基于纳米四氧化三铁壳聚糖石墨省略胆碱酯酶生物传感器检Word文件下载.docx
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该修饰电极的纳米复合膜结合了纳米四氧化三铁独特的吸附和生物相容性、壳聚糖优异的粘合性能以及石墨烯纳米材料大的比表面积和高的电子传递性能的优点,为乙酰胆碱酯酶提供一个良好的结合界面。
通过循环伏安法、交流阻抗谱和方波伏安法研究发现新型修饰电极的电化学性能得到较大提高。
在最优检测条件下,方波伏安法测定发现农药的抑制率与毒死蜱浓度在0.05µ
g/L~4.5µ
g/L范围内呈现良好的线性关系,线性相关系数0.997,最低检出限为0.02µ
g/L（S/N=3。
将该新型生物传感器用于检测蔬菜样品中毒死蜱的含量,表现出良好的稳定性和优异的检测精度。
关键词:
电化学有机磷农药;
生物传感器;
石墨烯;
纳米四氧化三铁
Asensitiveacetylcholinesterasebiosensorbasedon
nanocompositefilmofferroferricoxidenanoparticle,chitosanand
graphenefordetectionofchlorpyrifospesticide
WANGHui1,DUANYu-yao1,LIXiao1,CHENDong-fei2,LIUGang1
（1.KeyLaboratoryofModernPrecisionAgricultureSystemIntegrationResearch,MinistryofEducation,andKey
LaboratoryofAgriculturalInformationAcquisitionTechnology,MinistryofAgriculture,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China（2.SchoolofAgriculturalEngineeringandFoodScience,ShandongUniversityofTechnology,
Zibo255049,China
Abstract:
Anamperometricbiosensorfordeterminationofchlorpyrifospesticidewasdevelopedbasedonimmobilizationofacetylcholinesterase（AChEonferroferricoxidenanoparticle（Fe3O4,chitosan（Chitandgraphene（GRcompositemodifiedglassycarbonelectrode（GCE.DuetothestrongabsorbabilityandaffinityofFe3O4forthephosphoricgroup,theadhesivenessofchitosanandthelargespecificsurfaceareaandhighelectrontransferofgraphene,thesurfaceofnanocompositefilmprovidedafavorablemicroenvironmentforacetylcholinesterasebiosensorfabricationandmaintainedthebioactivityofAChEforscreeningofchlorpyrifospesticideexposure.Differentelectrochemicalmethods,suchascyclicvohammetry,impedancespectroscopyandsquarewavevoltammetry,wereusedtoinvestigatetheelectrochemicalbehaviorsonNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCEE,indicatingthatgreatlyimprovedtheelectrochemicalperformanceanddetectionresponse.Underoptimumconditions,theinhibitionratesofthesepesticideswereproportionaltotheirconcentrationsintherangefrom0.05µ
g/Lto4.5µ
g/Lwiththecoefficientsof0.997andthedetectionlimitswerefoundtobe0.02µ
g/L（S/N=3.Finally,thisproposedbiosensorwassuitablefortracedetectionofchlorpyrifospesticideresidue,whichexhibitedexcellentreproducibilityandaccuracy.
Keywords:
Electrochemistry;
organophosphoruspesticide;
biosensor;
Graphene;
ferroferricoxide;
农药的使用消灭和控制了危害农业林业的病虫草及其他有害生物,同时也严重危害人类的健康和生存环境[1]。
据报道我国农药有效利用率利为30%,约70%残留在环境中,造成严重的环境污染[2]。
大量散失的农药挥发到空气中,流入水体中,沉降聚集在土壤中,严重污染农、畜、渔、果产品,并通过食物链的富集作用转移到人体,间接对人体产生危害[3,4]。
