动物实验计划书Word文档下载推荐.docx

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革兰氏染色：

巴氏杆菌致死的小鼠，肝脏或脾脏触片，或心血涂片，革兰氏染色阴性

分离培养鉴定：

增菌培养：

血清肉汤培养基：

在血清肉汤中培养，开始轻度浑浊，4-6d后液体变清朗，管底出现黏稠沉淀，振摇后不分散，表面形成菌环。

分离培养：

①取巴氏杆菌致死的小鼠,腹部向上固定于蜡盘上，用酒精棉球消毒体表，打开腹腔，暴露肝脏，用剪刀在火焰烧灼灭菌，在肝脏表面烫之杀死表面杂菌，随即在灼烧部位刺一小孔，用灭菌接种环深入灼烧部位小孔中，将接种棒轻轻旋转2次，借以达到取足采料的目的。

②在血液平板上划线培养，37℃培养24h，观察菌落形态、大小、溶血状况等。

多杀性巴氏杆菌在血液平板上长成淡灰色、圆形、湿润、露珠样小菌落。

③挑取疑似菌落4-6个：

分别作以下实验

Ⅰ用血琼脂平板进行分离培养，血液平板上长成淡灰色、圆形、湿润、露珠样小菌落，无溶血现象,革兰氏染色为阴性球杆菌

Ⅱ用麦康凯琼脂进行分离培养，麦康凯培养基上不生长

Ⅲ将此菌接种在三糖铁培养基上可生长，并使底部变黄。

④多杀性巴氏杆菌的纯培养

细菌生化试验：

（1）甲基红试验（mR试验）：

原理：

细菌分解葡萄糖产酸，使培养液呈酸性，滴加甲基红试剂呈红色。

方法：

细菌接种于葡萄糖蛋白胨水培养基

结果：

阳性反应：

呈红色阴性反应：

无变化

（2）吲哚试验（靛基质试验）

细菌分解色氨酸产生靛基质，与靛基质试剂结合形成红色的化合物而呈色。

细菌接种于蛋白胨水培养基，37℃培养2－3天，沿试管壁缓慢加入靛基质试剂，静置5分钟，观察结果

红色环状物阴性反应：

（3）氧化酶试验：

阳性

加2-3滴试剂于滤纸上，用牙签挑去一个菌落到纸上涂布，观察菌落的反应。

阳性反应在5-10s内有粉红到黑色，15min后可出现假阳性反应。

用95%酒精配制的1%的

（:

动物实验计划书）（4）触酶试验：

将3%过氧化氢在载玻片上，挑菌观察有无气泡产生即可。

阳性反应者有气泡，无则为阴性。

（5）VP试验：

阴性

取24h的纯培养物，接种于葡萄糖蛋白胨水培养基中，置于37℃培养48-72小时，取出后在培养基中先加入VP试剂甲液0.6ml，再加入乙液0.2ml。

静止在试管架上，15min后培养液呈红色者为阳性。

（6）糖发酵试验：

细菌分解糖产酸使培养液呈酸性，指示剂表现呈色反应。

细菌接种于糖发酵管内，37℃培养24小时，观察结果。

结果观察：

培养基为黄色者，记为+;

变黄且产气泡者，记为（+）;

否则记为-

葡萄糖发酵管，乳糖发酵管，蔗糖发酵管，果糖发酵管，麦芽糖发酵管，各两个结果：

从蓝紫色变为黄色阴性法应：

仍呈蓝紫色

（7）明胶穿刺试验：

取纯培养物穿刺接种至半固体琼脂培养基，穿刺线应在培养基中间，直至管底，拔出时应原路返回。

结果说明：

若该菌有鞭毛，能运动，则部分或全部半固体琼

脂变浑浊。

不运动者只在穿刺线上生长。

（8）抑菌试验

取菌，用棉签用棉签致密接种于血清琼脂平板上，用无菌镊子将各种抗菌药物圆纸片，分别贴于培养基表面，各片距离要相等。

37度培养24h，观察结果。

血清学鉴定

毒力因子检测及抗原鉴定：

取纯培养物用0.5%氯化钠溶液洗下制成浓菌液，并分成2份。

一份经100度加热1小时（如仍有不凝集性，则在121度下处理2小时）。

另一份用0.5%福尔马林37度作用24~48小时。

分别用各种抗o血清和抗oK血清对上述菌液做玻板凝集实验。

如该菌株含K抗原，则各种抗o血清不能使福尔马林处理的菌液凝集，但可被各种抗oK血清中的一种凝集。

经100度或者121度加热的菌液可被一种抗o血清凝集，但可能与别的抗o血清发生交叉凝集，可用试管凝集法按凝集效价来排除。

H抗原一般不做鉴定。

试验项目分配

篇二：

实验计划书（初定）

此为初步计划书，还有很多不成熟甚至错误之处xxxxxxx年xx月xx号，望老师给予指出！

本实验总体上分为三大步。

（1）生理实验部分：

本部分主要进行papaya硬度和细胞壁相关酶类活性的测定。

（2）分子实验部分：

本部分主要是获得papaya细胞壁相关酶类的基因序列以及由Rna差异表达谱获得细胞壁代谢酶基因等的表达特征。

（3）验证实验部分：

本部分主要通过实时荧光定量PcR的方法（RealtimeQ-PcR）验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。

