整理DNA到蛋白质Word文件下载.docx
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而当DNA分子沿轴扭转的方向与通常双螺旋的方向相同时,造成双螺旋的过旋而形成正超螺旋。
在生物体内,DNA一般都以负超螺旋构象存在。
端终止法测DNA序列即SANGER双脱氧链终止法,其原理是:
DNA链中核苷酸以3’,5’-磷酸二酯键连接,合成DNA所用的底物是2’-脱氧核苷三磷酸。
2’,3’ddNTP与普通dNTP不同,它们在脱氧核糖的3’位置缺少一个羟基。
在DNA聚合酶作用下通过三磷酸基团掺入到延伸的DNA链中,但由于没有3’羟基,不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,因此,正在延伸的DNA链不能继续延伸。
在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一种ddNTP,链延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止竞争,产物是一系列的核苷酸链,其长度取决于引物末端到出现过早链终止位置间的距离。
在4组独立酶反应中分别采用4种不同的ddNTP,结果将产生4组寡核苷酸,它们将分别终止于模板链的A、C、G或T位置。
半保留复制(semiconservativereplication):
一种双链脱氧核糖核酸(DNA)的复制模型,其中亲代双链分离后,每条单链均作为新链合成的模板。
DNA复制的两个半DNA复制有两个主要的特点:
半保留复制和半不连续复制。
由于DNA双螺旋的两条链是反向平行的,而生物细胞内所有催化DNA聚合酶都只能催化5'
→3'
延伸,因此导致了矛盾。
冈崎片段(Okaxakifragments)的发现使这个矛盾得以解决。
前导链上的DNA连续合成,滞后链则以冈崎片段的形式分段、不连续合成。
这些冈崎片段以后由DNA连接酶连成完整的DNA链。
这种前导链连续复制和滞后链不连续复制即DNA合成的半不连续复制现象在生物界普遍存在。
然而直到现在科学家们对于真核生物的冈崎片段仍然了解甚少,这是因为核小体会快速地沉积在新生DNA上,冈崎片段的加工和核小体组装会相互影响。
在真核生物的染色体复制过程中,基因和表观遗传学信息都必须得到精确复制。
染色质的结构和修饰属于表观遗传学的范畴,虽然不会通过基因编码但也是可以遗传的。
防止核小体破坏和与复制叉解离是确保精确定位和修饰的组蛋白在新生DNA链上快速沉积的必要条件。
组蛋白分子伴侣复合物支配着核小体在复制叉的组装和去组装。
DNA复制从本质上讲是不对称的。
滞后链上的冈崎片段合成要求重复生成与复制叉方向相反方向的单链DNA并发生聚合作用。
鉴于滞后链合成和组蛋白快速成绩发生在复制叉之后,这两个过程有可能存在相互关联。
每合成一段冈崎片段就会有一系列相互协调的事件发生。
当前除了知道其在DNA复制中具有的重要作用,对于真核生物冈崎片段的特性仍知之甚少。
此外,对于核小体组装与滞后链合成之间可能存在的相互影响也了解不多。
Meselson-Stahl实验
(l)实验过程:
实验分为两组,
①对照组:
将大肠杆菌一直培养在含14N的培养基上生长。
这样繁殖出的大肠杆菌DNA分子的碱基中的N都是14N。
②实验组:
先将大肠杆菌培养在含15N同位素的培养基上生长。
使大肠杆菌DNA分子中的N都成为15N。
把含15N的大肠杆菌收集起来,洗去菌体外面的15N,并把它们转移到14N的培养基上生长,繁殖四次。
