重医免疫学思考题解析Word格式.docx
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外界环境条件:
1).电解质:
一般实验室所用电解质都是生理盐水(0.9%NaCl),浓度不能过高。
浓度过高,会使Ab蛋白质优先沉淀而出现盐析现象。
2).PH:
一般为PH6-8,当PH<
3时,可出现颗粒性的非特异性凝集,称酸凝集。
当PH过高,可碱变性。
3).温度:
抗原抗体反应的常用温度为37°
。
四、抗原抗体反应分哪些种类?
沉淀反应;
凝集反应;
补体参与的溶血反应、补体结合试验;
中和试验;
免疫标记技术。
五、什么是交叉反应,有无特异性,为什么?
在临床上有何意义?
1)交叉反应(cross-reaction)—-抗体对具有相同或相似抗原表位的不同抗原的反应称为交叉反应。
2)有特异性。
(交叉反应并没有违背Ag、Ab特异性结合的原则,其产生的先决条件是存在共同Ag表位。
)
3)交叉反应的意义:
1免疫学诊断:
(利用交叉反应)eg外斐氏反应等:
用变形杆菌0X19、0X2、OXk作抗原查血清抗体,诊断斑疹伤寒(立克次氏体感染所致)
2可造成免疫病理损害:
eg链球菌感染后易导致肾小球肾炎,其原因为链球菌与人体肾小球基底膜有共同Ag表位所致。
沉淀反应、免疫电泳
、双扩、单扩、对流免疫电泳、免疫电泳实验的原理,方法,用途
双扩
单扩
对流免疫
免疫电泳
原理
可溶性抗原与相应抗体在电解质存在下,在琼脂基质中扩散,当两者相遇,比例恰当时结合,可出现肉眼可见的沉淀线。
定向加速的免疫双扩
(双扩+电场,使抗原、抗体相对泳动)
Ag区带电泳+双扩结合
方法
1、制琼脂板(3ml
1.5%NS琼脂)
2打孔(双孔型/三角孔型/梅花孔型加样(平孔沿加满)扩散(37C、24h观察结果)
1.已知抗体+琼脂制板、打孔
2.在琼脂板小孔中加梯度抗原
3.抗原向四周扩散形成沉淀环
4.抗原浓度与沉淀环直径呈线性关系绘制标准曲线
5.从标准曲线上查出并计算出待测标本含量
抗原、抗体分别在琼脂板上不同孔内,抗原在负极端,抗体在正极端,电泳。
电压:
4~6v/cm(琼脂长度)
电泳时间:
45分钟~1小时
1.Ag电泳分出区带
2.Ag、Ab免疫
用途
1•已知Ag或Ab测未知Ab或Ag:
双孔型
2•抗原性质分析:
三角孔型
3•测Ag有效稀释度:
梅花孔型
定量测定,如测
IgG、IgA、IgM、
C3等含量
用于HBsAg、AFP等
检测
1、常用于分析复杂Ag的组分。
(如人全血清组分的分析)
2、多发性骨髓瘤等疾病的测
疋
二、影响电泳的因素有哪些?
影响电泳的因素:
1•与溶液的pH有关:
常用pH8~9,蛋白质带负电
2.与溶液离子强度有关:
愈高,泳动慢,一般0.02~0.2M
3.与电场强度有关:
愈高,愈快,一般4~6v/cm(琼脂长),约40v左右
4•电渗作用的影响电渗作用:
电场中液体对于一固体的固定相对移动的现象
电渗方向与电泳方向相反。
凝集反应
、玻片凝集试验和试管凝集试验的区别
玻片法
用已知抗体检测未知抗原
于玻片上先加已知抗体,再加入待测物(未知抗原),混匀。
如发生凝聚,说明待测物中有与抗体相对应的抗原
ABO血型鉴定菌种鉴定
试管法
用已知抗原测未知抗体的效价
属半疋里试验
1~9号试管分别加不同稀释度待检血清(容量相同,Ab),10号加NS(对照),各管再加定量(浓度、容量一样)的Ag。
结果:
以出现明显凝集的血清最高稀释度(即可以判为++者)作为该血清
(Ab)的凝集效价。
举例:
1.肥达氏反应(Widaltest)
2.外斐氏试验
(Weil-Felixtest)
二、反向间接凝集试验、间接凝集抑制试验的原理及实例
1、反向间接凝集试验
原理:
将已知抗体吸附于颗粒性载体上,检测未知抗原
实例:
反向间接血凝检测HBsAg、AFP等
2、间接凝集抑制试验
待测样本(可溶性Ag?
