蔗糖酯类阳离子类脂中间体合成研究1ⅴ 论文大学论文Word文档格式.docx
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摘要I
AbstractII
目录III
1.绪论1
1.1课题的目的和意义1
1.2国内外文献综述2
1.3本文的主要研究内容2
1.4实验研究内容3
2合成路线设计4
2.1初步设计卤化反应的合成路线4
2.1.1初步设计以DMF为溶剂的C-6位羟基选择性卤化反应4
2.1.2初步设计吹HCL法的C-6位羟基选择性卤化反应4
2.2初步设计合成实验原理及步骤5
2.2.1初步设计合成实验原理5
2.3初步设计试验步骤6
2.3.1C-6羟基保护（蔗糖-6-乙酸酯的合成）6
2.3.2蔗糖-6-乙酸酯的选择性氧化6
2.3.3羧酸酯化7
2.3.4酯基去保护7
2.3.5卤化7
3实验部分8
3.1实验试剂与仪器8
3.1.1实验试剂8
3.1.2实验仪器9
3.2原料的制备10
3.2.1C-6羟基保护（蔗糖-6-乙酸酯的合成）的探索10
3.2.21＇，6＇位羟基氧化的探索10
3.2.3.羧酸酯化酯基去保护的探索13
3.2.4酯基去保护14
3.3卤化反应的探索15
3.4实验探索结果17
3.4.1总体合成路线17
3.4.2试验步骤18
3.4.3合成工艺流程18
3.4.4实验装置图21
4实验结果与讨论22
4.1产品结构分析与确证22
4.1.1碘化物结构解析22
4.2单因素试验24
4.3正交试验探索24
4.3.1正交试验设计24
4.3.2正交试验过程25
4.3.3最佳条件的选择25
结论28
参考文献29
致谢30
1.绪论
1.1课题的目的和意义
随着生物化学与分子生物理论的不断发展，基因治疗已成为医学界最活跃的研究领域之一。
基因治疗载体在基因治疗过程中起一个转运和保护的作用，是基因治疗成功与否的关键。
因此，基因治疗载体的开发对基因治疗的发展尤为重要，其有效开发将推动基因治疗向常规治疗方法的转变[1]。
目前，用于临床的基因载体大致分为病毒载体和非病毒载体两类它们都具有各自鲜明的优缺点，在临床治疗上亟需改进。
脂质体在所有已用于临床试验的基因载体中仅次于病毒载体，居第二位，是最有发展前景的非病毒载体。
其中，阳离子脂质体由于具有对阴离子型聚电解志敏感，对待负电荷的DNA有较高的转运能力，还能转运RNA、核糖体及其他大电荷的分子和大分子物质进入细胞等优点，其转染效率比其他脂质体高出许多倍，因而被广泛应用于基因转移技术中[2]。
阳离子类脂在作为基因载体和药物传递等方面的应用越来越受到人们的关注。
人们己研制出多种直接传递生物活性剂到活细胞内的方法。
其中包括被称作“载体法”的方法，此方法包括使用载体促进生物活性剂胞内传递到特定靶细胞如疾病细胞内。
人们已研制出多种用于转染生物活性剂的载体。
例如，脂质体和聚合物已被用于转染遗传物质，包括脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）[3]。
然而，目前可用的载体（包括脂质体和聚合物）对于生物活性物质在体内的胞内传递一般是无效的。
此外，目前可用载体在体外细胞转染方面的应用也是有限的。
然而，目前能得到的阳离子类脂和阳离子脂质体对生物活性剂的体内胞内传递一般是无效的。
此外，它们对于生物活性剂在血清内的胞内传递一般也是无效的。
因为细胞需要血清来生存，所以这是一种严重缺陷。
实质上，在包含阳离子类脂和阳离子脂质体的基因转染研究过程中，通常需要从组织培养浴中移去血清。
转染后，补充血清。
这样必须包括附加操作步骤，从而使得阳离子类脂和阳离子脂质体感染细胞变得复杂和麻烦。
特别需要新的或更好的阳离子类脂用于胞内传递生物活性剂[4]。
在如何获得阳离子类脂方面，人们提出了许多合成方案，但还不甚完善，需要进一步探讨和研究。
本课题就是以蔗糖为原料通过酯化选择性氧化再酯化，酯交换，卤化等步骤来合成蔗糖酯类阳离子类脂的，本课题的目的就在于此。
