药化实验文档格式.docx
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然后，用0.3‰硫酸水溶液1000ml，以6~8ml/分钟的速度进行渗漉。
渗漉液直接进入阳离子交换树脂柱。
3．离子交换树脂法纯化
（1）吸附一叶萩的酸水提取液通过阳离子交换树脂柱（取50g阳离子交换树脂，动态装柱），以6~8ml/分钟的流速进行交换，测定交换液的pH值，画出时间与pH值的曲线图。
时间设定为
（2）碱化酸水液全部交换完毕后，将树脂倾入烧杯中，水洗至澄明，抽干，放置培养皿中，室温风干。
然后，将树脂用氨水10ml~12ml碱化，放置20分钟后挥散多余氨。
（3）提取将树脂装入滤纸筒，置入索氏提取器中，用石油醚（30℃~60℃）120ml，水浴回流提取3小时，取出树脂筒。
提取液回收至体积20ml左右转移到干燥的小锥形瓶中，加盖放置，结晶析出后抽滤。
（四）鉴定
1．生物碱沉淀反应
（1）碘化铋钾试剂反应取渗漉液1ml，加碘化铋钾试剂1滴～2滴，生成棕色至棕红色者为阳性反应在。
（2）碘-碘化钾试剂反应取渗漉液1ml，加碘-碘化钾试剂1滴～2滴，生成棕黄色沉淀者为阳性反应。
（3）硅钨酸试剂反应取渗漉液1ml，加硅钨酸试剂数滴，生成淡黄色沉淀者为阳性反应。
2．薄层色谱鉴别
TLC：
[吸附剂]：
Al2O3（中性）
[展开剂]：
a．CHC13
b．石油醚：
CHC13
c．CHC13：
EtOH=9：
1
[样品]：
一叶萩碱/CHC13液
[标准品]：
[显色剂]：
碘化秘钾：
EtOH=9：
3化学反应鉴别：
取适量生物碱用氯仿溶解，平均分成三份，做以下三组试管鉴别反应：
（1）碘化铋钾试剂反应：
取溶液1ml，滴加1-2滴盐酸溶液，随后加碘化铋钾试剂1滴～2滴，观察溶液变化情况。
（2）碘-碘化钾试剂反应：
取溶液1ml，滴加1-2滴盐酸溶液，随后加碘-碘化钾试剂1滴～2滴，观察溶液变化情况。
（3）硅钨酸试剂反应：
取溶液1ml，滴加1-2滴盐酸溶液，加硅钨酸试剂数滴，观察溶液变化情况。
4.熔点测定：
显微熔点测定仪
（1）实验操作：
三、注意事项
1．装树脂柱时用蒸馏水将已处理好的树脂悬浮起来，加到底部垫有脱脂棉的交换柱中，待树脂颗粒下沉后，其上复盖一层棉花或一张滤纸，以免加入液体时冲散树脂表面；
另外，在整个操作过程中树脂的上部要留有少量液体，以免进入空气，影响交换效果。
2．在酸水渗漉提取和离子交换树脂吸附过程，一定要注意控制流速，避免流速过快而影响提取和交换效率。
四、实验指导
1．实验进度安排
次数
时数
实验内容
6
生物碱的提取，树脂的预处理
2
树脂的碱化，提取
3
4
一叶萩碱的理化鉴别及色谱鉴定
2．实验所用仪器和药品
仪器名称
规格
数量
备注
锥形瓶
1000ml，50ml
烧杯
250ml
培养皿
15cm
色谱柱
2cm×
60cm
索氏提取器
1套
电热水浴锅
2孔
供两组用
药品名称
试剂规格
用量
一叶萩碱
对照品
微量
硫酸
工业
5ml~100ml
阳离子交换树脂
磺酸型
60g
湿重
氨水
AR
15ml~20ml
三氯甲烷
5ml
乙醇
石油醚
150ml
30℃~60℃
氧化铝
中性
5g~10g
一叶萩
100g
五、思考题
1．离子交换树脂提取分离一叶萩生物碱的原理是什么？
2．离子交换树脂法提取纯化生物碱的程序及应该注意哪些问题？
3．用氨水碱化树脂的目的是什么？
4．设计用正交实验法选择最佳提取分离条件，包括酸水浓度、用量、渗漉速度、树脂用量等。
六、注意事项
1.装渗滚筒：
渗流筒底部，放一块脱脂棉（先用水湿润）然后将润湿过的药料分次加入，分层填压，顶部盖一张滤纸压上洁净的鹅卵石。