)+已知Ab-+已知致敏Ag颗粒(已成为颗粒性Ag)-观察是否有凝集现象不凝集为阳性,凝集为阴性。
用胶乳凝集抑制试验检测小便中绒毛膜促性腺激素(HCG)
三、协同凝集试验的原理
实质为反向间接凝集反应
葡萄球菌A蛋白(StaphylococcusproteinA,SPA能非特异地与IgG的Fc段结合,当与特异性抗原相遇时,IgG的Fab段与抗原结合,出现金葡菌的凝集现象(属特殊间接凝集试验)
协同凝集试验实际是用已知抗体检测未知抗原,可用于多种抗原的检测
四、比较沉淀试验和凝集试验的异同
沉淀试验
凝集试验
抗原性质
可溶性Ag
颗粒性Ag
稀释对象
抗原
抗体
结果现象
沉淀现象
凝集现象
敏感性
低
高
免疫荧光技术
一、免疫标记技术的原理
用荧光素标记抗原或抗体,与待测标本中相应抗体或抗原结合,通过检测
荧光,确定标本中有无待测的抗体或抗原。
二、免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么?
1.异硫氰酸荧光黄(Fluoresceinisothiocyanate,FITC)可发出黄绿色荧光
2.四乙基罗丹明(rhodamine,RB200)发出橘红色荧光
3.四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)
发出橙红色荧光
、免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点
特点
直接法
待测标本固定(Ag?
)+Ab
---洗涤----AgAb
快、直接、干扰因素少用于检测抗原每检测一种抗原要标记相应荧光抗体,
较麻烦
间接法
第一步:
荧光素标记抗抗体
(如荧光标记的羊抗人
IgG);
第二步:
已知Ag固定+待测标本(Ab?
)洗,+荧
光标记的抗抗体洗,荧
光显微镜镜检
优点:
制备一种荧光标记二抗(抗抗体)可用于多种Ab检测
灵敏度咼
补体法
荧光素标记抗补体;
第二步:
已知Ag固定+待测标本(Ab?
)+补体洗,
+荧光标记的抗补体洗,荧光显微镜镜检
特点:
灵敏度咼,制备一种荧光抗补体用于多种检测
干扰因素多,补体不稳定,易失活,
该法少用
免疫荧光显微技术优缺点
1•特异性、敏感性高2.快速3•可定位4•既可测Ag又可测Ab
缺点:
1•需要荧光显微镜
2•存在非特异荧光干扰(产生原因:
自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题)
3.定性测定、判断结果不客观
4.制备片子难保存(荧光猝灭)
免疫酶技术
一、ELISA的原理、方法(以间接法测抗体和双抗夹心法为例)及影响因素。
原理:
将酶分子与Ab或Ag连接成一酶结合物(酶标记物),当它与固相载体中相应
Ag或Ab相遇,形成酶标记的AgAb复合物,加入底物,酶催化底物,生成有色产物,根据颜色深浅可测出溶液中Ag或Ab的量。
方法:
双抗体夹心法:
包被已知Ab‘洗涤‘加待测标本,(测Ag?
)>洗涤>
加酶标AbT洗涤t加底物t加终止液T观察结果
间接法:
包被已知Ag+待测标本(测Ab?
'
反应一段时间后,洗涤>加酶标
抗抗体(酶标羊抗人IgG)T洗涤T加底物T加终止液,观察结果。
(该法主要用于测抗体;
酶标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测)影响因素:
(一)固相载体:
常用固相载体材料:
聚苯乙烯。
其特点为吸附Ag或Ab的能力强,一但吸附后,不能被洗脱。
(二)抗原、抗体
Ag:
需纯化
Ab:
需效价高、亲和力强、纯化
(三)试验条件
1.包被:
一般用pH9.6CB(carbonatebuffer),0.05M,有利于蛋白质吸附
包被浓度:
0.1~100g/ml,一般常用10g/ml
包被时间、温度:
4C过夜或37C1-3h
包被量:
100ul
封闭:
用0.1~5%牛血清白蛋白缓冲液浸泡0.5小时
2.抗原抗体反应的条件
(1)微碱性有利于抗原抗体结合,故用pH7.4PBS(phosphatebuffersaline)洗涤
(2)去污剂有利于AgAb形成,洗液中加0.05%Tween-20
(3)Ag、Ab反应时间、温度:
一般37C、40min
3.洗涤
采用PH7.2-7.4PBS洗涤,规一化,每次浸泡1~2min,拍干,共洗涤3~4次
4.酶促反应条件
温度37C时间10minpH5.5底物量一致
5.排除干扰:
多设对照
二、ELISA试验应设哪些对照,为什么?