从实验组的五代大肠杆菌中分别提取DNA,在每分钟四万至五万转的速度下进行密度梯度离心二至三天后,不同重量的DNA分布在离心管中的位置不同(因为14N比15N少一个质子,所以14N比15N的原子量轻)。
(2)实验结果:
对照组含14N的ONA分布在试管的上层。
实验组的DNA分子在离心管中分布的情况如下:
大肠杆菌在离心管中的位置DNA分子
第一代下层含15N
第二代中层含15N14N各一半
第三代1中层:
1上层中层为15N14N、上层为N14
第四代1中层:
3上层 中层为15N14N、上层为N14
第五代1中层:
7上层中层为15N14N、上层为N14
(3)结果分析:
对照组因含14N比较轻,所以DNA分布在离心管的上层。
实验组:
第一代:
因为是在15N培养基上繁殖的,DNA含15N,所以DNA分布在离心管的下层。
第二代:
从15N培养基移至14N培养基上繁殖的第一代。
因吸收14N复制新DNA,而这些新DNA分子只分布在离心管的中层,说明DNA分子是半保留复制,而非全保留复制。
第三代:
因为这一代是从第二代繁殖而来,它们的DNA分子有两种。
一种在离心管的上层(全为14N),另一种在离心管的中层(全为15N14N)。
这也说明不是全保留复制,而是半保留复制。
SSB(singlestrandbinding protein) 单链结合蛋白SSB蛋白的作用:
1,保证被解链酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构,它以四聚体形式存在于复制叉处,待单链复制后才掉下,重新循环。
所以,SSB蛋白只保持单链的存在,并不能起解链的作用。
2,可以保护单链DNA不被酶水解。
3,它与酶不同,不具催化活性,但能改变复制过程中的平衡状态和反应速度。
拓扑异构酶(topoisomerase)是指通过切断DNA的一条或两条链中的磷酸二酯键,然后重新缠绕和封口来更正DNA连环数的酶。
拓扑异构酶Ⅰ、通过切断DNA中的一条链减少负超螺旋,增加一个连环数。
某些拓扑异构酶Ⅱ也称为DNA促旋酶。
冈崎片段Okazaki片段,相对比较短的DNA链(大约1000核苷酸残基),是在DNA的滞后链的不连续合成期间生成的片段。
复制叉(replication fork):
DNA复制时在DNA链上通过解旋、解链和SSB蛋白的结合等过程形成的Y字型结构称为复制叉。
在复制叉处作为模板的双链DNA解旋,同时合成新的DNA链
DNA在复制时,双链DNA解旋成两股分别进行。
其复制过程的复制起点呈现叉子的形式,故称复制叉。
以复制叉向前移动的方向为标准,一条模板链为3’—〉5’走向,在其上DNA能以5’—〉3’方向连续合成,称为前导链(leadingstrand);
另一条模板链为5’—〉3’走向,在其上DNA也是5’—〉3’方向合成,但与复制叉移动的方向正好相反,故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段,最后在连成一条完整的DNA链,该链称为后随链(laggingstrand)。
DNA聚合酶DNApolymerase真核细胞有5种DNA聚合酶,分别为DNA聚合酶α(定位于胞核,参与复制引发,不具5'
-3'外切酶活性),β(定位于核内,参与修复,不具5'-3'
外切酶活性),γ(定位于线粒体,参与线粒体复制,不具5'
-3'
有3'
-5'外切活性),δ(定位核,参与复制,具有3'
-5'
,不具5'
-3'
外切活性),ε(定位于核,参与损伤修复,具有3'
-5'
外切活性)。
原核细胞:
在大肠杆菌中,到目前为止已发现有5种DNA聚合酶,分别为DNA聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ,都与DNA链的延长有关。