近年来，人们研制开发了阳离子类脂，如N,Nˊ-二（十二烷基氨基羰基亚甲基）-N,N’-二（β-N,N-二甲基氨基乙基氨基碳基亚甲基）亚环己基-1,4-二胺（CDTA-LA-DMA）和N,Nˊ-二（十二烷氧基碳基亚甲基）-N,Nˊ-二（β-N,N,N-三甲基铵甲基氨基羰基亚甲基）乙二胺二碘化物。
目前国外已经有公司申请了相关的专利，并且就有关的阳离子类脂的合成给出了相应的方法，所以在前人的工作基础上我们能相应的完成蔗糖酯类阳离子类脂的合成[5]。
就阳离子类脂的合成目前国内外的研究现状，还不能得到较高的产率，而且原料也不太容易获得，而本课题采用蔗糖为原料来合成蔗糖酯类阳离子类脂，不仅原料易得而且也能获得一个较好的收率。
目前的生物活性剂体内转染细胞的方法一般是无效的，这样阻碍了对治疗各种疾病的改进方法的研究和使用。
细胞膜为选择性屏障，它能阻止物质随机进人细胞内。
因此，胞内传递生物活性剂过程中最主要的困难被认为是如何将活性剂从胞外区转移到胞内区，同样也难以将生物活性剂定位于选定细胞膜的表面[6]。
因此阳离子类脂在作为基因载体在基因治疗方面必将具有广阔的应用前景。
因此探索一种合成简单，无污染或少污染的新的阳离子类脂有着重要意义。
1.2国内外文献综述
基因治疗是现代癌症治疗的热点，并且正在逐步变成现实。
基因治疗的主要目的是成功的将遗传物质传递到目标组织、器官或者细胞。
然而裸露的治疗基因容易被核酸酶降解，表现出很差的细胞摄取效率。
因此制备安全高效的基因载体就成为成功的基因治疗的一个必要条件。
病毒载体可以有效的转染遗传物质进入宿主细胞，但它们有很多不足，比如容易致突变，可能诱导免疫应答从而使得基因表达消失。
因此人们越来越多的吧目光投向了非病毒载体。
非病毒载体中的载体有一系列工艺优势，比如制备简单，储存稳定，耐热压灭菌和冷冻干燥等等。
阳离子载体由于可以静电吸附基因，构成稳定的基因复合物而日益得到广泛的研究。
目前的研究主要集中在体外实验，毒性仍然是这类载体应用于基因治疗的主要障碍，而载体的毒性主要取决于制备过程中使用的阳离子类脂[7]。
阳离子类脂作为一种表面活性剂，由于其具有较好的生物活性所以其在基因治疗方面得到广泛的应用1987年，Felgner和同事首次报道利用天然二醚联阳离子脂质（DOTMA）作为人类基因载体进入细胞进行基因治疗。
自那时以来，一些出版的报纸对用于基因传递的阳离子脂质体的合成方案进行了报道，引起了社会的广泛关注。
近年来国内外不断有新的阳离子类脂的合成获得成功，并取得相应的专利[8]。
目前，合成阳离子类脂的方法有很多，这主要是采用的原料不同从而得到的阳离子类脂的骨架不同的原因。
近年来应用较多的是卤化法获得阳离子类脂。
而蔗糖酯类阳离子类脂的合成目前国内还没有相关的报道，本课题应用蔗糖为原料进行蔗糖酯类阳离子类脂的合成，要经过蔗糖三羧酸酯中间体的合成，然后再进行酯交换卤化等步骤[9]。
1.3本文的主要研究内容
以蔗糖为原料酯化，得到蔗糖-6-乙酸酯，蔗糖-6-乙酸酯再经过选择性氧化，再酯化得到蔗糖三羧酸酯，再经6位羟基去保护生成1ˊ,6ˊ-蔗糖二酯再经过6位羟基卤化得到目的产物蔗糖酯类阳离子类脂。
本文以1’,6’-蔗糖二酯卤化得到目的产物作为重点讨论部分，通过单因素实验和正交试验对实验条件进行优化，确定最佳工艺条件。
1.4实验研究内容
1、探索蔗糖酯类阳离子类脂中间体（卤化）的合成研究（合成路线的设计、选择、产品的提纯）；
2、研究产物结构确证方法；
3、研究各因素对蔗糖酯类阳离子类脂的中间体卤化的影响，设计单因素实验和正交试验；
4、确认目标产物的收率为指标确定最佳条件C-6羟基保护（蔗糖-6-乙酸酯的合成）的探索；
2合成路线设计
2.1初步设计卤化反应的合成路线
通过中外文献的检索为发现相关蔗糖酯类阳离子类脂卤化反应的文献，再结合中外文献的基础上采用模拟推断法自行设计了两种方案如下：
2.1.1初步设计以DMF为溶剂的C-6位羟基选择性卤化反应
酯化物（5.45mmol）的DMF（60mL）溶液中加入三苯基膦PH3P（6.04g,23mmol）以及咪唑（3.18g,46.7mmol）和碘I2（5.4g,2.14mmol）,混合物加热至80℃反应1.5h,产物视性质纯化处理。