生理实验部分是第一步需要实施的，也是比较独立的部分，初步定为40天左右的时间结束。

分子实验和验证实验部分是本实验的核心，这两部分紧密结合，需要同步进行，首先是各种样本（cK，ETH，1-mcP）的获得,随后是各样本的Rna提取，然后委托深圳华大基因公司进行转录组测序并从转录组中筛选细胞壁代谢相关的基因序列,采用5RacE及3RacE的方法,获得这些基因的全长序列以及构建差异表达谱进行相关差异基因筛选等生物信息分析，最后通过实时荧光定量PcR的方法（RealtimeQ-PcR）验证并初步确定与“橡皮化”相关的细胞壁代谢酶基因的家族成员。

一，买果。

二，采后预处理：

采后立即运回实验室，剔除病果和机械损伤果，选用形状、大小、外观颜色相对一致的番木瓜果实，剪留0.5cm长果柄为实验材料。

先用1.0g/L的次氯酸钠溶液洗果10min，再用0.5g/L的施保功溶液浸泡果实10min，取出晾干后备用。

三，样品分组（四组）：

1.对照组：

果实用PE（聚乙烯）保鲜袋包装，轻绑袋口，置于低温（15℃）的恒温箱中贮藏。

2.1.0μl/L的1-mcP处理（橡皮化果实）：

在室温条件下（25℃），用浓度1.0μl/L的1-mcP密闭熏蒸处理果实24h，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH（相对湿度）为90%的条件下贮藏。

3.0.5g/L的乙烯利处理：

在室温条件下（25℃），用浓度0.5g/L的乙烯利处理果实3分钟，取出果实后用PE保鲜袋包装，轻绑袋口，置于15℃（冷藏）、RH为90%的条件下贮藏。

四，实验过程：

贮藏过程中每隔2d（催熟果实）和5d取样一次，鲜果或-70℃贮存，为以后进行基因表达水平的研究。

取样的同时，进行以下生理指标的测定：

1.果实硬度：

使用果实硬度计（FHm-1型,日本产）进行测定。

2.PG（多聚半乳糖醛酸酶）活性：

称取1g果肉，加入5mL（先加3mL,后用2mL冲洗）0.05mol/L，pH4.6的柠檬酸缓冲液低温存放（含5%nacl和1.8mm的EdTa（乙二胺四乙酸）），冰浴研磨匀浆。

然后在10000转离心30min，将上清液进行透析，用0.05mol/L，pH4.6的柠檬酸缓冲液作为透析液，透析液不含EdTa和nacl。

透析条件：

4℃条件下放24小时，中间换一次缓析液，透析完的溶液用于酶活力的测定。

该操作在冰浴下进行。

PG活性测定：

PG活性测定以1%多聚半乳糖醛酸（PGa,美国Sigma公司）为底物,反应混合液为：

1%PGa0.5mL、醋酸钠缓冲液（pH4.6）1.5mL、酶提取液0.5mL,0.5mL的水（总反应体系为3mL）,40℃反应60min,立即加入1mLdnS（3,5-二硝基水杨酸）终止反应。

再加入沸水中煮沸10min后冷却，于波长540nm下定量分析酶水解生成的半乳糖醛酸含量。

以3mL蒸馏水+1mLdnS作为对照（cK）。

以每小时释放1mg的d-半乳糖醛酸（美国Sigma公司）为1个酶活性单位（U）。

以标准d-半乳糖醛酸绘制标准曲线。

试验重复3次。

对照不加酶液，以缓冲液代替。

3.PmE（果胶甲酯酶）酶活性：

取2g果肉，加3mL预冷的1mol/Lnacl和2gPVP（聚乙烯基吡咯烷酮）置于研钵中，充分研磨后，转移到离心管中，再用2mLnacl润洗，倒入离心管中，于冰浴中放置1小时，每隔20min震荡一次，在4℃下，10000转离心30min，收集上清液，用0.01mol/LnaoH调

