第一章 透射电镜的用途Word格式文档下载.docx
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3要求极严格。
要在机体死亡后的数分钟内取材，组织块要小（1mm以内），常用戊二醛和锇酸双重固定，包埋介质包埋,用超薄切片机（ultramicrotome）切成薄片，再经醋酸铀和柠檬酸铅等进行电子染色。
成像方式与光学生物显微镜相似，只是以电子透镜代替玻璃透镜。
第一节TEM的工作原理和主要结构
一、透射电镜的工作原理
由钨丝阴极在加热状态下发射电子。
经过电场加速形成一个直径50µ
m大小的电子源（相当于光学显微镜的光源）。
经过双聚焦镜，发射的电子束被聚焦在样品上（电子束斑直径为3-5µ
m）。
穿过样品的电子束经过物镜，在其像平面上形成第一幅高质量的样品形貌放大像，然后再经过中间镜和投影镜的两次放大，最终形成三级放大像而显示在荧光屏上，或当荧光屏竖起来时就被记录在照相底片上。
二、TEM的结构
TEM的结构由镜筒（电子光学系统）、真空系统、电子学系统三个主要部分组成。
电子枪
照明系统
聚光镜
样品室
物镜
成像系统和样品装置系统镜筒
中间镜
投影镜
观察室
像的观察和记录系统
摄影室
（一）镜筒:
按功能可分为三个系统。
1（照明系统
该系统分成两部分:
电子枪和聚光镜。
电子枪由灯丝（阴极）、栅级和阳极组成。
加热灯丝发射电子束。
在阳极加电压，电子加速。
阳极与阴极间的电位差为总的加速电压。
经加速而具有能量的电子从阳极板的孔中射出。
射出的电子束能量与加速电压有关，栅极起控制电子束形状的作用。
电子束有一定的发射角，经聚光镜调节后，形成很小的平行电子束。
电子束的电流密度（束流）可通过聚光镜的电流来调节。
（1）电子枪
电子枪:
发射电子，由阴极、栅极、阳极组成。
阴极管发射的电子通过栅极上的小孔形成射线束，经阳极电压加速后射向聚光镜，起到对电子束加速、加压的作用。
是电镜的照明源，产生和加速电子，照明样品，要求电子枪有很高的亮度、电子发射稳定及稳定的加速电压。
电子枪是由发夹式钨丝阴极三级电子枪。
它由阴极、栅极和阳极组成。
阴极即灯丝，是用直径0.10~0.12mm的钨丝做成的，通常做成发夹形状，当电流加热至2200-2500K时，灯丝产生热电子发射作为电子源。
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阳极对阴极有一加速电压，对电子起加速作用。
一般采用负高压，高压由高压发生器产生，通过高压电缆输送过灯丝。
常用的加速电压为50KV、75KV和100KV，超高压电镜可达3000KV。
加速电压决定电子束波长。
栅极（控制极）可以控制阴极发射电子束的形状和发射强度，对电子发射起限制和稳定的作用。
栅偏压对灯丝因加热电流的变化或加速电压的变化所引起的束流变化，有稳定的作用。
而且栅偏压可以调节，通过改变栅偏压的方法可以改变图像的亮度
（2）聚光镜
聚光镜的作用是将电子枪所发出的电子束会聚到样品平面上。
并调节电子束的孔径角、电子束的电流密度和照明光斑的大小。
现代电镜有2个聚光镜，第一聚光镜是一个短焦距的强磁透镜，可将电子枪交叉点缩小几十倍到一百倍，使束斑为零点几微米或几个微米。
第二聚光镜是一个长焦距弱磁透镜，将第一聚光镜的像再次成像在样品平面上。
聚光镜装有固定光阑和活动光阑，可以得到不同的照明孔径角。
2.成像系统和样品室系统
该系统包括样品室、物镜、中间镜、反差光栏、衍射光栏、投射镜以及其它电子光学部件。
（1）样品室放置待观察的样品，并装有倾转台，用以改变试样的角度，还有装配加热）冷却等设备。
有一套机构，保证样品经常更换时不破坏主体的真空。
样品可在X、Y二方向移动，以便找到所要观察的位置。
经过会聚镜得到的平行电子束照射到样品上，穿过样品后就带有反映样品特征的信息，经物镜和反差光栏作用形成一次电子图像，再经中间镜和投射镜放大一次后，在荧光屏上得到最后的电子图像。
（2）成像系统
物镜:
为放大率很高的短距透镜，对样品成像和放大。
它是决定TEM分辨本领和成像质量的关键。
因为它将样品中的微细结构成像、放大，物镜中的任何缺陷都将被成像系统中的其它透镜进一步放大。
中间镜:
是一个可变倍率的弱透镜，可以对电子像进行二次放大。
通过调节中间镜的电流,可选择物体的像或电子衍射图来进行放大。
投影镜（透射镜）:
为高倍的强透镜，最后一级放大镜，用来放大中间像后在荧光屏上成像。
在二级放大（用物镜和投影镜）中放大倍数可变，以控制终像的总放大倍数。
在三级以上放大中，放大倍数固定。
消像散器:
消像散器是一个附加可调的电场和磁场，以补偿透镜磁场的轴不对称性。
轴不对称、光阑和极靴的污染可引起图像模糊。
（2）样品装置系统
样品载体:
载网直径3mm,厚50~100µ
m。
一般采用带膜（福尔瓦膜）的载网。
样品架:
固定载网的装置。
有顶落式（一次装1~2个载网）和侧插式（一次可装几个铜网）
样品台:
在移动装置控制下，可以带着样品架移动。
样品室有气锁装置，换样品时控制最少量的空气进入镜筒，以便在最短的时间内恢复工作真空。
（3）像的观察和记录系统
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位于投影镜的下部，包括观察室和摄影室。
观察室内有一荧光屏，在电子束照射下，可呈现终像。
电子图像反映在荧光屏上,荧光发光和电子束流成正比。
在主观察窗外有一个观察放大镜，以对图像精确聚焦和观察，可以把终像放大3-10倍。
观察放大镜是双目光学显微镜。
摄影室在观察室的下方，把选择好的像记录在软片上，有专门的快门装置。
软片的感光能力与其波长有关。
（二）真空系统
1.真空系统的主要结构
由机械泵、油扩散泵、真空测量仪器及真空管道组成。
它的作用是排除镜筒内气体，使镜筒真空度至
-5-9-10少要在10托以上，目前最好的真空度可以达到10—10托。
如果真空度低的话，电子与气体分子之间的碰撞引起散射而影响衬度，还会使电子栅极与阳极间高压电离导致极间放电，残余的气体还会腐蚀灯丝，污染样品。
2.电镜要求电子通道是真空的，其原因为:
（1）气体分子与高速电子相互作用而随机散射电子，会引起炫光，或减少像的反差。
一般要求真空
-5达到10托。
（2）电子枪中存在的残余气体会产生电离和放电，从而引起电子束不稳定或闪烁
（3）残余气体与灼热灯丝作用，会不断腐蚀灯丝，缩短灯丝使用寿命。
（4）残余气体聚集到样品上而污染样品。
（三）电子学系统
透射电镜的电路主要由以下部分组成，高压直流电源、透镜激磁电源、偏转器线圈电源、电子枪灯丝加热电源，以及真空系统控制电路、真空泵电源、照相驱动装置及自动曝光电路等。
控制和调节电镜的工作状态。
高压电源:
供给电子加速的加速电压，常用的加速电压为50kV、75kV、100kV、最高可达3000kV。
透镜电源:
提供电子束聚集和各个磁透镜的激磁电流。
电源要求很高的稳定性能。
任何波动都将引起像的变化，从而降低分辨率。
真空系统电源:
提供各真空装置电源。
加速电压和透镜磁电流不稳定将会产生严重的色差及降低电镜的分辨本领，所以加速电压和透镜电流的稳定度是衡量电镜性能好坏的一个重要标准。
此外还有二级真空泵来对样品室抽真空、照相装置用以记录影像。
电子波。
电子光源和电子枪。
静电透镜;
短磁透镜和强磁透镜。
电子透镜的像散;
消像散器。
第二节透射电镜的成像原理
透射电镜是利用透过样品的透射电子成像的。
电子枪发射出电子射线，经透射系统照射在样品上，电子束与样品相互作用后，当电子射线在样品另一方重新出现时，已带有样品内的信息，然后进行放大处理而成像，在终屏上形成带有样品信息的图像，使人眼能够识别。
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电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子发射，如电子束投射到质量大的结构时，电子被散射的多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色。
称电子密度高（electrondense）。
反之，则称为电子密度低（electronlucent）。
一、透射电子显微镜的成像原理可分为三种情况:
1（吸收像:
当电子射到质量、密度大的样品时，主要的成相作用是散射作用。
样品上质量厚度大的地方对电子的散射角大，通过的电子较少，像的亮度较暗。
早期的透射电子显微镜都是基于这种原理。
2（衍射像:
电子束被样品衍射后，样品不同位置的衍射波振幅分布对应于样品中晶体各部分不同的衍射能力，当出现晶体缺陷时，缺陷部分的衍射能力与完整区域不同，从而使衍射钵的振幅分布不均匀，反映出晶体缺陷的分布。
3.相位像:
当样品薄至100?
