高中生物第四章生物化学与分子生物学技术实践第10课时分子生物学技术同步备课教学案苏教选修1Word文件下载.docx

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打开DNA双螺旋

DNA聚合酶

催化合成DNA子链

能量

ATP

为解螺旋和合成子链供能

引物

RNA

为DNA聚合酶提供合成的3′端起点

3.PCR技术

（1）概念：

在体外快速扩增特定基因或DNA序列（目的DNA片段）的技术称为PCR技术。

（2）物质条件：

DNA模板、四种脱氧核苷酸、TaqDNA聚合酶、引物。

（3）PCR反应的过程及结果

①PCR反应程序

a.变性：

在94℃高温下，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA。

b.退火（复性）：

反应体系的温度降至55℃，引物与作为模板的单链DNA上的特定部位相互配对。

c.延伸：

反应体系的温度回升到72℃左右，按照单链DNA上的脱氧核苷酸序列，4种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则，在TaqDNA聚合酶的作用下连接到引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链。

②结果

a.PCR扩增一般要经历三十多次循环，每次循环都包括变性、退火、延伸三步。

b.两引物之间的固定长度的DNA序列呈指数扩增。

1.PCR原理

PCR反应与体内DNA复制的引物在化学本质上是否相同？

请分析原因。

答案　不相同。

体内DNA复制所需引物为RNA聚合酶合成的一小段RNA，但PCR反应时所用引物一般是人工加入的一小段单链DNA。

2.PCR反应过程

（1）PCR反应中需要解旋酶和DNA聚合酶吗？

若需要，则与细胞内DNA复制有何区别？

答案　PCR反应不需要解旋酶，但需要DNA聚合酶。

由于PCR反应中需要高温使DNA解旋，因此PCR所需的DNA聚合酶能耐高温。

（2）PCR的每次循环中应如何控制温度？

答案　每次循环中先高温解旋，再低温使引物与模板结合，最后适当升温有利于TaqDNA聚合酶发挥作用。

（3）结合下图分析PCR过程中DNA复制的方向是怎样的？

答案　DNA的羟基（—OH）末端为3′端；

磷酸基团的末端为5′端。

当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

归纳总结　PCR扩增与DNA复制的异同

项目

DNA复制

PCR扩增

不

同

点

时期

有丝分裂间期或减数第一次分裂的间期

任何时期

场所

活细胞内

细胞外

解旋酶、DNA聚合酶

耐高温的TaqDNA聚合酶

有转录，产生RNA作引物，无需人工加入

无转录，无引物产生，需人工加入两种DNA引物

特点

边解旋边复制

先全部解旋后开始复制

缓冲液

不需缓冲液

配制缓冲液代替细胞核液

设备

无

控制温度变化的温控设备

相

原理

严格遵循碱基互补配对原则

都需要分别与两条模板链相结合的两种引物

DNA的两条链为模板

半保留复制

游离的四种脱氧核苷酸

1.下列关于DNA复制和PCR技术的描述中，正确的是（　　）

A.DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从5′端延伸DNA链

B.DNA复制不需要引物

C.引物与DNA母链通过碱基互补配对进行结合

D.PCR扩增的对象是氨基酸序列

答案　C

解析　DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，故DNA复制需要引物。

DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链，而不能从5′端延伸DNA链。

引物通过碱基互补配对原则与DNA母链相结合。

PCR扩增的对象是DNA，不是氨基酸序列。

2.PCR技术有效地解决了因为样品中DNA含量太低难以对样品进行研究的问题，而被广泛应用，与细胞内的DNA复制相比，PCR可以快速扩增所需的DNA片段，请分析回答下列有关问题：