2.装树脂柱用蒸馏水将已处理好的树脂悬浮起来加到底部垫有脱脂棉的交换柱中，等树脂颗粒下沉后，其上覆盖一层棉花或一张滤纸，以免加入液体时，冲破树脂表面，注意在整个操作过程中树脂的上部是要覆盖少量液体，以免进入空气，影响交换效果，将树脂柱表层多余液体由底部活塞放出，待液层降至树脂层表面时，关闭活塞，由柱的上部加入含一叶萩碱的浸泡液，打开底部活夹。
控制流速
3.生物碱的定性试验
鉴定试剂不宜多，因多数试剂配制为乙醇液。
因生成的沉淀还可溶于乙醇，致实验效果不明显。
4.薄层鉴定
此过程要求学生注意选择合适的展开槽，喷显色剂时保持展开剂、板制备时要注意的操作原则；
同时对Al2O3软板与硅胶硬板的区别，分离化合物的原理都要讲解。
实验二芦丁的提取分离和鉴定
一、实验目的和要求
掌握：
碱提取－酸沉淀提取黄酮类化合物的基本原理和操作方法；
聚酰胺色谱的原理和操作方法；
黄酮类化合物常用的化学反应鉴别方法和现象。
熟悉：
苷类化合物的酸水解方法；
纸色谱和化学反应鉴别糖的原理和操作方法；
乙酰化物制备的常用试剂和基本操作。
难点：
影响黄酮类化合物在聚酰胺薄层上行为的主要因素。
实验要求
1．要获得三个化合物：
芦丁、槲皮素、芦丁的全乙酰化合物。
2．结合实验结果对芦丁及其衍生物在聚酰胺上的色谱行为进行分析。
3．能够根据实验及UV、NMR数据初步推断出芦丁的结构，并对黄酮类化合物结构测定有一定的认识。
芦丁（Rutin）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。
尤以槐花米（为植物Sophorajaponica的未开放花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。
芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）（为1分子的葡萄糖（Glucose）与1分子的鼠李糖（Rhamnose）以1-6连接组成的双糖）脱水而成的苷。
芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，熔点为174~178℃，无水物188~190℃。
溶解度：
冷水中约为1:
10000；
热水中约为1:
200；
冷乙醇中约为1:
650；
热乙醇中约为1:
60；
冷吡啶中约为1:
12。
微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、三氯甲烷、石油醚，溶于碱而呈黄色。
提取芦丁的方法有很多，目前我国多采用碱提取—酸沉淀的方法，其提取原理是：
因芦丁的结构中含有酚羟基，与碱成盐后溶于水中，向此盐溶液中加入酸，调节溶液至适当的pH值，则芦丁又重新游离析出，从而获得粗制芦丁。
除此方法之外，还可以采用沸水提取或醇提法。
芦丁具有维生素P样作用。
有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗剂，亦可用于防治因缺乏芦丁所致的其他出血症。
多作口服，亦可用作注射用。
槐花米粗粉（20g）
提取2次
第1次：
加水300ml，第2次加水150ml，用石灰乳调节pH值至8~9；
加热至微沸，维持pH值至30分钟；
趁热抽滤，
残渣（弃去）滤液合并
放置，冷至60~70℃，用浓HCl调至pH4~5,静置1小时，抽滤
滤液（弃去）沉淀（粗制芦丁）
重结晶
残渣（弃去）滤液
放冷、静置，过滤，
在60~70℃干燥
芦丁（精制品）
（三）操作步骤
1．芦丁的提取
称取槐花米20g，置于干燥的研钵中用钵棒挤压成粗粉备用，取1~1.5g的石灰粉（CaO）,置于干净的小研钵中，加入10ml水后研成乳液备用。
将粉碎的槐花米置于500ml烧杯中，加水300ml，在搅拌下加入上述制备的石灰乳，调节pH值至8~9，加热至微沸，维持pH值至30分钟，趁热抽滤。
弃去滤渣，冷至60℃~70℃，用浓HCl调至pH4~5,静置1小时，析出粗制芦丁，抽滤，弃去滤液，收集粗制芦丁。