以下时，电子可以传过样品，波的振幅变化可以忽略，成像来自于相位的变化。
二、透射电镜衬度（反差）的来源
TEM衬度的形成,物镜后焦面是起重要作用的部位。
电子经样品散射后，相对光轴以同一角度进入物镜的电子在物镜后焦面上聚焦在一个点上。
散射角越大，聚焦点离轴越远,如果样品是一个晶体,在后焦面上出现的是一幅衍射图样。
与短晶面间距（或者说"
高空间频率"
）对应的衍射束被聚焦在离轴远处。
在后焦面上设有一个光阑。
它截取那一部分电子不但对衬度，而且对分辨本领有直接的影响。
如果光阑太小，把需要的高空间频率部分截去，那么和细微结构对应的高分辨信息就丢失了。
样品上厚的部分或重元素多的部分对电子散射的几率大。
透过这些部分的电子在后焦面上分布在轴外的多。
用光阑截去部分散射电子会使"
质量厚度"
大的部位在像中显得暗。
这种衬度可以人为地造成，如生物样品中用重元素染色，在材料表面的复形膜上从一个方向喷镀一层金属，造成阴阳面等。
散射吸收（指被光阑挡住）衬度是最早被人们所认识和利用的衬度机制。
就表面复型技术而言，它的分辨本领可达几十埃。
至于晶体样品的衍衬像和高分辨的点阵像的衬度来源，见点阵像和电子衍衬像。
三、像的反差形成原理（电镜的反差主要有三种）
（1）振幅反差
电子散射:
当一定能量入射到样品，由于受到样品中原子的核和核外电子的静电场的作用，使电子运动方向和速度发生变化。
电子散射产生振幅反差，是TEM最重要的成像机制。
振幅反差是由样品的质量厚度不同引起的透射中的电子波强度（振幅）变化所提供。
对于结构细节大小超过0.1~0.15µ
m，厚度大于10µ
m的样品，其反差主要是由振幅反差提供。
（2）相位反差:
对于微细结构<
0.15µ
m、厚度小于10µ
m的成像，其反差主要是由相位反差提供。
（3）衍射反差:
可以加强图像的反差，但像的分辨率将下降。
四、提高散射反差的方法
1（缩小孔径角:
光栏孔越小，像的反差越大。
2（选择正确的欠焦量，而获得样品的最好反差。
离焦反差:
调节物镜使像稍欠焦或稍过焦，像的反差显著地增大。
3（适当降低加速电压，因为电子的散射角度的大小与加速电压的平方成反比关系，降低电子加速电压可以提高图像的反差。
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4（利用暗场显微方法。
用直接透过电子通过光阑所成的像为明场像，相反用散射电子所成的像为暗场像，两者的反差相反。
第三章透射电镜的操作
一、TEM的操作步骤
1（接通电镜工作电源后，电镜开始通过机械泵抽前级和镜筒真空。
2（当镜筒真空达到一定要求时，再由扩散泵抽镜筒的高真空。
3（当高真空能达到加高压的要求时，面板上高真空指示灯亮，表明此时可以加高压了，接通高压并调整高压到合适的高压值。
4（稍等一会待高压稳定后，再加灯丝电流，使荧光屏中心产生一个明亮的光斑。
5（随后依次接通各级透镜的工作电流，调整电镜的工作状态。
6（调整好后再装入样品进行观察，可用低倍的双目镜对图像聚焦。
要选择亮度均匀的区域作为拍摄对象，尽可能使图像充满拍摄区域，把主要的观察对象放在荧光屏中心，对感兴趣的部位拍照记录。
7（电镜使用完毕，应依次关闭高压、灯丝加热电流、关闭各级透镜工作电流以及取出样品。
8（待冷却水再工作10,15min后，关闭电镜和冷却水。
二、透射电镜的调试
主要调整对中、饱和点、灯丝像和消像散等。
1（对中（合轴）:
为了获得高分辨率和高质量的像，要求电子枪和所有的透镜以及光栏等光学部件都在同一轴线上。
2（消像散:
理想的成像要求磁透镜的磁场轴是对称的，而实际上，因各种原因会引起磁场轴不对称，因而产生的像差。
3（聚焦:
一般电镜放大率的改变是通过改变中间镜激磁电流来实现中间镜的焦距改变，它的物平面在镜筒内上下移动，此时必须使物镜的像平面和中间镜的物平面重合，像才清晰，这个过程称为聚焦。
三、像的观察和记录
1（观察（寻找视野）。
尽可能在低倍下寻找视野，选择最佳的研究图像。
2（调好电压对中、电流对中、亮度对中，消除像散，使物镜光阑孔与中心透射斑点同心。
3（拍照。
一般电镜拍照时可降低放大倍率，再根据研究需要用光学放大机放大。
电镜样品由于受电子束照射后，有时会被损坏，所以好的视野要抓紧拍照。
四、图象分析
1（判断污染、刀痕、颤痕、皱折、染色剂沉淀等。
2（综合分析图像，做出立体判断。
3（照片一般要有标尺。
第四章生物样品的制备
第一节概述