（1）体内DNA复制过程中用解旋酶打开双链DNA，而PCR技术中的解旋原理是。

（2）此过程需要一种TaqDNA聚合酶。

该酶是从中分离的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶具有的特性是。

（4）与体内DNA复制相比较，PCR反应要在中才能进行，并且要严格控制条件。

（5）PCR中加入的引物有种，加入引物的作用是

。

答案　

（1）DNA的热变性原理　

（2）水生耐热细菌Taq　（3）耐高温　（4）一定的缓冲溶液　温度　（5）2　作为DNA复制的起点

解析　

（1）PCR技术中用高温使DNA分子中的氢键打开，从而解旋，其原理是DNA的热变性原理。

（2）TaqDNA聚合酶是从水生耐热细菌Taq中提取的。

（3）与普通DNA聚合酶相比，TaqDNA聚合酶在90℃以上的环境中不变性，具有耐高温的特性。

（4）PCR反应需要适宜的温度和pH，因此PCR反应要在一定的缓冲溶液中进行，并需严格控制好温度条件。

（5）PCR需要两种引物，引物的识别位点决定了PCR扩增的DNA片段。

PCR中加入的引物一般是一小段单链DNA，作用是引导DNA复制，可以使游离的脱氧核苷酸与之结合形成磷酸二酯键，成为DNA复制的起点。

一题多变

细胞内的DNA复制需要适宜的温度和pH吗？

若需要，是如何实现的？

答案　需要。

细胞内的适宜温度和pH与内环境的稳态有关，低等生物与环境因素有关。

易错提醒

　与PCR原理有关的三个易错点

（1）酶的作用位点：

解旋酶的作用是使DNA两条链之间的氢键断开；

DNA聚合酶与DNA连接酶的作用都是催化形成磷酸二酯键。

不要误认为解旋酶也作用于磷酸二酯键。

（2）DNA聚合酶和DNA连接酶：

DNA聚合酶是将单个核苷酸连接到已有的单链片段的3′端上，需要模板；

而DNA连接酶连接的是两条DNA片段的缺口，不需要模板。

（3）PCR中的解旋过程：

PCR过程中不需要解旋酶，需要升高温度才能打开氢键，但此时的温度不会破坏磷酸二酯键，因此，DNA加热变性后变为单链，并未分解成单体。

二、目的DNA片段的体外扩增与鉴定

1.DNA片段的PCR扩增

（1）准备器材：

PCR仪、台式高速离心机、0.2mLPCR微量离心管、自动取液器、模板DNA等。

（2）在0.2mLPCR微量离心管中加入5μL10倍浓缩的PCR缓冲液，4种脱氧核苷酸的溶液各5μL,1μL模板DNA,5μL引物1和5μL引物2,29μL双蒸水。

（3）煮沸5min之后冰浴2min，低速离心，按照1单位/μL加入TaqDNA聚合酶。

（4）扩增DNA片段的反应程序：

将微量离心管放入PCR仪中，盖上样品池盖。

在94℃的条件下预热5min，再设置反应程序为：

94℃，30s→55℃，30s→72℃，1min（以上过程循环30次）。

最后一次延伸条件为72℃，1min。

（5）按照PCR仪器操作要求运行反应程序。

2.DNA分子的测定

（1）配制二苯胺试剂：

分别配制A液（1.5g二苯胺溶于100mL冰醋酸中，再加入1.5mL浓硫酸，用棕色瓶保存）和B液（体积分数为0.2%的乙醛溶液）。

将0.1mLB液加入10mLA液中，混匀。

（2）条件：

取一定量扩增前和扩增后的溶液分别放入等量的二苯胺试剂，混匀后观察颜色变化。

用沸水浴加热上述溶液。

（3）现象：

出现蓝色现象。

3.定量分析方法：

如果需要进行定量分析，可以采用紫外分光光度法或琼脂糖凝胶电泳法。

前者需要使用紫外分光光度计，后者需要使用电泳仪等。

1.实验过程分析

（1）离心的目的是什么？

在离心的过程中，微量离心管的盖子为什么一定要盖严？

答案　离心的目的是使反应液集中在离心管底部，提高反应效率。

微量离心管的盖子一定要盖严，防止实验中脱落或液体外溢。

（2）在离心前要用手轻轻弹击管的侧壁，目的是什么？

答案　离心前用手轻轻弹击管的侧壁目的是使反应液混合均匀。

（3）PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压蒸汽灭菌，为什么这样操作？

还有哪些操作与此目的相同？

答案　为避免外源DNA等的污染。

在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换。

2.结果检测

（1）实验中为什么要测定DNA的含量？

答案　实际操作过程中会有许多因素影响DNA含量，所以需要对DNA含量进行测定。

（2）如何判断DNA扩增成功？

答案　①可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

②电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

（3）PCR扩增过程可能会出现哪些异常结果？

答案　样品产物少，或产生新的DNA。

3.进行PCR反应的具体实验操作顺序应为（　　）

①设计好PCR仪的循环程序　②按配方准备好各组分　③用微量移液器向微量离心管中依次加入各组分　④进行PCR反应　⑤离心使反应液集中在离心管底部

A.②③⑤④①B.①⑤③②④

C.②③⑤①④D.④②⑤③①

答案　C

解析　PCR反应的操作步骤一般分为准备（包括配制配方及将各配方放于实验台上）―→移液―→混合―→离心―→反应。

PCR仪是一种自动控制温度的仪器，设计好循环程序就可以进行反应了。

4.近20年来，PCR技术（多聚酶链式反应）成为分子生物学实验室的一种常规实验手段，其原理是利用DNA半保留复制，在试管中进行DNA的人工复制（如图），在短时间内，将DNA扩增几百万倍甚至几十亿倍，从而使实验室所需要的遗传物质不再受限于活的生物体。

