生物化学常用试剂配制文档格式.docx
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偏重亚硫酸钠(Na2S2O5)6.0g
(3)充分溶解后盛于棕色瓶中,放置5天后便可使用,平时盛一小瓶(250mL)使用,要放在冰箱中冷藏。
此溶液每月配制一次。
注意:
倒入瓶中时要尽量装满!
!
4.考马斯亮蓝G-250的配制(1000mL)
称考马斯亮蓝G-250100mg即0.1g溶于50mL95%乙醇中,加入100mL85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000mL,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%(w/v)考马斯亮蓝G-250,4.7%(w/v)乙醇,8.5%(w/v)磷酸。
5.1.0M柠檬酸缓冲溶液的配制(1000mL)
分子量Mn
柠檬酸(C6H8O7·
210
NaOH
40
74.5
准确称取柠檬酸210g,溶于约750mL煮沸(10min)蒸馏水中,待柠檬酸充分溶解后加入氢氧化钠74.5g,完全溶解后将上述溶液转移到1000mL容量瓶中,冷却后将容量瓶定容到1000mL(原始pH4.45)。
(检验方法:
取1.0M柠檬酸缓冲溶液稀释20倍,测定稀释液的pH值,pH值应为4.8)
6.标准糖溶液的配制和标准方程的测定
(1)标准糖溶液的配制
准确称取2.000g葡萄糖/木糖(葡萄糖/木糖需105℃烘干3h),蒸馏水溶解,全部转移至1L容量瓶内,摇匀,配制成2g/L葡萄糖/木糖溶液。
取9个100mL容量瓶、1支20mL刻度吸管,分别吸取2g/L葡萄糖/木糖溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL依次加入容量瓶,蒸馏水定容,摇匀。
即为0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液。
取6个30mL容量瓶、1支20mL刻度吸管,分别吸取2g/L葡萄糖溶液10mL、12mL、14mL、16mL、18mL、20mL依次加入容量瓶,每瓶再加入1.5mL柠檬酸缓冲液,蒸馏水定容,摇匀。
即为1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖。
(2)标准方程的测定:
葡萄糖/木糖标准方程的测定
取10支25mL刻度管,10支1mL刻度吸管,分别加入0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L、1.0g/L、1.2g/L、1.4g/L、1.6g/L、1.8g/L、2.0g/L葡萄糖/木糖标准溶液1mL,DNS溶液3mL。
100℃煮沸5min,水浴冷却后定容至25mL,摇匀。
以蒸馏水作为空白对照,550nm测定吸光度A。
以A为纵坐标,C为横坐标,制定标准曲线。
(7230型分光光度计输出方程为:
A=MC+N,723型分光光度计输出方程为:
C=KA+B)
酶解木糖标准方程测定(测定木聚糖酶活力)
取6支25mL刻度管,6支2mL刻度吸管,分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解木糖标准溶液1.5mL,DNS溶液3mL,100℃煮沸5min,水浴冷却后定容至25mL,摇匀。
C=KA+B)
酶解葡萄糖标准方程测定(测定滤纸酶活力、CMC酶活力)
取6支小试管,6支2mL刻度吸管,分别加入1.0g、1.2g、1.4g、1.6g、1.8g、2.0g酶解葡萄糖标准溶液1.5mL,DNS溶液3mL,100℃煮沸5min,水浴冷却后,量筒定容至50mL(定容至25mL,测定CMC酶活力),摇匀。
7.柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制
pH
0.1mol/L
柠檬酸/mL
0.2mol/L
磷酸氢二钠/mL
2.2
19.60
0.40
5.2
9.28
10.72
2.4
18.76
1.24
5.4
8.85
11.15
2.6
17.82
2.18
5.6
8.40
11.60
2.8
16.83
3.17
5.8
7.91
12.09
3.0
15.89
4.11
6.0
7.37
12.63
3.2