DNA聚合酶I是单链多肽,可催化单链或双链DNA 的延长,于1956年发现;
DNA聚合酶II则与低分子脱氧核苷酸链的延长有关;
DNA聚合酶III在细胞中存在的数目不多,是促进DNA链延长的主要酶。
DNA聚合酶Ⅳ和Ⅴ直到1999年才被发现。
端粒酶(Telomerase),在细胞中负责端粒的延长的一种酶,是基本的核蛋白逆转录酶,可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。
端粒在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用,端粒酶能延长缩短的端粒(缩短的端粒其细胞复制能力受限),从而增强体外细胞的增殖能力。
Telomeres端粒是线状染色体末端的DNA重复序列。
端粒是线状染色体末端的一种特殊结构,在正常人体细胞中,可随着细胞分裂而逐渐缩短。
把端粒当作一件绒线衫袖口脱落的线段,绒线衫像是结构严密的DNA,排在线上的DNA决定人体性状。
它们决定人头发的直与曲,眼睛的蓝与黑,人的高与矮等等,甚至性格的暴躁和温和。
逆转录(reversetranscription)是以RNA为模板合成DNA的过程,即RNA指导下的DNA合成。
是RNA病毒的复制形式,需逆转录酶的催化。
艾滋病病毒(HIV)就是一种典型的逆转录病毒。
DNA损伤是复制过程中发生的DNA核苷酸序列永久性改变,并导致遗传特征改变的现象。
情况分为:
substitutation(替换)deletion(删除)insertion(插入)exon skipping(外显子跳跃)
RNA世界RNA world定义:
因发现RNA具有催化和自复制(不同于病毒RNA的自复制)功能而提出的一种假说,认为生物进化过程中,最早出现的生物大分子是RNA,而不是DNA和蛋白质,即在进化某个阶段有一个“RNA世界”。
启动子promoter是位于结构基因5'
端上游的DNA序列,能活化RNA聚合酶,使之与模板DNA准确的结合并具有转录起始的特异性。
转录因子TBP:
TATA结合蛋白(TATA-bindingprotein)
加帽酶cappingenzyme催化信使核糖核酸(mRNA)的5′端帽子形成的酶。
将GTP的鸟苷酸转移到(5′)pp-pur-mRNA(pur代表嘌呤核苷酸)上,形成G(5′)pppPur-mRNA,再经修饰加工形成“帽子”结构——5′-m7GpppA(N)。
甲基转移酶methyltransferase其他名称:
甲基化酶(methylase);
转甲基酶(transmethylase) 一种催化将甲基从一种化合物转移给另一种化合物的酶。
DNA、RNA、蛋白质、氨基酸等均可作为甲基的受体。
RNA剪接(RNAsplicing):
从DNA模板链转录出的最初转录产物中除去内含子,并将外显子连接起来形成一个连续的RNA分子的过程。
剪接体splicesome,进行RNA剪接时形成的多组分复合物,其大小为60S,主要是由小分子的核RNA和蛋白质组成。
剪接体本身需要一些小核RNA参与。
这些小核RNA不会翻译出任何蛋白,但对于调控遗传活动起到重要作用。
转录泡transcription bubble :
转录泡是由RNA聚合酶核心酶、DNA模板链以及转录形成的RNA新链三者结合形成的转录复合物。
在转录的延伸阶段,RNA聚合酶使DNA双螺旋解链,暴露出长度约为17bp的局部单链区,因外形酷似泡状结构故称之为转录泡。
转录泡能够沿模板链3’→5’方向移动,速度约为20~50nt每秒,位于RNA聚合酶前端的DNA双链不断解旋,而后端转录过的DNA单链又恢复双螺旋结构。