有机磷农药检测的方法主要有气相色谱法（GC[5]、气相色谱-质谱法（GC-MS[6]、液相色谱法（HPLC[7]、液相色谱-质谱法（LC-MS[8]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS[9]、生物传感技术检测[10,11];
其中生物传感技术中的酶抑制法相比其它方法,具有检测设备体积小、价格低廉、耗时短、易操作、准确度高等优点。
因此,研究开发稳定性好、灵敏度高和抗干扰能力强的有机磷农药检测传感器具有重要的意义。
石墨烯[12]是一种由碳原子构成的二维纳米材料,理论厚度仅为一个碳原子的厚度;
具有大的比表面积、高的导电性和室温电子迁移率,以及优异的机械力学性能;
同时还具有电化学窗口宽,电化学稳定性好,电荷传递电阻小,电催化活性高和电子转移速率快等电化学特性,被广泛的应用在检测传感器上[13,14]。
纳米四氧化三铁[15,16]表面光滑性差,形成了凹凸不平的原子台阶,增加了化学反应的接触面;
另外,良好的导电性、高度均匀性、优异的生物相容性且无毒副作用等特点,在生物传感器中常被用作支持基质来固定酶,能够促进酶的直接电子转移,增强电催化反应活性。
本研究基于毒死蜱农药对乙酰胆碱酯酶活性的抑制原理,采用纳米四氧化三铁/壳聚糖/石墨烯纳米复合膜修饰的电流型生物传感器。
该电极结合了纳米四氧化三铁、石墨烯纳米及壳聚糖优良的性能,具有高的检测精度和良好的稳定性,为检测蔬菜样品中毒死蜱的含量提供了一种新方法。
1材料与方法
1.1仪器和试剂
CHI-660D电化学工作站及配套的软件（上海辰华仪器有限公司;
BSA224S电子天平（赛多利斯科学仪器有限公司;
HLH-1红外灯（重庆华伦弘力实业有限公司;
KQ5200超声清洗仪（昆山舒美超声仪器有限公司;
PHSJ-3F型酸度计（上海雷磁仪器;
Direct-Q8超纯水机（美国Millipore公司;
离心机（精骐公司;
工作电极为修饰后的玻碳电极（d=3mm,参比电极为SCE电极（饱和KCI溶液、对电极为铂电极（天津艾达恒晟科技发展有限公司。
石墨烯纳米材料（南京先丰纳米材料科技有限公司;
乙酰胆碱酯酶（TypeC3389,500U/mg提取于电鳗、氯化硫代乙酰胆碱（ATC1、解磷定、毒死蜱、壳聚糖和Nafion均购买于美国Sigma公司;
纳米四氧化三铁（可莱纳米新材料有限公司;
环己酮、丙酮、二甲基甲酰胺（北京化工厂;
0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲溶液（PBS由NaH2PO4和Na2HPO4原液混合制备。
实验用到的试剂为分析纯,水为高纯水。
1.2电极的制备
将玻碳电极依次用0.3µ
m和0.05µ
m的Al2O3悬浊液的麂皮纸上打磨抛光至镜面,后用乙醇和超纯水超声清洗,并在氮气环境下吹干;
将清洗后的玻碳电极放入0.5mol/L的H2SO4溶液中用循环伏安法扫描活化（电压范围为-0.6V到1.0V,得到稳定的CV图后停止;
取0.2g/L的石墨烯溶液2.0µ
L,滴涂到活化后电极表面,红外烤灯下干燥;
之后取2.0g/L的Fe3O4与壳聚糖混合悬浊液4.0µ
l,滴涂到电极表面并在50℃环境中干燥;
给修饰好的Chit-Fe3O4/GR/GCE电极表面修饰7.0µ
L的AChE（0.1U溶液,在4℃环境中晾干;
最后,修饰2.0µ
L浓度为0.2%Nafion溶液。
将得到的NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE用pH7.0的磷酸缓冲液清洗后存在4℃干燥环境中。
1.3抑制率计算
农药对酶的抑制率（I%,计算公式如下:
I%=（I1-I2/I1×
100%
其中,I1和I2分别为农药抑制前后NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极在含有0.5mmol/LATCl的磷酸缓冲液（pH7.0中响应电流大小。
1.4样品前处理
将市场购买的蔬菜（白菜,菠菜用高纯水冲洗多次后晾干;
将不同浓度毒死蜱农药均匀地喷洒在蔬菜上,放置一段时间后,分别称取10.0g外层叶片将其打成汁,并加入20.0mL的丙酮和0.1mol/LpH7.0磷酸盐缓冲溶液混合物（l/9,v/v超声处理30min,然后用离心机将悬浊液离心,取上层清液用于检测。
1.5实验方法
将三电极系统分别插入5.0mmol/LK4[Fe（CN6]+0.1mol/LKCl溶液和含有0.5mmol/LATC1的PBS溶液中,用循环伏安法（CV和阻抗谱（EIS研究修饰电极的电化学性能;
方波伏安法（SWV用于优化电极的检测参数和检测有机磷农药的含量。
检测农药含量时,NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE浸泡在被测样品中10min,后用pH7.0的PBS溶液冲洗电极表面;
将检测后的修饰电极放入5.0mmol/L解磷定溶液中15min恢复酶活性。
2结果与讨论
2.1电极表征
图1不同电极在5.0mmol/LK4[Fe（CN6]+0.1mol/LKCl溶液中的循环伏安响应,扫描速率50mV/s,（aGCE,（bGR/GCE,（cChit-Fe3O4/GCE,（dChit-Fe3O4/GR/GCE,（eNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE
Fig.1Cyclicvoltammetricresponseofdifferentelectrodesin5.0mmol/LK4[Fe（CN6]+0.1mol/LKClsolutionwithscanrate50mV/s,
（aGCE,（bGR/GCE,（cChit-Fe3O4/GCE,（dChit-Fe3O4/GR/GCE,（eNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE
用循环伏安法研究修饰电极在5.0mmol/LK4[Fe（CN6]和0.1mol/LKCl的溶液中电化学特性。
图1中可以看出,未修饰的GCE（图1-a在K4[Fe（CN6]溶液峰电流约为38µ
A,氧化峰电位与还原峰峰电位差（ΔE为108mV;
在玻碳电极表面修饰石墨烯纳米材料GR/GCE（图1-b,电极的氧化还原峰电流略有增大、峰电位差ΔE也略有减小,由于石墨烯纳米材料优异的物理性能增大电极的比表面积和提升了导电性;
Chit-Fe3O4/GCE（图1-c的氧化还原峰电流比未修饰的GCE有显著的提升,说明纳米四氧化三铁材料良好的导电性和宏观隧道效应,增加了化学反应的接触面;
石墨烯和纳米四氧化三铁复合膜修饰电极Chit-Fe3O4/GR/GCE（图1-d,具有强的氧化还原峰电流信号和较小的氧化还原峰电位差,这说明Chit-Fe3O4/GR复合膜有效的结合了石墨烯纳米材料与纳米四氧化三铁优良的性能,具备良好的电子传递速率和活性位点,使电极表面的电子传导性以及电化学反应的可逆性均得到了一定程度的提高;
NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE（图1-e,由于NF-AChE膜导电性能差,阻碍了电子在修饰电极表面的传输,降低了电极的导电性能。
图2不同电极在5.0mmol/LK4[Fe（CN6]+0.1mol/LKCl溶液中的交流阻抗谱（频率范围为0.1-106Hz,（aGCE,（bGR/GCE,
（cChit-Fe3O4/GCE,（dChit-Fe3O4/GR/GCE,（eNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE
Fig.2Electrochemicalimpedancespectraofdifferentelectrodesin5.0mmol/LK4[Fe（CN6]+0.1mol/LKClsolutionwiththefrequenciesfrom1to106Hz,（aGCE,（bGR/GCE,（cChit-Fe3O4/GCE,（dChit-Fe3O4/GR/GCE,（eNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE采用交流阻抗谱进一步研究修饰电极表面电化学反应的动力信息,如图2所示。
玻碳电极的阻抗约为80Ω（曲线a,相比之下修饰石墨烯纳米材料GR/GCE（曲线b和纳米四氧化三铁Chit-Fe3O4/GCE（曲线c电极的阻抗小一些,分别约为60Ω、75Ω,主要由于纳米表面与界面效应、量子尺寸效应和优良的导电性能提高了电极的导电性;
而Chit-Fe3O4/GR/GCE（曲线d阻抗谱中的高频谱图的半圆弧半径明显减小约为50Ω,这说明纳米四氧化三铁与石墨烯形成了一种新的复合膜,该复合膜具有良好的电化学稳定性、高的电子传导率以及快的电化学反应速率,降低了表面双电层厚度和加快了修饰电极表面的电子转移速率,使[Fe（CN6]3-/4-氧化还原电子对非常容易到达电极表面,发生氧化还原反应;
由于酶是大分子蛋白质不导电,AChE成功的修饰到Chit-Fe3O4/GR/GCE电极上,修饰电极的电阻增大,约为100Ω。
2.2对比
图3（aGCE和（bNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE在pH7.0PBS溶液中的循环伏安响应;
（c
Chit-Fe3O4/GR/GCE,（dNF-AChE/GCE和（eNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE在含0.5
mmol/LATCl的pH7.0PBS溶液的循环伏安响应,扫描速率50mV/s。
Fig.3CyclicvoltammetricresponseinpH7.0PBSbuffersolutionat（aGCEand（bNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE;
Cyclicvoltammetricresponseof0.5mmol/LATClinpH7.0PBSbuffersolutionat（cChit-Fe3O4/GR/GCE,（dNF-AChE/GCEand（e
NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCEatscanrateof50mV/s,
研究不同修饰电极对ATCl底物的电化学响应,如图3所示。
当PBS缓冲液中未加入ATCl底物时,GCE（图3-a和NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE（图3-b的循环伏安曲线都没有出现明显的氧化峰;
当在PBS缓冲液中加入0.5mmol/LATC1底物后,NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE对缓冲液中的底物ATCl有明显的响应（图3-e,其循环伏安曲线在660mV出有明显的不可逆氧化峰,其氧化峰电流约为15µ
A,而Chit-Fe3O4/GR/GCE循环伏安曲线并没有观察到明显的氧化峰（图3-c,说明检测到的氧化峰电流是由于AChE催化溶液中ATCl水解产生电活性物质硫代胆碱,其氧化而形成的。
没有修饰纳米四氧化三铁与石墨烯复合膜的电极NF-AChE/GCE（图3-d的氧化峰值明显小于修饰纳米四氧化三铁与石墨烯复合膜的NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE,说明纳米四氧化三铁与石墨烯复合膜提高了酶与电极表面的电子转移速率。
有机磷农药可以抑制NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极表面AChE的活性,降低了电极催化氯代乙酰胆碱水解的能力,进而影响电极检测到胆碱的含量。