15.06
4.94
6.2
6.78
13.22
3.4
14.30
5.70
6.4
6.15
13.85
3.6
13.56
6.44
6.6
5.45
14.55
3.8
12.90
7.10
6.8
4.55
15.45
4.0
12.29
7.71
7.0
3.53
16.47
4.2
11.72
8.28
7.2
2.61
17.39
4.4
11.18
8.82
7.4
1.83
18.17
4.6
10.65
9.35
7.6
1.27
18.73
4.8
10.14
9.86
7.8
0.85
19.15
9.70
10.30
8.0
0.55
19.45
Na2HPO4,Mr=141.98;
0.2mol/L溶液为28.40g/L
Na2HPO4·
2H2O,Mr=178.05;
0.2mol/L溶液为35.61g/L
C6H8O7·
H2O,Mr=210.14;
0.1mol/L溶液为21.01g/L
二、酶活力的测定
1.滤纸酶活力的测定—纤维素酶的总体酶活力
采用国际理论和应用化学协会(IUPAC)推荐的标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&
Appl.Chem.,1987,59,257-268],一个滤纸酶活力的国际单位(FPIU)等于在标准反应条件下每分钟生成1μmol葡萄糖量的酶量。
测定方法如下:
取7支试管在其中1#-5#支小试管中加入50mg卷成筒状的滤纸条(1×
6cm),适当稀释酶液,取7支试管按下表操作。
(5#有底物无酶,6#为有酶无底物空白对照)
项目
1#
2#
3#
4#
5#
6#
7#
稀释酶液(mL)
0.2
0.3
0.4
0.5
酶解葡萄糖
标样1.5mL
0.05M柠檬酸缓冲液(mL)
1.3
1.2
1.1
1.0
1.5
1
将上述试管盖上塑料布,用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中,保持在振幅80和温度50℃下保温60min后立即取出加入3mLDNS试剂,在沸水中反应5min,冷却后加水至50mL并充分摇匀,待滤纸完全沉淀后,取上层清液于550nm波长下测定吸光度A值。
反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成葡萄糖的毫克数为横坐标,酶量的对数为纵坐标作图,从图中找出生成2mg葡萄糖的酶量,按下式计算样品的滤纸酶活力(FPA):
滤纸酶活力=2mg葡萄糖
60min×
0.18(mg/μmol)×
生成2mg葡萄糖的酶量(mL)
一个滤纸酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量,单位:
IU/mL。
备注:
当加入0.5mL酶液(指酶液没有被稀释的时候!
)仍无法生成2mg葡萄糖时,按下式计算:
滤纸酶活=0.185×
(葡萄糖mg数)
2.β-葡萄糖苷酶活力的测定
方法一:
葡萄糖氧化酶测定法
按国际标准方法测定[Ghose,T.K.,etal,Pure&
Appl.Chem.,1987,59,257-268]。
一个β-葡萄糖苷酶活力国际单位(IU/mL)等于标准条件下每分钟转化1μmol底物即生成2μmol葡萄糖的酶量来表示。
预先用0.05M的柠檬酸缓冲液配制15mmol/L的纤维二糖溶液(0.513g纤维二糖/100mL0.05M的柠檬酸缓冲液,现配现用)
(1)每个样品应做三个不同酶量
估计β-葡萄糖苷酶活力(IU/mL)
<
0.1
0.1
取酶液量(mL)
0.5/0.8/1.0
0.3/0.5/0.8
0.2/0.3/0.5
0.1/0.2/0.3
(2)加料:
试管中加入酶液、缓冲液和纤维二糖溶液如下:
酶液量
(mL)
纤维二糖溶液
样品
适量
1-酶液
酶液空白
纤维二糖空白
每个试管共2mL,用塑料纸包扎好。
纤维二糖溶液必须用0.05M柠檬酸配制。
(3)酶解反应:
试管置于50℃水浴中,保温30分钟,取出,沸水中放置5分钟使酶失活,冷却至室温。
(4)加显色剂(葡萄糖氧化酶测定试剂):
取试管中冷却液30µ
L,加入显色剂3.0mL,混匀;
同时做一个葡萄糖标样:
取1g/L葡萄糖标样30µ
L,加显色剂3.0mL,混匀;
置于37℃水浴中,保温15分钟,取出。
(5)测吸光度:
505nm,用蒸馏水调零,测各试管溶液吸光度A值。