遗传信息geneticinformation 指生物为复制与自己相同的东西、由亲代传递给子代、或各细胞每次分裂时由细胞传递给细胞的信息,即碱基对的排列顺序(或指DNA分子的脱氧核苷酸的排列顺序)。
阅读框架(Readingframe)是指RNA或DNA中,一组连续且不重复的3核苷酸密码子。
每一条mRNA共有3种可能的阅读框架,而双股的DNA则每股各3种,共6种阅读框架。
geneticcodon遗传密码又称密码子,指信使RNA(mRNA)分子上从5'端到3'端方向,由起始密码子AUG开始,每三个核苷酸组成的三联体。
它决定肽链上每一个氨基酸和各氨基酸的合成顺序,以及蛋白质合成的起始、延伸和终止。
特点:
方向性 密码子是对mRNA分子的碱基序列而言的,它的阅读方向是与mRNA的合成方向或mRNA编码方向一致的,即从5'端至3'端。
连续性 mRNA的读码方向从5'端至3'
端方向,两个密码子之间无任何核苷酸隔开。
mRNA链上碱基的插入、缺失和重叠,均造成移框突变。
遗传密码表
简并性 指一个氨基酸具有两个或两个以上的密码子。
密码子的第三位碱基改变往往不影响氨基酸翻译。
摆动性mRNA上的密码子与转移RNA(tRNA)J上的反密码子配对辨认时,大多数情况遵守碱基互补配对原则,但也可出现不严格配对,尤其是密码子的第三位碱基与反密码子的第一位碱基配对时常出现不严格碱基互补,这种现象称为摆动配对。
通用性 蛋白质生物合成的整套密码,从原核生物到人类都通用。
但已发现少数例外,如动物细胞的线粒体、植物细胞的叶绿体。
三叶草结构cloverleafstructure :
转移核糖核酸的通用二级结构模型,呈三叶草形状,由四个茎和四个环构成。
四个茎是:
氨基酸茎、二氢尿嘧啶茎、反密码子茎和胸腺苷酸-假尿苷酸-胞苷酸(TψC)茎;
四个环是:
二氢尿嘧啶环、反密码子环、可变环和TψC环。
kozak序列:
Kozakconsensussequence,Kozaksequence人类起始密码子周围的序列,存在于真核生物mRNA的一段序列,其在翻译的起始中有重要作用。
核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把它作为翻译起始位点。
注意这段序列并不是ribosomalbindingsite(RBS)核糖体结合位点,而是帽子结构。
真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序列为,-3位为嘌呤碱基;
+4位为G,起始密码子AUG中的A处于+1位。
A/GCCAUGG被称为kozak序列或扫描序列。
SD序列(Shine-Dalgarnosequence):
mRNA中用于结合原核生物核糖体的序列。
SD序列在细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处,有一段富含嘌呤的碱基序列,能与细菌16SrRNA3’端识别,帮助从起始AUG处开始翻译。
起始因子Initiationfactors是指翻译起始阶段端结合到核糖体小亚基上的一些蛋白质,翻译是蛋白质生物合成中的一部分。
延伸因子(elongation factors,EF)是在mRNA翻译时促进多肽链延伸的蛋白质因子。
在原核生物和真核生物中,延伸因子并不相同。
原核延伸因子原核延伸因子是原核细胞进行翻译时所需要的三种延伸因子,分别命名为EF-Tu、EF-Ts以及EF-G(其中EF-Tu和EF-Ts可以复合为EF-T)。
原核延伸因子的化学本质都是蛋白质,它们的作用如下:
EF-T由EF-Tu和EF-Ts组成,当EF-T与GTP结合后可使EF-Ts与EF-Tu分离。
