拟南芥总蛋白提取Word文档下载推荐.docx
《拟南芥总蛋白提取Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《拟南芥总蛋白提取Word文档下载推荐.docx（20页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
拟南芥蛋白；
蛋白质分析
Abstract
Therearemanymethodsofthewithdrawtionoftheplantproteins,nomatteranymethod,itmustpreservethebiologymacromolecularstructuretobeintegrityintheoperation,preserveactivitytopreventthedegradationanddegenerationphenomenon.Spaceforproteinstructuremainlyrelyonhydrogenbonding,saltbondingandtheVanderWaalsbonding,theexistenceoftheeventacid,alkalitreatment,hightemperature,Mechanicaldramaticroleandstrongradiationcanleadtothelossofactivity,itshouldchoosetheconditionsfortheverymodest.SDS-PAGEastheisolationandidentificationofbiologicalmacromoleculesinoneoflaboratorymeans,ithasbecomeoneoftheimportantlaboratorytechniqueinMolecularbiology.
Thisexperimentusesthreedifferentmethods（twomethodsareproteinstodissolvesolution,onemethodisproteinprecipitation）withdrawsthetissues,proteinofArabidopsisthaliana（alltheproteinofArabidopsisthaliana,theleafproteinofArabidopsisthaliana,theinjuriestissueproteinofArabidopsisthaliana）,andthentheproteinatlasindifferenttissuesandorgansofArabidopsisthalianawereanalyzedwithSDSpolyacrylamidegel,andthen,throughtheanalysisoftheSDS-PAGEpicturewecananalysisthedifferentextractbufferandthedifferentproteinofthedifferentorganizations.
Finally,theresultsindicatethatthebestmethodisextractbuffer2—theSDS-PAGEpictureistheclearest,theextractbuffer3thatisthetrichloroaceticacidacetonenext,thelastistheextractbuffer1whichisPBS.ThekindsofproteininthewholeArabidopsisthalianaweremostandclearestinthesethreetissues,thekindsofproteinintheleafwereleast,thisphenomenoncanbeexplainedbythattheprotein'
scontentandtheprotein'
stypearedifferent,thisindicatesthatthenumberofthestripbeltbandhastherelevancewiththefunctionnature,thephenomenonthatthenumberoftheleafproteinistheleastindicatethatthecontentandtypeoftheleafproteinareonlyapartofthewholeproteinofArabidopsisthaliana;
asaresultofthattheculturemediumhasinfluencewiththerootprotein,thepictureofthewholeproteinhasathickbelt.Inaddition,thisexperimenttakestwodifferentbleachingmethods,oneisrapidbleaching,theotherisbleachingliquid,theresultshowsthattherapidbleachingmethodnotonlysimpleandconvenient,butalsohaveabettereffect,sowecanuseitextensively.
