以免局部结块。
四、硝基蓝氮唑（NBT）还原实验
U937细胞在分化诱导剂作用下向成熟分化，分化过程中的过氧化物酶能使外源性的NBT还原成难溶的紫色结晶物，并沉着于细胞内有酶活性的部位，显微镜下可见阳性细胞有着色斑，未分化细胞则成NBT反应阴性。
1、玻片、光学显微镜、离心管、记数板
2、丙酮固定液、0.1%NBT溶液（用生理盐水配置）、瑞氏-姬母萨染液
1、PMA作用的U937细胞及未作用细胞，加入到离心管内，置细胞悬液，离心，弃上清。
2、每管加入0.5mL的0.1%NBT溶液，摇匀。
3、37度反应30min-60min。
4、吸取少量细胞悬液，涂片，空气干燥，常规瑞氏-姬母萨染色。
5、光镜下观察，细胞内有蓝紫色斑为阳性细胞，计数200个细胞并计算百分率。
五、吞噬功能测定
在U937细胞向单核巨噬细胞分化过程中，其吞噬功能增强。
中性红是一种弱阳离子染料,能与活细胞胞浆中的阴离子结合而浓缩于活细胞中,并不被细胞洗涤液洗脱。
中性红染料摄入法是依据细胞活性状态不同，摄入中性红染料的量也不同，反映的是不依赖受体的非特异性吞噬活性.本方法简便、便宜、安全。
1、96孔板、吸液管
2、0.5mg/ml中性红溶液（用生理盐水配置）、0.2mol/LPBS、0.05mol/LNaH2PO450%乙醇溶液
3、酶联仪、振荡器
1、以2x104/孔细胞数将PMA作用U937及未作用细胞接种于96孔板，设6平行孔，，每孔液体为100ul，培养24小时。
2、加入0.5mg/ml中性红溶液60ul，孵育1.5小时，弃上清，用PBS洗三次。
悬浮细胞离心法收集后，重新置入96孔内，贴壁细胞可直接去掉液体。
3、每个培养孔中均加入200μｌ0.05ｍｏｌ/ＬＮａＨ2ＰＯ50%乙醇溶液,并置微型振荡器上振荡5分钟，使细胞中的中性红全部溶出。
4、置酶联仪上测吸光值（Ａ）,选择检测波长为550ｎｍ,参考波长为630ｎｍ,以六个平行孔的Ａ550-Ａ630为实测Ａ值。
六、免疫荧光测定CD11c表达
在U937细胞向单核巨噬细胞分化过程中，其膜表面的CD11c分子的表达增高。
免疫荧光细胞化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素制成荧光标记物，再用这种荧光抗体（或抗原）作为分子探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。
在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受激发光的照射而发出明亮的荧光（黄绿色或桔红色），可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。
1、载玻片、镊子
2、PBS，带有FITC荧光的CD11c抗体
3、荧光显微镜
1、细胞固定：
将PMA作用U937及未作用细胞用丙酮固定到载玻片上。
用PBS
洗3次，风干。
2、染色：
滴加经稀释至染色效价如1：
8或1：
16的带有FITC荧光的CD11c抗体在室温或37℃染色30min，玻片置入能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。
3、洗片：
倾去存留的荧光抗体，将切片浸入PBS中洗两次，搅拌，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。
4、用50%缓冲（0.5mol/L碳酸盐缓冲液pH9.0～9.5）甘油封固、镜检
4、注意设置阳性及阴性对照
实验五化疗药物对肿瘤细胞杀伤的
敏感实验
掌握肿瘤细胞药敏实验设计与操作及结果分析。
肿瘤细胞针对不同的化疗药物的杀伤，有不同的敏感性。
筛选出针对肿瘤高敏感而毒性小的化疗药物，对于指导肿瘤治疗的临床用药有重要意义。
其实验原理为：
将一定细胞数的肿瘤细胞接种96孔培养板，加入不同种类、不同浓度的化疗药物，作用24-48小时后，利用MTT法检测细胞存活情况，来判定肿瘤细胞对各种化疗药物的敏感性，从而筛选出针对这种肿瘤有效的化疗药物。
[实验材料]
1、吸管、离心管、微量吸液管、微量移液器、96孔培养板
2、MTT、含10%FCS的培养基、PBS、DMSO（二甲基亚砜）、胰酶
3、化疗药物：
顺铂（DDP）、足叶乙甙（VP–16）、
5-氟尿嘧啶（5–Fu）、长春新碱（VCR）
4、细胞株HeLa（人宫颈癌细胞株）、HeP-2（人喉癌细胞株）、
HCT/8（人结肠癌细胞株）、U251（人胶质瘤细胞株）
5、离心机、CO2培养箱、酶标仪
[实验步骤]
一、化疗药物浓度配置
使用的化疗药物浓度按照血浆峰值浓度（μg/ml）=50×
（临床每日用量（mg/Kg）/5000）×
2×
103）计算，以10倍、1倍、0.1倍、0.01倍实验,四种药物具体用量见下表
不同剂量组药物实验终浓度（μg/ml）
分组
血浆峰值
浓度倍数
DDP
5-Fu
VP-16
VCR
1
10
2000
600
8
2
12
60
0.8
3
0.1
1.2
20
6
0.08
4
0.01
0.12
0.6
0.008
二、步骤
（一）、细胞培养及加药
1、将HeLa、HeP-2、HCT/8、U251消化，计数、以每孔1X105细胞数接种到96孔板，每孔培养基液体为200ul，每两种细胞种一96孔板。
2、将4种化疗药物以四种浓度，10ul加入各个孔中，做5平行孔，剩余孔做对照组。
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