阳性对照;
阴性对照;
酶结合物对照;
底物对照;
空白对照
三、判断ELISA试验结果的方法。
1•若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性;
2•若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性;
3•若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。
免疫血清的制备
一、免疫血清制备的主要程序。
免疫程序:
注射抗原>
试血和放血)鉴定、保存
试血和放血:
试血:
末次Ag注射后,测定血清中Ab的效价,叫试血。
若Ab达到所需效价,即可放血。
若未达到,继续追加免疫Ag一次。
可溶性Ag:
用双扩(梅花孔型);
颗粒性Ag:
用直接凝集试验(试管法)放血:
直接颈动脉放血或直接心脏穿刺抽血。
然后分离出血清,即可得到Ab
二、佐剂概念、作用机理、福氏不完全/完全佐剂的组成。
.佐剂(adjuvant):
同Ag一起或预先注入机体,能增强机体对该Ag的免疫应答或改变
免疫应答类型的物质。
作用机理:
组成:
1•福氏不完全佐剂(FIA):
羊毛脂+石腊油,二者比例为4:
1
2•福氏完全佐剂(FCA):
羊毛脂+石腊油+卡介苗
免疫效果更好,因为进一步提高、加强了免疫反应,并使免疫反应发生质的改变。
免疫球蛋白的分离提纯
分离提纯免疫球蛋白有哪些方法,其原理是什么?
盐析法
在不同浓度的中性盐中蛋白质会脱水,降低带电电势,亲水性变为疏水性,分
子间相互凝聚而沉淀(盐析作用)。
离子父换层析法
利用不冋的蛋白质在缓冲溶液中所带电荷不冋,与某一载体上的具有相反电荷的离子基团进行吸附,然后进行解脱,达到纯化蛋白质目的。
凝胶过滤
法
凝胶颗粒是网状结构,当分子大小不同的混合物通过凝胶柱时,分子大的先下
来,分子小的嵌入凝胶颗粒的网状结构中后下来,从而将分子大小不同的物质
分离开来,即为分子筛的作用。
亲和层析法
利用抗原抗体的结合具有特异性、可逆性,将纯化抗原先交联(吸附)到载体
(琼脂糖珠)上,制成亲和层析柱,当Ab(Ig)通过时,与抗原特异性结合
于柱上,Ab中杂质流出。
然后通过改变缓冲液pH、离子强度,使Ab解脱下
来。
单克隆抗体及应用
一、单克隆抗体概念
针对Ag分子表面某一抗原决定簇(又称表位)而产生的抗体分子,称McAb
单克隆抗体一一由一个B细胞克隆产生的识别单一抗原表位的同源抗体。
二、杂交瘤技术制备单抗的原理及简要步骤
1、B细胞(浆细胞)特点:
1)能产生抗体2)但不能在体外长期培养3)细胞内含HGPRT酶(次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶)和TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶),可通过旁路途径合成DNA
2、骨髓瘤细胞
1)能在体外长期培养2)不含HGPRT和TK酶
3、杂交瘤细胞具有以上两种细胞的共性:
既能产生抗体、在体外能长期培养;
同时含有HGPRT和TK酶,可通过旁路途径合成DNA
4、HAT培养液筛选出杂交瘤细胞
(次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶):
氨基蝶呤是抗代谢的药物,能阻断内源性合成DNA(合成DNA的主要途径)。
简要步骤:
1•制备能产生单抗的杂交瘤细胞
2•克隆化杂交瘤细胞