2.1.2初步设计吹HCL法的C-6位羟基选择性卤化反应
酯化物（0.01mol）与三甲基氯硅烷TMSCl（0.02mol，2.2g）混合液中加如DMSO（0.0026mol,0.2g）,反应用HCl吹扫1分钟，继续搅拌反应10分钟，产物视性质纯化处理。
2.2初步设计合成实验原理及步骤
2.2.1初步设计合成实验原理
以蔗糖为原料酯化，得到蔗糖-6-乙酸酯，蔗糖-6-乙酸酯再经过选择性氧化，再酯化得到蔗糖三羧酸酯，再经6位羟基去保护生成1’,6’-蔗糖二酯再经过6位羟基卤化得到目标产物蔗糖酯类阳离子类脂，其合成过程如下所示。
1蔗糖-6-乙酸酯的合成
2蔗糖-6-乙酸酯的选择性氧化
3羧酸酯化
4羟基去保护
5卤化
2.3初步设计试验步骤
2.3.1C-6羟基保护（蔗糖-6-乙酸酯的合成）
干燥蔗糖（12.5g,0.0365mol，真空干燥箱中60℃干燥24h）于三颈烧瓶中，加50mLDMF,缓慢滴加原乙酸三甲酯（5.25mL,0.04mol）及对甲苯磺酸（75mg,0.435mmol）溶液，剧烈搅拌，室温下反应150min，溶液无色透明，加蒸馏水（5mL），继续搅拌反应30min，加特丁胺（1.25mL,0.048mol），继续搅拌反应70min，pH值约为9，中和，过滤，滤液用旋转蒸发仪将DMF蒸出，结晶得到白色晶体蔗糖-6-乙酸酯（A）。
2.3.2蔗糖-6-乙酸酯的选择性氧化
方案一：
取前一步骤产物0.608g（2mmol），TEMPO0.008g（0.052mmol）以及NaBr0.160g（1.56mmol）溶于25mL冷水中成溶液，21%次氯酸钠溶液2.43mL加至上溶液中，用冰水浴控制反应温度控制在5±
2℃，每隔30min用酸度计测量反应溶液的pH值，并用0.5M的氢氧化钠控制pH在10反应之间为10小时（为避免酯水解反应时间应尽量短）。
反应结束后，保持pH值在4左右，滤去反应液中的不溶物，待产物（B）析出。
方案二：
2℃，反应在40kHz的超声波冰水浴中进行。
每隔20min用酸度计测量反应溶液的pH值，并用0.5M的氢氧化钠控制pH在10.5反应之间为6小时（为避免酯水解反应时间应尽量短）。
2.3.3羧酸酯化
在装有温度计，回流冷凝管，搅拌器的250mL三口烧瓶中加入甲苯12mL，对甲苯磺酸0.06g，月桂醇0465g和对苯二酚0.04g，加热到60℃使其全部溶解，再加入上一步产物B，升温至设定反应温度120℃，反应时间为4h，待产物析出。
2.34酯基去保护
C中加入甲醇20mL，甲醇钠0.1g，在70℃水浴条件下反应，得到酯去羟基保护产物（D）。
2.3.5卤化
在物质C（1.82mmol）的DMF（20mL）溶液中加入三苯基膦PH3P（2.01g,7.67mmol）以及咪唑（1.06g,46.7mmol）和碘I2（1.8g,0.71mmol）,混合物水浴加热至80℃并搅拌，反应时间为1.5h,经处理得产物（E），产物视性质纯化处理。
3实验部分
3.1实验试剂与仪器
3.1.1实验试剂
本实验所使用的原料如表1所示。
表1化学试剂名称及规格
序号
试剂名称
规格
生产厂家
1
蔗糖
分析纯
天津市恒兴化学试剂制造有限公司
2
原乙酸三甲酯
安徽安特生物化学有限公司
3
叔丁胺
天津市褔晨化学试剂厂
4
对甲苯磺酸
天津市光复精细化工研究所
5
甲醇
天津市北方天医化学试剂厂
6
盐酸
7
N,N-二甲基甲酰胺
天津市天河化学试剂厂
8
甲苯
东陵区精细化学厂
9
2,2,4,6-四甲基哌啶氧化物（TEMPO）
天津市大茂化学试剂厂
10
溴化钠
11
次氯酸钠
12
月桂醇
13
对苯二酚
14
三苯基膦（PH3P）
国药集团化学试剂有限公司
15
咪唑
天津市瑞金特化学品有限公司
16
碘
天津市永大化学试剂研发中心
17
三甲胺
18
甲醇钠
19
冰醋酸
20
氯仿
21
石油醚
3.1.2实验仪器
本次实验所用的仪器设备如表2所示。
表2实验仪器与设备一览表
名称
生产厂家型号
恒温水浴锅
上海申生科技有限公司W5-100SP
电热鼓风干燥箱
上海一恒科技有限公司BPG-9070A