KeywordsSDS-PAGEelectrophoresis;
Arabidopsisthalianaprotein;
Theproteinanalysis
1引言·
·
1
1.1拟南芥简介·
1.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳·
2
1.3拟南芥蛋白提取·
3
1.4实验研究的意义·
1.5展望·
4
2材料、主要试剂及主要仪器·
2.1实验材料·
2.1.1拟南芥培养·
2.1.2培养拟南芥愈伤组织·
2.2主要试剂及药品·
5
2.2.1溶液的配置·
2.2.2所用主要药品和试剂·
7
2.3主要仪器·
8
3实验方法·
3.1样品蛋白的制备——蛋白质的提取·
3.1.1提取液1、2和水提取蛋白·
3.1.2提取液3提取蛋白·
9
3.1.3SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳·
4结果与分析·
10
4.1不同方法提取拟南芥不同组织蛋白的效果比较分析·
4.2丙酮法提取蛋白与其它提取法的比较·
11
4.3拟南芥蛋白分子量分析·
13
5讨论·
5.1金属离子螯合剂在蛋白提取中起重要作用·
5.2关于谱带倾斜现象·
5.3关于拟南芥各组织蛋白·
5.4染色、脱色·
14
6结论·
15
参考文献·
16
致谢·
18
1引言
1.1拟南芥简介
拟南芥（Arabidopsisthaliana）十字花科。
二年生草本，高7～40厘米。
基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；
茎生叶无柄，披针形或线形。
总状花序顶生，花瓣4片，白色，匙形。
长角果线形，长1～1.5厘米。
花期3～5月。
我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现[1]。
图1-1拟南芥花图1-2拟南芥植株
这种植物具有以下特点：
（1）形态个体小，高度只有30cm左右；
（2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；
（3）种子多，每株每代可产生数千粒种子；
（4）形态特征简单；
（5）基因组小，只有5对染色体。
拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
虽然这种植物在许多方面“简单”，但它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，另外，由于这种植物的全部基因组测序已经完成，因此可以预测，拟南芥在植物学所有领域的研究中将发挥更大的作用[2]。
1.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
1937年瑞典化学家Tiseliue首先开发了蛋白质电泳技术，并成功地将血清蛋白分成几个组分。
原理：
迁移率是带电颗粒在一定电场强度下，单位时间内介质中的迁移距离，可公式计算：
U=V/E=Dl/Ut
U：
迁移率，单位是cm/V．s或cm/V．min
V：
泳动速度，单位是cm/s或cm/min
E：
电场强度，单位是V/cm
D：
泳动距离，单位是cm
T：
电泳时间，单位是min或s
L：
支持物长度，单位是cm
SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的简称，是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。
这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量[3]。
聚丙烯酰胺变性凝胶电泳是对扩增产物进行检测，与其他电泳法比较具有如下优点：
①电泳区带狭窄不易扩散，供试品用量极微，电泳分离时间短，设备简单，分辨率高，重复性佳，已广泛用于酶、蛋白、聚核苷酸、多肽的分析鉴定和少量制备。
②凝胶是以单体-烯酰胺和交联剂，甲叉丙烯酰胺聚合而成的纵链交错的且有“分子筛效应的三维网状结构”。
其机械性能优良，对热稳定，无色透明，无杂质，不溶于缓冲液，在280nm波长处无紫外吸收。
电泳时无电渗和吸附作用，适于供试品的定量和精制。
本实验利用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分别比较不同提取方法提取拟南芥总蛋白、叶蛋白、愈伤组织蛋白的差异以及每个提取方法的优劣。
1.3拟南芥蛋白提取
蛋白质的种类有很多，提取方法也有很多种，常用的有等电点沉淀法、盐析法、有机沉淀法，不同的方法对与提取不同的蛋白具有较好的效果。
即使是同一种物质的不同组织也含不同的蛋白质，在本实验中，将采用三种方法（两种蛋白溶解法，一种沉淀蛋白法）提取拟南芥不同组织的蛋白质，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，比较不同的提取方法的提取效果、不同组织的蛋白提取情况[4]。