3•筛选杂交瘤细胞
4.扩大培养单克隆杂交瘤细胞
5•收集单抗并鉴定
6.纯化单抗
(具体的步骤可以参考ppt)
三、HAT培养基的作用
筛选出杂交瘤细胞
四、人源单克隆抗体
概念:
单克隆抗体为人IgG
五、基因工程抗体、嵌合抗体概念,嵌合抗体优点
基因工程抗体:
在基因水平上对编码抗体的基因进行切割、拼接或修饰,甚至人工合成,然后导入受体
细胞内表达而产生的抗体(单克隆抗体)。
嵌合抗体概念:
用DNA重组技术将鼠源单抗基因的可变区(V区)基因与产生人lg的恒定区(C区)
基因相连接,构成嵌合基因,导入受体细胞(骨髓瘤细胞),表达出嵌合抗体。
嵌合抗体优点:
a.免疫原性低,有利于用于人体
b.在人体内半衰期较鼠单抗长
c.在人体内生物学作用(如CDC、ADCC)较鼠单抗强
d.与人/人杂交瘤比,体外传代更稳定
补体的检测与应用
一、补体的定义、组成及性质
定义:
补体是存在于人和动物血清中的一组具有酶活性的球蛋白,一般情况下处于未激活状态。
1•补体的固有成分:
C1-C9,其中C1又包括C1q、C1r、C1s,共9种成分11种蛋白分子。
其中C9的分子量最小、C3的含量最高;
2•补体的调节蛋白:
如C4调节蛋白、C1抑制物、S蛋白等;
3•补体受体;
女口C1qR、C3aR等;
性质:
稳定性差,各种理化因素都可使之失活:
如酸、碱、紫外线照射、剧烈震荡等
二、CH50实验的原理、正常值及意义
a组成和功能完整的补体系统能使致敏羊红细胞发生溶血;
b.羊红细胞的溶血程度与补体的活性成正比;
(S型)
c.在50%溶血附近(30%—70%之间),稍微改变补体量,溶血程度变化明显,因此以50%
溶血率来判定终点较100%更为敏感,所以该试验称为50%溶血试验(CH50)。
正常值:
50—100U/ml
意义:
1•补体量T:
多见于急性炎症感染、组织损伤、癌肿;
2•补体量见于补体消耗f:
体内有Ag、Ab反应,如SLE、RA等;
补体合成J:
肝脏疾患;
补体先天性缺乏:
具有遗传性和家族史
三、补体结合实验的原理、结果判断及评价
补体可与任何一组AgAb复合物结合;
一旦与某一AgAb复合物结合后,便不再与另一复合物结合。
结果判断:
不溶血为阳性,即待测物中有相应的Ab或Ag;
溶血为阴性,即待测物中无相应的Ab或Ag.
评价:
优点
缺点
1、该试验既可测Ag、又可测Ab;
2、Ag既可以是颗粒性Ag、也可是可溶性
Ag、甚至可以是块状物,因此检测Ag的范
围广;
3、可以用于病毒、立克次氏体、细菌等多种
病原体的检测(实际上是测Ag);
4、比较敏感(0.05卩g/ml)、特异;
5、结果判断明显:
通过有无溶血来观察,无需特殊仪器检测。
1、参与反应的物质多,影响因素也多;
(反应体系中有Ag、Ab、C、羊红细胞、溶血素)
2、在正式试验前需要找出几种物质间最恰当的比例,比较复杂。
机体免疫功能检测
、人体免疫功能包括哪些组成部分?
类型
■组成
非特异性免疫
1•皮肤、黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑菌、杀菌物质2•吞噬细胞的吞噬作用
3.NK(naturekiller)细胞对病毒感染靶细胞的杀伤作用
4•血液、体液中的抗菌分子:
补体、溶菌酶
特异性免疫
细胞免疫:
由TLC主导完成,其效应物质是致敏TLc(CTL/Th1)体液免疫:
由BLC主导完成,其效应物质是Ab
二、实验室中检测人细胞免疫和体液免疫最常用哪些试验,这些试验的原理如何?
正常值应为多少?