至pH为7.5,于4℃保存备用。

测定：

在试管中依次加入1.5mL0.5%（w/v）的果胶放冰箱备用，有效期5天、0.5mL0.01%溴麝香酚兰指示剂棕色瓶（pH为7.5），1.0mL水，0.5mL酶液（酶液最后加入），总反应体系为3.5mL。

立即将试管放入37℃的水浴锅中30min，以蒸馏水为cK。

取出试管后冷却，迅速测定其在620nm波长一分钟内的变化。

以每min变化0.01为一个活力单位（U），以U/g.Fw表示。

4.纤维素酶（cX）：

取0.625g羧甲基纤维素钠溶于0.2mol/L（pH为4.6）的醋酸钠缓冲液中，加几滴氢氧化钠调PH值到7.0，放低温下溶解，定容至100mL。

酶液的制备同PG。

活性测定：

反应体系为1mLcmc（羧甲基纤维素钠）溶液，酶液1mL，醋酸钠缓冲液（pH4.6）1.0mL（总反应体系为3mL）,40℃保温60min，取出加入3，5一二硝基水杨酸（dnS）1mL终止反应；

加入沸水中煮沸5min，冷却后用分光光度计在540nm处比色测定吸光度值。

每小时由底物生产1μmol葡萄糖所需的酶量定义为一个酶活力单位（U）。

纤维素酶活力（U/g）=〔葡萄糖含量（mg）×

酶液提取总体积（mL）×

5.56〕/〔反应液中酶液加入量（mL）×

样品重（g）×

时间（h）〕式中5.56——1mg葡萄糖的微摩尔数（1000/180=5.56）；

用3,5-二硝基水杨酸测定生成的葡萄糖做标准曲线。

5.内切木聚糖酶活性：

篇三：

临床科研试验计划书

吸烟对胃溃疡患者的血液流变学影响的研究

（一）立题依据：

胃溃疡是人类消化系统的常见病、多发病，是机体炎症细胞被激活，释放过多的致炎因

【】

子所引发的炎症反应1。

人们通常把胃溃疡看成不要紧的“小毛病”，事实上，老年胃溃疡患者的癌变率为3～5％，中青年为0．5～2％，尤其是近幽门口的溃疡、反复迁延的慢性溃疡最容易癌变，所以胃溃疡的治疗不能忽视。

一直以来，人们认为，幽门螺杆菌感染、非甾体类抗炎药（如，阿司匹林）导致胃黏膜损伤以及寒冷、精神紧张、吃酸辣甜腻食物过多等引起的胃酸分泌过多是引起胃溃疡的主要原因，但近期的一些动物实验研究指出，吸烟可以影响血管内皮依赖的血管收缩舒张功能，可影响胃粘膜的血液循环，可能与胃溃疡的发生及迁

【2.3】

延不愈有关。

国内外关于吸烟与胃溃疡的关系的临床研究很少，并且存在着样本含量较少，评价不够全面等缺陷，需要进一步深入的研究。

参考文献：

[1]陈灏珠．内科学[m]．第4版．北京：

人民卫生出版社，20XX：

349—360．[2]李昌俊，郑瑶，李玉鑫，任辉，陈春，连建学.被动吸烟对兰索拉唑作用于小鼠胃溃疡模型的干预作用[J].医学论坛杂志。

20XX：

29（4）

[3]张雪萍，吕明明，李霞，孙海基.尼古丁对药物性胃溃疡影响的实验研究[J].食品与药品.20XX:

13

（1）

（二）研究目的：

通过对吸烟与不吸烟的胃溃疡患者的血液流变学指标的观察，旨在了解吸烟对胃溃疡患者的血液流变学的影响，从而对预测吸烟对胃溃疡发生发展的影响提供一定的依据。

（三）研究对象1、样本含量估计：

采用单纯随机抽样的样本含量估算公式n=[uα2π（1-π）]/δ2计算样本量，式中：

n:

样本量；

uα:

i型错误概率α=0.05时的u值；

π:

吸烟导致的血液流变学变化的发生率；

δ:

容许误差

此处δ取0.03，同时据文献调查，吸烟导致的血液流变学变化的发生率约为30%，代入公式得：

n=[uα2π（1-π）]/δ2=[1.962×

0.30×

（1-0.3）]/0.032=896人。

另外，为减少失访误差，在此基础上再增加20%，则约需观察1075例。

2、诊断标准：

采用1994年国家中医药管理局颁布《胃溃疡诊断标准》：

（1）慢性病程，周期性发作，常与季节变化、精神因素、饮食不当有关；

或长期服用能致溃疡的药物如阿司匹林等。

（2）上腹隐痛、灼痛或钝痛，服用碱性药物后缓解。

典型胃溃疡常于剑突下偏左，好发于餐后半小时到1～2小时，痛常伴反酸嗳气。

（3）基础泌酸量及最大泌酸量测定有助诊断。

胃溃疡的基础泌酸量正常或稍低，但不应为游离酸缺乏。

（4）溃疡活动期大便隐血阳性。

（5）X线钡餐检查可见龛影及粘膜皱襞集中等直接征象。

单纯局部压痛，激惹变形等间接征象仅作参考。

（6）胃镜检查，可于胃部见圆或椭圆、底部平整、边缘整齐的溃疡。

根据溃疡面所见，可分为：

①活动期：

溃疡面为灰白或褐色苔膜覆盖，边缘肿胀，色泽红润、光滑而柔软。

②愈合期：

苔膜变薄，溃疡缩小，其周围可见粘膜上皮再生的红晕；

或溃疡面几乎消失，其上有极少的薄苔。

③瘢痕期：

溃疡面白苔已消失，变成红色充血的瘢痕；

可见皱襞集中。

具备以上

（1）

（2）（5）或

（2）（6）项者可作胃溃疡诊断，3、纳入标准：

（1）均为胃镜检查确诊的门诊胃溃疡患者；

（2）均为男性，年龄20—50岁（3）均为单个溃疡；

（4）溃疡病有吸烟组患者，吸烟史5年以上，目前仍在吸烟，5支以上/d；

无吸烟组，无

吸烟史，4、排除标准：

（1）有糖尿病、高脂血症、心脑血管病者

（2）有严重肝肾疾病、癌症患者；

（3）长期酗酒者；

5、可能出现的偏倚及控制措施偏倚:

（1）诊断性偏倚（选择纳入标准时，为统一其诊断标准）。

（2）入院率偏倚（在选择时为了减少失访和提高依从性而倾向于选择住院病人）。

（3）无应答偏倚（研究对象未按要求回答调查内容或隐瞒事实真相）。

（4）测量偏倚（在测量相关指标的时候由于工作人员的水品问题可能会导致出现一定的误差）。

（5）混杂偏倚（性别、年龄是最常见的混杂因素）。

偏倚控制措施：

（1）对研究人员进行统一培训；

（2）严格纳入及排除标准；

（3）保证样本的独立性；

（4）由于试验过程不会对患者造成额外伤害，会有比较好的依从性；

（5）减少病例的退出，对退出的病人应进行随访；

（6）治疗前后安排统一的疗效评定人员，以防止测量偏倚；

（7）对可能影响疗效的混杂因素如：

病因、病程、性别等，将纳入多因素分析的自变量范

畴进行讨论；

（8）减少数据丢失，对退出治疗的病人也进行数据分析。

（四）研究方法：

1、确定受试对象：

严格按照纳入及排除标准确定受试对象，并与受试对象讲解试验过程及意义，签署知情同意书

2、分组：

按患者是否吸烟，将其分为吸烟组与不吸烟组3、观察指标：

（1）受试者所填《吸烟对胃溃疡患者的血液流变学影响调查表》作为基本情况观察指标

（2）未用药前，晨间抽血，测定血脂、空腹血糖（FPG）及血液流变学有关指标

（3）以门诊入院血液指标检测值、半年血液指标检测值、一年血液指标检测值，作为吸烟对胃溃疡患者血液流变学影响的门诊入院影响、半年影响、一年影响的观察指标；

（4）中国卫生部2000年颁布的健康人群血脂、血糖、血液流变学参数参考值作为标准参数，溃疡吸烟组和非吸烟组检出的各值均与标准参数进行比较。

4、参数记录及比较：

表1胃溃疡各组血脂、血糖水平及其比较（x±

s）项目

TG（mmol/L）Tch（mmol/L）HdL-c（mmol/L）LdL-c（mmol/L）VLdL-c（mmol/L）FPG（mmol/L）

吸烟组不吸烟组

表2胃溃疡各组血液流变学参数及其比较（x±

s）

项目

低切全血粘度（mPa·

s）高切全血粘度（mPa·

s）血浆粘度（mPa·

s）红细胞压积（%）ESR（mm/h）血沉方程K值红细胞聚集指数红细胞刚性指数红细胞变形指数

血浆纤维蛋白原（g/L）1min血小板聚集率（%）3min血小板聚集率（%）最大血小板聚集率（%）

5、统计分析：

（1）各组结果以均值±

标准差（x±

s）表示，溃疡吸烟组均数与标准参数、溃疡不吸烟组均数与标准参数、溃疡吸烟组与不吸烟组均数之间进行进t检验。

P1）对胃溃疡组和对照组结果做正态性检验，根据样本含量大小选择w检验或d检验，为增加检验效能，可令α=0.20。

如果结果符合正态性，则将各组均数对总体均数是否为零进行t检验，α=0.05。

如不符合正态性，则见2）；