循环水式真空泵
河南省巩义市英峪仪器一厂SHZ-D
定时电动搅拌器
山东鄄城华鲁有限公司S7401
电子分析天平
上海精密科学股份有限公司FA2004
旋转蒸发仪
上海亚荣生化仪器厂RE5299
托盘药物天平
北京医用天平厂制造
微机熔点仪
上海精密科学仪器有限公司WRS-2A/2
澳柯玛双温转换冷柜
青岛澳柯玛股份有限公司BD\C-191
圆底烧瓶
北京市光明医疗仪器厂250mL
三口烧瓶
北京市光明医疗仪器厂500mL
量筒
北京市光明医疗仪器厂200mL
分液漏斗
北京市光明医疗仪器厂
滴液漏斗
烧杯
北京市光明医疗仪器厂100mL
布氏漏斗
锥形瓶
3.2原料的制备
3.2.1C-6羟基保护（蔗糖-6-乙酸酯的合成）的探索
干燥蔗糖（50g,0.146mol，真空干燥箱中60℃干燥24小时）于三颈烧瓶中，加200mLDMF,缓慢滴加原乙酸三甲酯（21mL,0.19mol）及对甲苯磺酸（300mg,1.74mol）溶液，剧烈搅拌，室温下反应150min,溶液无色透明，加蒸馏水（20mL）,继续搅拌反应30min,加特丁胺（5mL,0.048mol）,继续搅拌反应70min,pH值约为9，中和、过滤，滤液用甲苯共蒸发法将DMF蒸出，残留物结晶得到白色晶体A。
图1化合物B1的TLC图
通过质谱和核磁，外加用标准品（来源于大连民族学院）通过TLC板比对，确认产品A为蔗糖-6-乙酸酯
总结：
试验结果与原设定步骤符合。
3.2.21＇，6＇位羟基氧化的探索
1、蔗糖-6-乙酸酯1.412g，TEMPO0.0113g，NaBr0.3423g溶于40mL蒸馏水中。
量取10mLNaOCl调pH为10。
0℃冰水浴并搅拌进行超声。
在此期间用0.5MNaOH调节pH维持在10。
反应10h（反应液开始为浅黄色逐渐变为无色）最终得浅黄色液体略带残渣过滤得澄清液体。
用4MHCL调节pH为4。
30℃挥去溶液中水分，加入30mL甲醇重结晶，得白色晶体，即为化合物B1。
以丙酮：
甲醇（1：
4）为展开剂,用薄层色谱法进行跟踪试验B1的极性大于A，、并用质谱与核磁确定其结果，经谱图解析，确认产品B1为二羧酸，溶于水微溶于甲醇。
图2化合物B1的TLC图
2、对超声应用的必要性的研究
糖-6-乙酸酯3.4437g，TEMPO0.0616g，NaBr1.4930g溶于50mL蒸馏水中。
0℃冰水浴并搅拌。
在此期间用0.5MNaOH调节PH维持在10。
30℃挥去溶液中水分，加入30mL甲醇重结晶，得白色晶体，即为化合物B2。
4）为展开剂，用薄层色谱法进行鉴定，结果如下图所示，确认产品B2为被氧化物且与B1为同一物质，溶于水微溶于甲醇。
图3化合物B2的TLC图
3、对温度对试验影响的研究
蔗糖-6-乙酸酯1.9334g，TEMPO0.0330g，NaBr0.7423g溶于40mL蒸馏水中。
常温反应并搅拌。
反应8h（反应液开始为浅黄色逐渐变为无色）最终得浅黄色液体略带残渣过滤得澄清液体。
30℃挥去溶液中水分，加入30mL甲醇重结晶，得白色晶体，即为化合物B3。
4）为展开剂，用薄层色谱法进行鉴定，结果如下图所示，确认产品B3不是要合成的目的产物。
图4化合物B3的TLC图
4、加大NaOCl用量，称取蔗糖-6-乙酸酯4.0015g，TEMPO0.0700g，NaBr1.3200g溶于40mL蒸馏水中。
量取28mLNaOCl调pH为10。
30℃挥去溶液中水分，加入30mL甲醇重结晶，得白色晶体，即为化合物B4。
4）为展开剂，用薄层色谱法进行鉴定，结果如下图所示，确认产品B4比B1和B2的氧化程度高，溶于水微溶于甲醇。
图5化合物B4的TLC图
5、极端加大NaOCl的用量，称取蔗糖-6-乙酸酯2.0155g，TEMPO0.07375g，NaBr0.6693g溶于40mL蒸馏水中。
量取60mLNaOCl调pH为10。
用4MHCL调节pH为4，30℃挥去溶液中水分，加入30mL甲醇重结晶，得白色晶体，即为化合物B5。
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