一.T细胞的计数(T细胞表面标志的检测)
(一)特异性抗原的检测
T细胞表面有一些特异的CD抗原,根据这些不同的CD抗原可鉴定不同的T细胞群体CD抗原:
淋巴细胞群(簇)分化抗原:
不同群淋巴细胞在分化成熟过程中,细胞表面出现或消失的抗原分子检测T淋巴细胞表面CD抗原中:
CD3+的数量表示成熟的总T淋巴细胞的数量,
CD4+的数量表示是Th细胞的数量,
CD8+的数量表示是CTL/Ts细胞的数量。
CD4+/CD8+>
1.5。
免疫功能差或者免疫功能紊乱,该比值小于1
(二)T细胞特异性受体(E受体)的检测
E花环形成试验(ErythrocyteRosetteformingtest)
T淋巴细胞表面含有绵羊红细胞(SRBC)受体(CD2),当T淋巴细胞与绵羊红细胞
相遇时,T细胞通过该受体吸附绵羊红细胞而形成花环。
Et花环形成试验:
60%~80%(代表T细胞总数)
Ea花环形成试验:
20%~30%(活性强的T细胞)
二、T细胞功能的检测
检测T细胞功能的试验有:
(一)淋巴细胞转化试验
1•原理
淋巴细胞在某些物质刺激下,细胞增殖、分化(如细胞变大、胞浆增多、出现空泡)
DNA合成增加(核染色质疏松,核仁出现),转化成为淋巴母细胞。
正常值60%〜80%
(二)相关的细胞因子的检测(在细胞因子章节介绍)
(三)淋巴细胞的细胞毒性检测
细胞毒性T细胞(CTL)具有杀伤靶细胞的功能,它是评价机体细胞免疫水平的指标。
检测这种杀伤作用的试验称为细胞毒试验。
CD8+CTL与靶细胞表面相应抗原结合通过脱颗粒,释放穿孔素、颗粒酶,使靶细胞溶解、凋亡。
三、B细胞数量的检测
(一)B细胞表面识别抗原受体(BCR)
(Smlg,Surfacemembranelg)的检测
I.Smlg是B细胞表面膜免疫球蛋白,存在于成熟B淋巴细胞膜上,为B细胞结构蛋白。
类型为:
IgM、IgD型。
15%~25%
(二)B细胞表面抗原的检测
B细胞表面特有的CD抗原有:
CD19、CD21,用抗CD21的单抗(免疫荧光法、酶免疫组化法)检测外周血淋巴细胞,阳性细胞为B淋巴细胞,约占总淋巴细胞的10%~15%。
四、B细胞功能的检测
(一)血清中lg的测定
人的体液免疫功能正常(B细胞功能正常),应反映在血清中有正常量的免疫球蛋白检测人免疫球蛋白常用方法:
单向琼脂扩散试验、免疫比浊法
IgG12.0mg/ml(7.6~16.60)
IgM1.3mg/ml(0.40~2.20)
IgA2.0mg/ml(0.70~3.50)
(二)血型抗体效价的测定
反映体内IgM水平
正常6月婴儿抗A>
1:
8,或抗B>
1:
4;
1岁后抗A>
1:
16,或抗B>
8
如3岁以上抗A或抗B效价仍<
4,表示IgM缺乏,提示先天性体液免疫功能缺陷。
(三)抗原刺激机体后抗体应答反应(体内试验)
将抗原注射到体内,一段时间后检测相应抗体效价,如抗体效价低,说明机体体液免疫
功能差
如用三联伤寒菌苗0.25ml注射,每周1次,连续3次,抗H应为1:
160,若低,表示体液免疫应答功能差。
免疫复合物及检测
一、免疫复合物的含义及免疫复合物病的致病原因
含义:
immunecomplex,IC它主要指AgAb复合物及AgAbC复合物两种。
致病原因:
中等大小的IC沉积在体内,通过激活补体、激活血小板而致病。
二、免疫复合物检测使用的标准品、出现的问题及WHO推荐的检测方法标准品:
目前普遍应用的标准品是AHG――热聚合人IgG(不是IC)。
出现问题:
到目前为止,所有检测IC的试验,还没有另人满意的标准化措施;
在体外制备的IC还很不稳定,因此用人工合成的复合物作为定量标准不适宜。
WHO推荐的检测方法:
C1q结合试验、胶固素试验、类风湿因子(RF)试验、Raji细胞试验
自身免疫性疾病及检测
、AID的基本特征及常见的AID有哪些?
1诱因可有可无。
2、有一定的遗传倾向。
3、女性患者多见,发病率随年龄增长而增加。
4、患者血清中可检出高效价的自身抗体和(或)自身致敏T淋巴细胞。
一些自身抗体在自身免疫病中呈现交叉重叠现象:
即在同一种自身免疫病患者体内可检测到多种自身抗体,而不同的自身免疫病也可存在同一种自身抗体。
5、IgG、IgA、IgM升高,尤其IgG升高明显。
6、病损局部可发现有淋巴细胞、浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润及免疫复合物沉积。
7、免疫抑制剂治疗可取得一定疗效。
二、ANA的定义及ANAs的组成
ANA原指抗细胞核抗原成分的自身抗体的总称。
ANA广义地指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体的总和。
ANA所针对的靶抗原由细胞核
扩展到整个细胞,包括细胞核、细胞浆、细胞骨架及细胞周期等。
抗DNA抗体:
抗dsDNA、抗ssDNA抗体抗组蛋白抗体(AHA):
抗H1、H2A、H2B、H3、H4