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透射电镜在材料科学、生物学上应用广泛。
由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，因此，必须制备超薄切片，切片厚度一般为50,100nm。
所以用透射电镜观察时的样品需要处理得很薄。
常用的切片方法有:
超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。
对于液体样品，通常是将样品放置铜网上，经负染后进行观察。
一、STM的特点
1.分辨本领高，最高分辨率0.1~0.2nm，比光镜提高1000倍，已达到原子水平。
2.由于样品制备技术的限制，对大多数生物样品，一般只能达到2nm的分辨水平。
3.电镜图像的分辨能力不仅取决于电镜本身的分辨率，而且也取决于样品结构的反差。
4.透射电镜所用的光源是电子波，波长在非可见光范围内，所以无颜色反应，所形成的图像是黑白图像，要求图像有一定的反差。
生物体组织和细胞成分主要由C、H、O、N等轻元素组成，它们的原子序数较低，对电子散射能力5.
弱，相互之间的差别又很小，电镜下的图像反差一般偏低。
6.电子的穿透能力较弱，样品必须很薄。
要求厚度为50~100nm。
7.观察面小，载网直径为3mm，超薄切片范围为0.05mm。
8.电子束的强烈照射，易损伤样品，发生变形、升华等，甚至被击穿破裂。
9.为保证样品在真空下不损伤，样品必须彻底干燥。
10.生物制样复杂，步骤繁多，容易改变样品结构。
二、电镜样品取材的基本要求
1.快取材的动作要迅速，材料离体后必须尽快投入固定液，减少自溶作用的影响。
解剖器械要锋利，动作要轻巧，避免牵拉和挤压，尽量减少取材中的机械损伤。
2.准取材要准确。
?
器官要准确?
部位要准确:
如脑垂体的前叶和后叶要分清，其结构和功能各不相同。
3.冷取材过程应尽量在,,,?
低温下进行，所用的固定液及容器都应预冷，以降低酶的活性，减少细胞内结构的损失。
4.小所取材料体积要小，一般大小不超过1mm3，或截面为1mm2的长条，或厚度在0.1mm以下的薄片。
因为固定剂的渗透力较弱，若组织块太大，块的内部将得不到良好的固定。
三、切片的基本要求
1.厚度50~80nm。
2.有良好的反差。
3.耐电子束轰击。
4.细胞结构保存良好，没有明显的物质凝集、丢失或添加等人工效应。
5.切片均匀，没有皱折、刀痕及染色剂沉淀等。
第二节TEM的制样技术
目前，TEM的应用，已将静止的形态学观察与动态的功能研究相结合，研究细胞内物质的合成，转移、生理、生化反应的过程，定位等。
电镜技术的发展不仅表现在仪器本身性能的高度完善和种类的增多，而
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且还反映在与其相应的各种样品制备和应用技术。
根据不同的样品，不同的研究目的，必须采用不同的制样方法。
一、制样方法
1（常规超薄切片技术
一般的透射电镜电子束的穿透能力较弱，大多数标本无法直接在电镜下观察，必须切成厚度为50~70nm的超薄片，这种制作超薄片的技术称为超薄切片技术。
在透射电镜的生物样品制备方法中，超薄切片技术是最基本最常用的制备技术，其他一些样品制备技术，如细胞化学技术，免疫电镜技术及电镜放射自显影技术都离不开超薄切片的制作。
利用透射电镜观察超薄切片，可以了解细胞的精细结构。
通常用于静态结构观察，用锇酸和戊二醛固定样品，环氧树脂包埋，再用热膨胀或螺旋推进的方式进行样品切片，切片后采用重金属盐染色，以增大反差。
.负染色技术2
负染色技术也叫阴性反差染色，它是由Hall等首先采用的一种染色技术，与超薄切片法相比，该技术具有分辨率高、简单易行和快速方便等优点。
因此在生物学研究中广泛应用。
这种方法可以显示大分子、细菌、病毒、原生动物、分离的细胞器及蛋白质晶体等样品的形状、大小和表面结构特征。
尤其是在病毒学领域，有关病毒的分类及病毒亚单位结构的显示、病毒与抗体的相互作用等的研究中，负染色更是不可缺少的实验技术。
负染就是将样品的背景染色以突显样品。
一般用电子密度高，本身不会显示任何结构，又和样品不起反应的物质。
如重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色;
吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出的地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右，常用于观察微小颗粒材料。
3金属投影与复型技术
金属投影技术是利用真空喷镀仪对样品进行投影的一种技术，Williams首先用这种技术用于增加电镜图象的反差。
该技术还可用来测量颗粒及大分子的大小。
复型技术主要用于样品表面结构的研究。
某些坚硬的材料，如牙齿、骨骼、金属等，它们是不透明的，并且很难制成超薄切片，对于这些材料可用一种电子透明的薄膜将其表面结构复制下来，即成复型。
通过对该复型样品的观察，就可以了解原有样品的天然断面或人工断面的结构特征。
4冷冻切片技术和冷冻蚀刻复型技术
冷冻切片技术是使样品迅速冷却，然后用冷冻切片机进行冷冻切片，它省去了普通超薄切片中繁杂的化学固定与包埋操作。
该技术在细胞化学研究中有着特殊用途。
冷冻蚀刻复型技术是一种冷冻断裂与复型相结合的样品制备技术，该技术在生物学中的广泛应用不仅验证了超薄切片所展示的细胞超微结构，而且还揭示了某些前所未见的新结构，尤其是在显示生物膜的结构方面，该技术有着独特作用。
冰冻蚀刻（亦称冰冻断裂）。
标本置于-100?
C的干冰或-196?
C的液氮中，进行冰冻。
然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，能暴露出材料的内部立体结构。
蚀刻后，向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂，再以90度角喷涂一层碳，加强反差和强度。
然后用次氯酸钠溶液消化样品，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。
复膜显示出了标本蚀刻面的形态，在电镜下得到的图像即代表标本中细胞断裂面处的结构。
主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构。
5电镜细胞化学技术
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电镜细胞化学技术又称超微结构细胞化学技术，它是从光镜组织化学的基础上发展起来的一种超微结构技术，它的任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上的分布情况以及这些成分在细胞活动过程中的动态变化，以阐明细胞的化学和生化功能。
该技术有利的促进了形态学和生物化学的结合，使生命科学的研究进入了新的水平。
6免疫电镜技术
免疫电镜技术是通过特殊的标记方法使抗体与电子致密的标记物相结合，然后利用电镜在超微结构水平上鉴定抗原-抗体的结合反应。
在免疫学领域中，这是一种非常有用的实验技术。
7电镜放射自显影技术
电镜放射自显影技术是一种利用放射性同位素作为标记物对细胞化学物质进行超显微结构的定位、定性或定量研究的技术。
这种技术不仅用于对重要的代谢物质进行定位、定性或定量，而且还用于显示抗原-抗体的结合，激素或药物与受体的结合，显示病毒的感染与复制部位等。
因此这是一种非常有用的现代生物学技术。
8.单分子展层技术:
观察核酸分子。
9.电镜三维重构技术:
电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的具有重要应用前景的一门新技术。
电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是当前结构生物学（主要研究生物大分子空间结构及其相互关系）的主要实验手段。
二、超薄切片的制样步骤
（一）、取材方法
1（动物及人体组织的取材
动物组织的取材，应在麻醉（1%戊巴比妥钠按5ml/kg体重腹腔注射）或断头急性处死，解剖出所需器官，用解剖剪刀剪取一小块组织，放在干净的纸板上，滴一滴冷却的固定液，用新的、无油污锋利的（双面）刀片将材料切成大约1?
宽，2,3?
长的小块，从中挑选损伤小的小条，再将其切成,?
3的小块，最后用牙签将这些小块逐一放入盛有冷的新鲜固定液的有盖青霉素小瓶里，放入冰箱冷藏室低温固定（,,,?
）。
2（体外培养细胞的取材
生长在培养瓶中的体外培养细胞取材时，先倒出培养液，接着到入适量的戊二醛固定液，在冰浴上放置,,,min，然后用刮刀轻轻刮下瓶壁上的细胞，
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