因此,NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极可用于有机磷农药含量的检测。
2.3扫描速度
图4（A不同扫描速率下NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极在0.5mmol/LATCl溶液中的循环伏安图,从扫描速率依次为10,40,80,120,160,200,240,280,320,360和400mV/s;
（B扫描速率与峰电流（Ip的线性关系;
Fig.4（ACyclicvoltammogramsof0.5mmol/LATClrutinwithdifferentscanrateonNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE,fromatokare10,40,80,120,160,200,240,280,320,360and400mV/srespectively;
（BLinearrelationshipofpeakcurrent（Ipversusv1/2;
研究扫描速率变化对修饰电极的电化学响应的影响,如图4所示。
由图4-A可知,随着扫描速率逐渐增加,在NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE上的响应峰电位与峰电流随着扫描速率的增大而增大,其中氧化峰电流与v1/2呈现良好的线性关系（图4-B,线性回归方程为Ipa（µ
A=-30.07v1/2（V/s+0.724（r=0.995,这说明修饰电极在10~400mV/s范围内的反应是扩散控制过程。
2.4实验条件优化
图5pH与NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE的响应峰电流关系
Fig.5TherelationshipbetweenpHandpeakcurrentofNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE研究pH的变化对修饰电极AChE活性的影响,用NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极检测不同pH下缓冲溶液中0.5mmol/LATC1,响应结果如图5所示。
由于AChE是具有生物活性的大分子蛋白质,pH的变化能会使其活性发生不可逆的丧失;
当pH值为7.0时,检测峰电流的响应值达到最大,说明在中性的环境中AChE的活性最强,修饰电极表面活性离子基团性能最佳;
当PBS缓冲液pH过高或者过低时,会改变这些离子基团,进而改变
活性位点的生物活性,使酶的催化性能降低。
因此,检测缓冲液的最优pH值为7.0。
图5抑制时间与NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE的抑制率关系
Fig.5TherelationshipbetweeninhibitiontimeandinhibitionrateofNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE
研究酶抑制时间对NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE电极响应性能的影响。
将修饰电极浸入到10µ
g/L的毒死蜱溶液中分别抑制2、4、6、8、10、12、14、16、18、20min,然后将抑制后的电极放入含有0.5mmol/LATC1的PBS溶液中进行检测,记录对应的响应峰电流值,最后计算抑制率与抑制时间的关系,结果如图5所示。
由二者的关系图可知,在0-10min内,随着抑制时间的增加,抑制率逐渐增加;
当抑制时间超过10min后抑制率趋于平
缓,表明农药抑制酶活性趋于饱和。
因此,选择10min为NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE的最佳抑制时间。
图6酶负载量与NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE的响应峰电流关系
Fig.6TherelationshipbetweenenzymeloadingandpeakcurrentofNF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE研究电极表面AChE负载量与响应峰电流之间的关系。
如图6所示,发现随着电极表面修饰AChE负载量的逐渐增大,电极检测峰电流会先增大后减小。
这主要因为随着电极表面酶负载量增加,催化ATC1产生的硫代胆碱的量增加,电极检测到的响应峰电流也逐渐变大;
另外,电极表面酶膜的厚度会随着AChE负载量的增加而逐渐增厚,这样会阻碍底物水解产生的硫代胆碱到电极的扩散,造成电极检测峰电流会逐渐减小。
因此,选择0.7U作为酶的最佳负载量。
2.5线性关系
图7（A不同浓度毒死蜱农药抑制NF-AChE/Chit-Fe3O4/GR/GCE后上的方波伏安曲线（从a到k浓度依次为0,0.05,0.5,1.0,
1.5,
2.0,2.5,
3.0,3.5,
4.0,和4.5µ
g/L;
（B线性回归曲线
Fig.7（ASquarewavevoltammetryofvariousconcentrationsrutinonIL/GR/GCE（fromatok:
0,0.05,0.5,1.0,1.5,2.0,
2.5,
g/L;
（BLinear
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