将粗制芦丁悬浮于蒸馏水中，加热煮沸15分钟，然后趁热过滤，弃去不溶物，充分静置，过滤，收集芦丁结晶，在60℃~70℃干燥，得精品芦丁。
2．芦丁的定性鉴定
取芦丁3~4mg，加乙醇5~6ml使其溶解，分成三份作下述试验：
（1）盐酸－镁粉反应
取上述溶液1~2ml，加2滴浓盐酸，再加少许镁粉，注意观察颜色变化情况。
（2）ZrOCl2／柠檬酸反应
取上述溶液1~2ml，然后滴加2%ZrOCl2／甲醇溶液，注意观察颜色变化情况，再继续向试管中加入2%柠檬酸／甲醇溶液，并详细记录颜色变化情况。
（3）Molisch反应
取上述溶液1~2ml，然后再加入等体积的10%α-萘酚/乙醇溶液，摇匀，沿管壁滴加浓硫酸，注意观察两液面产生的颜色变化。
3．芦丁的NMR波谱解析
芦丁的（三甲基硅醚为内标）NMR谱的解析：
取干燥好的精品芦丁7～10mg，溶于0.5ml的DMSO-d6中，测定NMR谱图见图7－1和2，对其部分碳、氢信号归属如下：
1H-NMR（300MHzDMSO-d6）δ：
5-OH（12.61），7-OH（10.87），4′-OH（9.70），3′-OH（9.23），6-H（6.20），8-H（6.39），2′-H（7.53），5′-H（6.84），6′-H（7.55），Glc1″-H（5.33），Rham1'
"
-H（5.33），Rham6'
-CH3（0.99）
δ（3.0～5.0，糖上的其他质子信号）
13C-NMR（75MHzDMSO-d6）δ：
156.5（C-2）,133.4（C-3）,177.5（C-4）,156.7（C-5）,98.8（C-6）,164.2（C-7）,93.7（C-8）,161.3（C-9）,104.1（C-10）,121.7（C-1′）,115.3（C-2′）,144.8（C-3′）,148.5（C-4′）,116.3（C-5′）,121.3（C-6′）；
Glc101.3（C-1″）,74.1（C-2″）,76.5（C-3″）,70.5（C-4″）,76.0（C-5″）,67.1（C-6″）；
Rha100.8（C-1″′）,70.1（C-2″′）,70.6（C-3″′）,71.9（C-4″′）,68.3（C-5″′）,17.8（C-6″′）
4．芦丁的水解、乙酰化及糖与苷元的鉴定
（1）水解方法：
精密称取芦丁1g（±
0.01g），加1%硫酸100ml，加热40min，放冷静置，过滤。
所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，然后用乙醇（95%大约10ml）进行重结晶，即得苷元。
（2）糖的鉴定：
取上述水解母液10ml小心用Ba（OH）2（大约1－1.5g,并预先用10ml水调至成乳液）中和至中性，过滤出生成的BaSO4沉淀，滤液用热水浴小心浓缩至小体积1ml备用。
取1张圆形滤纸,用铅笔画出通过圆心的三条直线将滤纸等分为6份，对角点样法两次将样品、葡萄糖、鼠李糖标准品点于距圆心一定（>
0.5mm）处,并将用其它滤纸卷成的滤纸芯通过圆滤纸的圆心，借助滤纸芯的毛细作用用正丁醇-乙酸-水（4：
1：
5）上层溶液作径向展开。
显色剂：
邻苯二甲酸苯胺，喷洒后在105℃下加热数分钟，观察结果并记录。
（3）芦丁的乙酰化：
取芦丁100mg，置于干燥的50ml锥形瓶中，加8ml醋酐和2ml吡啶振摇使之完全溶解，接上空气冷凝管，水浴上加热三十分钟，放冷，在搅拌下将反应液倾入70ml冰水中一直搅拌至油滴消失为止，抽滤并洗涤沉淀，干燥后以95％乙醇重结晶，测得芦丁的乙酰化物。
（4）芦丁、乙酰化产物及苷元的聚酰胺薄层色谱
取聚酰胺薄层板，分别点上芦丁、乙酰化产物及苷元样品，同时以标准品（或已知对照品）芦丁、槲皮素作为对照，用75％乙醇液进行展开，待展开一定距离后，取出吹干，分别在日光、紫外灯下观察样品斑点的颜色与荧光，并记录，再将薄层板用氨蒸气薰一下，并观察颜色和荧光变化，再次用2％AlCl3对薄层板进行显色，观察样品斑点的颜色和荧光变化，将结果添入下表，并对比化合物颜色、紫外特征与结构的关系；