不论使用哪一种方法，均必须在操作中保存生物大分子结构的完整性，保存活性防止变性及降解现象的发生。
因空间结构主要依靠氢键、盐键和范德华力的存在，遇酸、遇碱、高温、剧烈的机械作用及强烈的辐射等均可导致活性丧失，因此选择的条件应为十分温和。
同时应注意防止系统中重金属离子、细胞自身酶系及其他有毒物质的污染[5]。
1.4实验研究的意义
拟南芥已广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
虽然这种植物在许多方面“简单”，但它的大多数基因与其他“复杂”的植物基因具有很高的同源性，该种植物的全部基因组测序已经完成。
SDS聚丙烯是种很重要的分离生物大分子的实验技术，但是在实验过程也有很多应该注意的事项。
蛋白质的提取有多种方法，本实验中将选用三种不同的方法进行提取，然后将提取的蛋白样品进行SDS-PAGE分析，从而确定提取蛋白的最佳方法。
本实验通过用多种对拟南芥不同组织进行提取，提取的蛋白样品将进行SDS凝胶电泳分析，分析不同蛋白提取法的优劣以及同一植物不同组织的蛋白电泳差异，加强对SDS-PAGE的原理和操作步骤的理解和掌握。
1.5展望
提取蛋白跑完电泳后可以做Western杂交，然后进行蛋白序列分析。
Western杂交是将蛋白质电泳、印迹、免疫测定融为一体的特异性蛋白质的检测方法。
先从生物细胞中提取总蛋白或目的蛋白，SDS-PAGE电泳将蛋白质按分子量大小分离，再把分离的各蛋白质条带原位转移到固相膜（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，接着将膜浸泡在高浓度的蛋白质溶液中温育，以封闭其非特异性位点。
然后加入特异抗性体（一抗），膜上的目的蛋白（抗原）与一抗结合后，再加入能与一抗专一性结合的带标记的二抗，最后通过二抗上带标记化合物（一般为碱性磷酸酶）的特异性反应进行检测。
根据检测结果，从而可得知被检生物（植物）细胞内目的蛋白的表达与否、表达量及分子量等情况。
Western杂交方法灵敏度高，通常可从植物总蛋白中检测出50ng的特异性的目的蛋白[6]。
然后也可对已获得的目的蛋白进行蛋白序列的分析。
通常使用专一化学试剂或具有不同水解专一性蛋白酶，得到有可能重叠的序列的肽段，从而推断出蛋白的氨基酸序列。
蛋白质的一级结构是其高级结构的基础，因此，蛋白质序列分析对于获得有关高级结构的信息是一个很有用的基础[7]。
2材料、主要试剂及主要仪器
2.1实验材料
2.1.1拟南芥培养[8]
⑴培养前预处理：
拟南芥（Arabidopsisthaliana，哥伦比亚野生型）种子用70%乙醇浸泡2min后，无菌水漂洗1次，再用3.5％次氯酸钠浸泡10～15min，无菌水漂洗5次，播种于MS培养基上，放入4℃冰箱中春化3天；
⑵春化后的拟南芥种子放入生长箱中培养，生长7天左右（培养箱温度周期为22℃（昼）/18℃（夜），光周期为12h（光）/12h（暗），光强为120～130μmol。
2.1.2培养拟南芥愈伤组织[9]
⑴挑选大而饱满的具有发芽能力的成熟种子，采取两步消毒法。
剥胚前用75%酒精中浸1min，再用0.1%升汞消毒8min，无菌水冲洗5～6次。
在超净台内用镊子和解剖针仔细剥取胚，成熟胚盾片向上接种于愈伤组织诱导培养基上。
⑵愈伤组织的诱导
将成熟胚每瓶接种5粒，接种后在黑暗条件下培养，温度为18℃，3～7天后，开始产生愈伤组织，15天后明显增大，统计愈伤组织诱导率。
⑶愈伤组织培养调控
愈伤组织最初多呈水浸状，质量较差，经过改良继代，其表面长出白色或黄色的愈伤组织，并迅速增殖。
愈伤组织20天继代1次，每瓶接3块，接种培养40天后观察愈伤状态。
愈伤组织的诱导和试管苗的分化在诱导培养基上培养1周，叶段和茎段的切口处开始膨大，两周后愈伤组织生长良好，表面呈粒状，局部变绿，18℃储藏以备用。
2.2主要试剂及药品
2.2.1溶液的配制[10-16]
2.2.1.1MS培养基
MS培养基配方：
大量元素（母液Ⅰ）
mg/L
NH4NO3
33000
KNO3
38000
CaCl2·
2H2O
8800
MgSO4·
7H2O
7400
KH2PO4
3400
微量元素（母液Ⅱ）mg/L
KI
166
H3BO3
1240
MnSO4·
4H2O
4460
ZnSO4·
1720
Na2MnO4·
50
CuSO4·
5H2O
5
CoCl2·
6H2O
5
铁盐（母液Ⅲ）mg/L
FeSO4·
5560
Na2-EDTA·
7460
有机成分（母液Ⅳ）mg/L
肌醇
20000
烟酸
100
盐酸吡哆醇（维生素B6）
100
盐酸硫胺素（维生素B1）
甘氨酸
400
其中诱导培养基附加植物激素IAA0.5－2mg，分化培养基附加6BA0.5-1mg，IAA0.5mg，蔗糖20g，琼脂1.2%，pH5.8。
2.2.1.2蛋白提取液1——PBS溶液
称取NaCl0.8006g，KCl0.02012g，KH2PO40.02722g，Na2HPO40.
升级会员 