EF-Tu(elongation factor thermounstable,热不稳定延伸因子)介导氨基酰-tRNA进入核糖体空出的A位。
“进位”过程需消耗EF-Tu水解其复合的GTP产生的能量来完成。
EF-Ts(elongationfactorthermostable,热稳定延伸因子)是EF-Tu的鸟苷酸交换因子,能催化与EF-Tu复合的GDP转化为GTP并重新形成EF-Tu和EF-Ts的二聚体(EF-T)。
EF-G(elongationfactorG,延伸因子G)具有转位酶活性,由水解GTP供能,使核糖体沿mRNA向下移动一个密码子,催化核糖体A位中的肽酰-tRNA进入P位,使A位再次空出。
真核延伸因子 真核细胞的延伸因子也有3个,分别称为eEF1α、eEF1β和eEF2。
eEF1α和eEF1β的作用相当于原核生物的EF-Tu和EF-Ts,eEF2相当于EF-G。
终止因子(release factor):
蛋白合成时,当核糖体移动到终止密码子时,没有相应的氨酰tRNA进入A位,而一种蛋白因子可进入,促使多肽的释放和核糖体的解离,此蛋白称终止因子。
也即释放因子。
提供转录信号的DNA序列称为终止子,协助RNA聚合酶识别终止信号的辅助因子(蛋白质)则称为终止因子。
多聚核糖体(polyribosome)是指合成蛋白质时,多个甚至几十个核糖体串联附着在一条mRNA分子上,形成的似念珠状结构。
在合成多蛋白质时,核糖体并不是单独工作的,常以多聚核糖体的形式存在。
一般来说,mRNA的长度越长,上面可附着的核糖体数量也就越多。
讲义:
一、核酸的结构
(一)DNA的结构
1.DNA的一级结构
动物染色质DNA是双螺旋线型。
线粒体、细菌及某些病毒是双螺旋环状。
少数几种病毒是单链线型或环状。
DNA主要由A、G、C、T和少量稀有碱基如m5C组成。
各种生物碱基组成规律:
a.ﻩ腺嘌呤与胸腺嘧啶完全相等。
G与C完全相等。
嘌呤总数与嘧啶总数完全相等。
A+C=G+TA/T=G/C。
b.ﻩ碱基组成具有种的特异性,既不同的物种DNA具有自己独特的碱基组成。
c.ﻩ碱基组成不具有组织器官特异性,同一生物各组织器官具有相同的碱基组成。
d.年龄、环境、营养状态不影响DNA碱基组成。
ﻩ
DNA的一级结构是4种脱氧核苷酸按一定的方式、数量、排列顺序形成的多核苷酸链。
一个脱氧核苷酸的C3’-OH与一个C5’-P以3’—5’磷酸二酯键相连形成糖-磷酸骨架,碱基在内侧,3’端为-OH,5’端为-P,书写时按5’→3’方向。
真核生物DNA一级结构中,常有一些重复序列。
①高重复序列:
重复频率高,从几十万次到几百万次,重复序列较短,5~300bp,多数为5~15bp。
重复序列中有些是反向重复序列,即该片段碱基顺序在互补链方向正读反读都相同,称回文结构。
有些反向重复序列中间被一些不相关的顺序隔开,形成十字形结构,在十字形两头形成发夹环。
高重复序列中还有一种由简单重复单位组成的重复序列,重复单位由2~10bp,成串排列。
高重复序列碱基组成不同于其它部分,可用等密度梯度离心法将其与主体部分分开,称为卫星DNA。
根据重复频率和重复序列长度不同又分为小卫星DNA和微卫星DNA。
卫星DNA是一种较好的分子遗传标记。
高重复序列可参与DNA复制及基因表达调控。
②中重复序列:
重复频率和序列长度有很大差异,平均长度为6×
105bp,平均重复350次,在DNA一级结构中可成串的排列在一个大的区域,也有的与单拷贝序列间隔排列,有些序列不编码蛋白质,有些序列编码蛋白质。
中重复序列具有种的特异性,可作为探针区分不同种哺乳动物细胞DNA。
③低重复序列——单拷贝序列,序列不重复或只重复几次、十几次,长度大于1000bp,携带大量遗传信息,编码多种蛋白质,有的是基因间隔序列。