聚酰胺分离黄酮类化合物的原理和引起待分离组分Rf差异的原因等进行讨论。
NH3
2％AlCl3
日光
紫外
日光
芦丁
槲皮素
全乙酰化芦丁
1．芦丁粉碎的不可过细，以免过滤时速度过慢。
2．加入石灰乳即可达到碱溶解提取芦丁的目的，还可以除去槐花米中含有的大量多糖类粘液质，但pH值不能过高，否则钙能与芦丁形成螯合物而沉淀析出。
3．pH过低会使芦丁形成氧盐重新溶解，降低收率（最佳pH值为4）。
4．利用芦丁在冷热水中的溶解度差别来达到重结晶的目的。
得到的沉淀要粗称一下，按照芦丁在热水中约为1׃200的溶解度加蒸馏水进行重结晶。
也可以用冷、热乙醇进行重结晶、精制。
5．在样品溶液中加入2％ZrOCl2的甲醇溶液之后，如溶液呈黄色，示可能有C3-OH和或C5-OH。
如再加入2％柠檬酸甲醇溶液，黄色不褪，示有C3-OH；
如黄色褪去，加水稀释后转为无色，示无C3-OH，但有C5-OH（上述两种条件生成的锆络合物对酸的稳定性不同，其中C3-OH与4-羰基形成的络合物的稳定性大于C5-OH与4-羰基形成的络合物）。
（一）实验进度安排
本实验设计为18个学时，分3次完成
实验内容及全排顺序
1、提取分离2、芦丁的定性反应
1、苷的水解2、芦丁的精制3、糖的鉴定
1、芦丁的乙酰化2、三种产物的聚酰胺薄层色谱鉴别
3、芦丁的NMR光谱解析
（二）实验讲解要点
1．芦丁提取方法：
重点介绍碱－酸法的原理及注意事项。
2．定性实验的目的、意义及注意事项。
3．UV及NMR光谱在芦丁结构检识中的应用。
（三）预习要求和思考题
1．预习要求
（1）掌握碱－酸法提取芦丁的原理及注意事项。
（2）化学定性鉴别反应的机理。
（3）了解黄酮类化合物的UV与NMR波谱特点。
（4）乙酰化反应的实验方法及注意事项。
2．思考题
（1）苷类结构的检识大体程序如何？
（2）苷类水解有几种催化方法？
（3）怎样确定芦丁分子中只含有一分子葡萄糖及一分子鼠李糖？
（4）怎样确定芦丁结构中糖基是连接在槲皮素3－O－上？
（5）苷元的结构是怎样确定的？
（6）怎样确定苷键的构型？
（7）芦丁的全乙酰化物的制备过程中为什么要保证无水条件？
（四）实验报告的格式和要求
1．详细记录定性反应结果
2．绘制色谱结果模拟图及计算Rf值
3．分析UV与NMR谱图
4．光谱分析讨论实验结果（成功，失败原因）
（五）仪器、药品的规格和数量（－组计）
1．仪器的规格和数量（－组计）
说明
规格
说明
烧杯
500ml
另
配
水浴锅
滴管
50ml
分液漏斗
15~25ml
展开槽
布氏漏斗
中号
冷凝管
小号
试管
10~15ml
玻棒
2．药品的规格和数量（－组计）
药品
名称
规格
槐花米
20g
95％乙醇
分析纯
浓硫酸
镁粉
化学纯
少许
Ba（OH）2
1-1.5g
浓盐酸
CaO
1～1.5g
葡萄糖
标准品
少许
1％H2SO4
100ml
无水
吡啶
3ml
鼠李塘
醋酐
1-15ml
教案:
实验三大黄中蒽醌类化合物的提取、分离和鉴定
提示：
自行设计从大黄中提取蒽醌类成分的方法（提取方法以95%乙醇提取2小时，常规回收溶剂得浸膏，粗称）。
自行设计分离蒽醌类成分的方法以及鉴定方法（包括分离方法的选择，不同pH萃取溶剂、用量、萃取次数的选择，以及TLC的鉴定方法的吸附剂、展开剂的选择），本实验分离方法以制备薄层色谱为主，自行设计实验操作流程。
一、实验目的
回流提取的基本操作；
蒽醌类化合物的酸性理化性质；
制备薄层色谱的分离基本原理和操作；
薄层板的基本制作方法和TLC在结构鉴定中的应用。
了解：
蒽醌类化合物的其他制备方法、特点及应用。
要求：
1．设计用色谱法（制备薄层色谱）分离大黄蒽醌类化合物。
要求学生自己设计薄层制备分离方法所需的展开条件（洗脱剂，色谱方法等）。