1g/L葡萄糖标样的吸光度为0.7左右。
(6)计算产生的葡萄糖mg数:
样品吸光度
测得酶空白所含葡萄糖=2×
(mg)
纤维二糖空白1g/L葡萄糖标样吸光度
样品实际产生的葡萄糖=[测得葡萄糖mg]-[纤维二糖空白葡萄糖mg]
-[酶空白葡萄糖mg]×
[酶液量mL](mg)
纤维二糖空白所产生的响应值,当纤维二糖溶液为新鲜配制时,一般很低。
(7)作图:
以log(酶液量mL)为纵坐标,实际产生的葡萄糖mg为横坐标作图,求出生成1mg葡萄糖时对应的酶液量mL。
(8)计算β-葡萄糖苷酶活力:
0.0926
β-葡萄糖苷酶活力=(IU/mL)
生成1mg葡萄糖对应的酶液量(mL)
当加入1mL酶液仍不能生成1mg葡萄糖时,
β-葡萄糖苷酶活力=0.0926×
☆补充:
葡萄糖含量测定
采用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶终点比色法测定。
葡萄糖测定试剂盒由上海荣盛生物技术有限公司生产,内含R1(缓冲液)和R2(酶试剂),使用时将R1和R2等量混合。
葡萄糖经葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢,后者在过氧化物酶的作用下,将4-氨基安替比林与苯酚偶联缩合成可被分光光度计测定的醌类化合物。
测定该有机化合物的吸光度便能计算出葡萄糖的含量。
在测定管中加入30µ
L待测试样的稀释液(空白管、标准管分别以蒸馏水及1g/L的葡萄糖标准溶液代替),每一试管中加入由R1和R2等量混合的酶酚混合液3.0mL,将各试管分别摇匀,置于37℃水浴中保温15min,冷却至室温后,在7230分光光度计上于505nm下测定吸光度A值,用空白管校正吸光度到零点,葡萄糖含量按下式计算:
葡萄糖含量(g/L)=×
稀释倍数
方法二:
采用pNPG(对硝基苯酚-β-D-葡萄糖苷)试剂测定
(1)试剂的配制
50mmol/L,pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的配制(200mL)
方法:
0.1mol/L柠檬酸101.4mL+0.2mol/L磷酸氢二钠98.6mL
1mol/LNa2CO3溶液(250mL)
称取:
26.5gNa2CO3溶解后定容至250mL
5mmol/LpNPG(分子量:
301.25)溶液的配制(100mL)
称取0.1506gpNPG,用50mmol/L,pH4.8柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液溶解后定容至100mL。
(2)对硝基苯酚标准方程的测定
对硝基苯酚标准溶液的配制
准确称取0.0209g对硝基苯酚(分子量:
139.11),蒸馏水溶解,全部转移至100mL容量瓶内,摇匀,配制成1.5mmol/L对硝基苯酚溶液。
取6个30mL容量瓶,分别吸取1.5mmol/L对硝基苯酚溶液1mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL依次加入容量瓶,蒸馏水定容,摇匀。
即为0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L。
对硝基苯酚标准方程的测定
取6支15mL刻度管、6支1mL刻度吸管,分别加入0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L对硝基苯酚溶液1.0mL,再加入2.0mL1mol/L的Na2CO3溶液和10mL的蒸馏水,室温放置5min后,摇匀。
以蒸馏水作为空白对照,在400nm下测定吸光度A。
(3)测定方法
游离酶酶活力的测定:
0.1mL适当稀释的酶液与0.9mL5mmol/LpNPG溶液(分别预热5分钟)混合后,于50℃下保温10min。
10min后立即加入2mL1mol/LNa2CO3溶液终止反应后,再加入10mL的蒸馏水,摇匀。
在400nm下测定吸光度。
以0.1mL蒸馏水代替酶液作空白对照。
(要做2~3个平行样,取平均值)
固定化酶酶活力的测定:
将游离酶酶活的测定方法中0.1mL适当稀释的酶液用0.1mL蒸馏水和一定质量的固定化酶来代替,其余步骤相同。
(4)酶活力的计算
一个β-葡萄糖苷酶酶活力单位定义为:
每分钟水解生成1µ
mol对硝基苯酚所需要的酶量。
计算公式如下:
游离酶酶活力的计算:
生成对硝基苯酚的量(µ
mol)
β-葡萄糖苷酶酶活=(IU/mL)
10min×
0.1mL
固定化酶活力的计算:
β-葡萄糖苷酶酶活=(IU/g)
10min×
称取固定化酶的质量(g)
3.羧甲基纤维素(CMC)—内切葡聚糖酶活力
(1)在25mL刻度试管中加入0.5mL适当稀释的酶液和1.0mL用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%(w/v)羧甲基纤维素悬浮液。
(2)盖上塑料布,用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中,保持在振幅80和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mLDNS试剂,在100℃沸水中煮沸5min,冷却到室温后,加水定容至25mL,充分摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值。
(3)反应生成的葡萄糖的量根据葡萄糖标准曲线求得。
按下式计算CMC酶活力:
CMC酶活力=生成的葡萄糖的量(mg)
30min×
0.5mL
一个CMC酶活力单位定义为每分钟生成1μmol葡萄糖所需的酶量,单位:
4.木聚糖酶活力的测定
用0.05mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%(w/v)桦木木聚糖(Sigma公司制造)溶液。
适当稀释酶液,取7支25mL刻度试管按下表操作(5#有底物无酶、6#为有酶无底物空白对照)。
酶解木糖标样1.5mL
0.05M柠檬酸缓冲液(mL)
1%桦木木聚糖(mL)
将上述试管盖上塑料布,用橡皮筋扎紧后置于恒温水浴器中,保持在振幅80和温度50℃下保温30min后立即取出加入3mLDNS试剂,在沸水中反应5min,冷却到室温后,加水到25mL,充分摇匀后于550nm波长下测定吸光度A值。
根据木糖标准曲线(用木糖的绝对量对吸光度A值作图),找出反应所产生的木糖量(扣除空白值)。
以0.2、0.3、0.4、0.5mL酶量所生成木糖的毫克数为横坐标,酶量的对数为纵坐标作图,从图中找出生成2mg木糖的酶量,按下式计算木聚糖酶活力:
木聚糖酶活力=2mg木糖
30min×
0.15(mg/μmol)×
生成2mg木糖的酶量
一个木聚糖酶活力单位定义为每分钟生成1μmol木糖所需的酶量,单位:
三、木聚糖的测定方法
1、准确吸取5mL搅拌均匀的木聚糖溶液于250mL三角瓶中,加入5mL8%的硫酸,摇匀后用牛皮纸和橡皮筋将三角瓶的瓶口扎住。
2、将三角瓶置于灭菌锅中于121℃条件下保温60min,冷却后取出。
3、将三角瓶中的水解液倒入200mL烧杯中,加入100mL左右的水(注意少量多次洗涤三角瓶),用15%的NaOH溶液中和至pH值为6.5~7.0。
4、将中和液定容到200mL(量筒)。
5、用DNS法测得中和液的还原糖浓度c,则被测样品的木聚糖浓度C为:
C=c×
40×
0.9
式中:
C—木聚糖浓度,g/L
c—水解液中木糖浓度
0.9—木聚糖和木糖的转化系数
6、每个样品做2个平行样。
木聚糖的聚合度是用c×
40除以木聚糖不水解直接测糖的还原物浓度。
四、可溶性蛋白质的测定
采用Bradford测定方法。
测定试剂采用Bradford试剂(Sigma公司)。
常量分析法。
取5个蛋白质标准样品(分别含牛血清蛋白0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mg/mL),1个空白对照(蒸馏水)和所有待测试样各0.1mL于10mL具塞试管中,顺试管壁分别加入3.0mLBradford试剂,将试管小心上下翻转几次使液体混合均匀(注意尽量不产生泡沫),在加入染色剂后的5-60min内,于595nm波长下测定各样品的吸光度A值。
以同样处理的空白作为对照。
当蛋白质浓度在0.2-1.0mg/mL范围内时,吸光度A值与蛋白质浓度之间呈线性关系。
作出蛋白质浓度标准曲线后,由待测试样的A值可求得蛋白质的浓度。
微量分析法。
当蛋白质浓度较低时,可采用微量分析法来测定蛋白质浓度。
取5个蛋白质标准样品(分别含牛血清蛋白2、4、6、8和10µ
g/mL)和待测试样各1.0mL于10mL具塞试管中,顺试管壁分别加入1.0mLBradford试剂,其余步骤与常量分析方法相同。