2、DNA的二级结构 DNA的二级结构是Waston和Crick于1953年提出的双螺旋结构模型。
其要点如下:
①主链:
有两条反向平行的脱氧多核苷酸链组成。
双链围绕螺旋轴以右手方向盘绕成双螺旋。
磷酸-脱氧核糖位于螺旋的外侧,构成螺旋的主链,碱基位于螺旋的内侧。
②碱基对:
两条链的碱基通过氢键联系在同一平面上形成碱基对,A--T,G--C。
两种碱基对氢键间的距离、碱基两侧与其C-1’连接之间距离及C-1’与核苷酸构成的角度相同。
③螺距:
双螺旋螺距为3.4nm,包含10个碱基对。
每两个相邻碱基平面的垂直距离为0.34nm,直径为2.0nm。
相邻碱基对之间的螺旋角度为36°
。
④大沟和小沟:
两条主链和碱基并不充满双螺旋的空间,表面形成大小两条凹下去的槽,称大沟和小沟。
这是由于碱基对上下大小不同及碱基对两侧的脱氧核糖是不对称的而形成的。
两种沟内都具有形成氢键的氢供体和受体,但结构不同。
大沟比小沟宽而深,易与DNA蛋白质酶等相互作用。
这种模型为B-DNA,随着DNA分析技术的发展,DNA的双螺旋不是均匀的,整个螺旋不是垂直而是弯曲的,许多结构参数是随碱基序列的不同而有一定范围的波动,如旋转角度等。
稳定双螺旋结构稳定的因素有:
互补碱基间氢键,碱基堆积力(碱基平面之间的范德华力和疏水作用力),离子键(外侧磷酸基的负电荷与介质中的阳离子之间形成的离子键)。
DNA双螺旋的多态性:
DNA在不同条件下存在有不同的双螺旋结构,具有多态性。
如:
A、A’、B、B’、C、C’、D、E、Z等。
①A-DNA:
DNA纤维钠盐在湿度为75%时,B-DNA转变为A-DNA。
A-DNA的右手螺旋比B-DNA大且较平,每转一圈的螺距为2.8nm,每一圈的碱基对数为11,碱基距离0.255nm,碱基旋转33°
碱基平面与中心轴不垂直,而成20°
倾斜,大沟窄而深小沟浅。
②Z-DNA 结构特征:
a:
以二聚体dGC或dCG为一个单位,由六个这样的单位构成一个左手螺旋。
磷酸基团走向成Z型。
螺旋直径为1.8nm。
每转一圈包括12个碱基对,螺距为4.5nm。
b:
G--C碱基对不是对称的位于螺旋轴附近移向边缘,G位于DNA分子表面成六面对称排布,表面有窄而深的小沟。
影响Z-DNA形成与稳定的因素:
①单价、二价金属离子有利于Z-DNA的形成与稳定。
多胺等促进Z-DNA的形成与稳定。
②具有嘧啶、嘌呤交替相间的序列有利于Z-DNA的形成。
③胞嘧啶或鸟嘌呤的甲基化可形成稳定的Z-DNA。
④组蛋白H2A、H2B、H3、H4稳定Z-DNA而组蛋白H1和H5不利于Z-DNA的形成。
⑤在有适当碱基序列的部位解旋时,促进Z-DNA的形成。
1.三螺旋DNA的结构分为分子间、分子内、和平行三螺旋DNA三类
①碱基组成及配对:
三螺旋是在双螺旋的结构基础上形成的
三链区的三条链均由同型嘌呤或同型嘧啶组成。
根据碱基组成及结构的不同分为嘧啶-嘌呤-嘧啶型(Y。
RY型):
TAT、CGC,嘌呤-嘌呤-嘧啶型(R。
RY型):
AAT、GGC。
碱基配对方式,第三个碱基以A--T、G--C配对只形成两对氢键,在R。
RY型上还存在G--G、A--A每一型中碱基配对具有高度的序列特异性。
②分子间三螺旋DNA:
合成的脱氧多核苷酸在一定条件下DNA双螺旋的特定区插入双螺旋结构的大沟内,通过氢键的形成局部的分子间三螺旋结构,并与双螺旋一起旋转。
③分子内三螺旋DNA:
DNA双螺旋特定区通过氢键作用发生自身折叠形成局部分子内三股螺旋结构,同时游离出一段DNA单链。
如H-DNA,其内的主要序列成为H-回文序列。
④平行的三螺旋结构:
三螺旋结构