2．要求每组至少得到3个单体化合物。
实验样品：
大黄药材50g
试剂：
常用有机溶剂，如三氯甲烷，石油醚（60-90）、乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸、10%KOH溶液、0.5%醋酸镁溶液。
仪器：
提取，分离用常规仪器。
时间安排：
要求在16学时内完成。
药典收载的正品大黄为蓼科植物掌叶大黄（RheumpalmatumL.）、唐古特大黄（R.tanguticumMaximexBalf）及药用大黄（R.offcinaleBaill）的根及根茎。
大黄始载于《本经》，列为下品。
历代本草均有记载。
大黄性寒、味苦、具泻热毒、破积滞、行淤血等功效。
多用于便秘、痢疾初起、血热吐血、淤血经闭等。
现代药理研究发现，大黄具泻下、抗菌、降血压、收缩血管、止血、降低雪光脆性的作用，而且对小鼠的和色素瘤、乳腺瘤及腹水型艾氏瘤有抑制作用。
大黄中的主要成分为蒽醌化合物，含量约为3%-5%，大部分与葡萄糖结合成苷，游离苷元有大黄酸、大黄素、芦荟大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等。
其中，大黄酸具有羟基，酸性最强；
大黄素具有β-酚羟基，酸性第二；
芦荟大黄素连有羟甲基，酸性第三；
大黄素甲醚及大黄酚的酸性最弱。
根据以上化合物的酸度差异，可用碱性强弱不同的溶液进行梯度萃取分离，但也可以借助制备型薄层进行分离。
大黄酸R1=HR2=COOH
大黄素R1=CH3R2=OH
芦荟大黄素R1=HR2=CH2OH
大黄素甲醚R1=CH3R2=OCH3
大黄酚R1=CH3R2=H
大黄中主要羟基蒽醌类化合物的理化性质：
（一）提取：
取药材（略加粉碎处理）至1000ml烧瓶中，加入200ml乙醇溶剂，回流提取2hr后，粗纱布过滤，取滤液回收溶剂得浸膏。
（二）制备薄层色谱
1.板的制备
分析、分离薄层板制备：
分析板：
载玻片小板30个；
制备板：
20×
20cm
硅胶加入2.5-3倍体积的0.5%CMC-Na溶液，用乳钵研磨，调成均匀的糊状，除去气泡，涂布到玻璃板上。
板上的吸附剂厚度一般为0.5-1mm。
一般在20cmX20cm的玻璃板上，可涂10-25g硅胶。
板铺好后，经室温干燥，可置烘箱活化。
活化条件根据需要各有不同。
一般采用105℃加热30分钟，然后，置干燥器中保存备用。
2.样品每块板一般可分离10-100mg的样品。
样品溶液浓度为5%-10%。
分离较大量的样品，可用多块薄层板分离。
3点样在离边缘1.5-2cm处用铅笔划一条线，沿线用毛细管或点样器点上样品溶液。
4.展开剂用TLC选择展开剂，用与TLC一致的溶剂系统作展开剂。
先将展开剂加到展开槽中使之饱和，然后放入薄层板，勿使样品带浸入溶剂中。
展开剂用量一般每块板35-50ml。
待溶剂完全展开后，取出板，放到通风厨中挥散至干。
展开条件结合预实验：
设计为石油醚—乙酸乙酯、氯仿—甲醇、氯仿—乙酸乙酯系统等，以石油醚—乙酸乙酯为优选。
（滴加适量冰醋酸）
5.色带位置的确定最后采用物理方法（如在紫外灯下观察荧光或暗斑；
如为酯溶性成分，喷水后，色带部分为白色）；
如果必须采用化学方法显色时，可将薄层板的大部分用另一板盖住，留出一条显色，将需要的相应部分做出标记。
6.样品的洗脱、合并对于硬板，按色带刮下带有样品的吸附剂，分别洗脱。
洗脱剂常用丙酮-甲醇（无水）或无水乙醇。
如用含水溶剂，可能会把铺板用的粘合剂洗脱下来。
7.合并洗脱、鉴定
将展开位置及显色相同的样品带刮去后，上小柱，以氯仿或无水乙醇洗脱，
（三）样品的鉴定
1.TLC鉴定纯度选择三种溶剂系统，使斑点Rf在0.3，0.5，0.7左右；
画示意图在报告册上。
2.定性鉴别反应，样品及提取液的Bo
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