（1）加热使DNA双链间的键完全打开，称为；

而在细胞中是在

酶的作用下进行的。

（2）如果只需要大量克隆模板DNA中间的某个特定区段，应该加入种特定的引物。

当温度降低至55℃时，引物与两条“舒展”的模板链的特定位置结合，在DNA聚合酶的作用下，只能在引物的端连接脱氧核苷酸，两条子链的延伸方向都是

（3）PCR技术的必需条件，除了模板、原料、酶之外，至少还有三个条件，即液体环境、适宜的和，前者由自动调控，后者则靠来维持。

（4）通过PCR技术使DNA分子大量复制，如果将一个用15N标记的DNA分子放入试管中，以14N标记的脱氧核苷酸为原料，连续复制四次之后，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例是。

问题导析

（1）解旋是使DNA双链间的氢键断裂，PCR技术是利用DNA的热变性原理，细胞内是在解旋酶的作用下解旋。

（2）DNA分子不论复制几次，含有15N标记的DNA分子都只有2个。

答案　

（1）氢　解旋　解旋　

（2）两　3′　从子链的5′端向3′端延伸　（3）温度　酸碱度　PCR仪　缓冲液　（4）1/8

解析　

（1）PCR技术利用热变性原理使DNA双链之间的氢键断裂，称为解旋，而在细胞内是在解旋酶的作用下使氢键断裂。

（2）PCR分为三个基本反应步骤：

变性（94℃）、退火（55℃）、延伸（72℃），其特异性依赖于与靶序列互补的引物，引物是两段与待扩增DNA序列互补的片段，两引物之间的距离决定扩增片段的长度。

由于DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，只能从引物的3′端延伸DNA链，则DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

（3）PCR技术与细胞内的DNA复制不完全相同，除了需要模板、原料、酶以外，至少还需要液体环境（稳定的缓冲溶液），每一个步骤都需要适宜的温度和酸碱度等。

（4）一个DNA分子连续复制四次之后，形成16个DNA分子，15N标记的DNA分子有2个，则15N标记的DNA分子占全部DNA分子总数的比例为1/8。

1.PCR利用了DNA的哪种特性来控制DNA的解聚与结合（　　）

A.特异性B.稳定性

C.热变性D.多样性

2.符合PCR反应条件的一项是（　　）

①稳定的缓冲液环境　②DNA模板　③合成引物　④四种脱氧核苷酸　⑤DNA聚合酶　⑥DNA解旋酶　⑦限制酶　⑧温控设备

A.①②③④⑤⑥B.①②③④⑤⑥⑦⑧

C.③④⑤⑥⑦⑧D.①②③④⑤⑧

答案　D

解析　PCR反应模拟了生物细胞内DNA复制的条件，只是无需解旋酶（可热变性），也不需要基因工程的工具酶（限制酶）。

3.下列关于PCR的描述中，正确的是（　　）

①PCR是一种酶促反应　②引物决定了扩增的特异性　③扩增DNA利用了热变性的原理　④扩增的对象是氨基酸序列

A.①②④B.②③④

C.①③④D.①②③

解析　PCR是一种体外迅速扩增DNA片段的技术，在高温条件下，把DNA的双链打开，缓慢冷却后，又重新结合，需要耐高温的DNA聚合酶，同时，还需要引物，从引物的3′端连接脱氧核苷酸。

4.如图所示为PCR扩增的产物，请分析此产物是哪次循环的产物（　　）

A.第一次循环B.第二次循环

C.第三次循环D.第四次循环

答案　A

解析　在PCR反应中，以引物为标记，第一次循环时，以加入的DNA为模板，两条DNA链可分别由引物Ⅰ和引物Ⅱ与其结合并在DNA聚合酶的作用下延伸，所以形成的DNA中只有一种引物；

从第二次循环开始，上次产生的DNA分子又可作为模板参与反应，所以会形成DNA分子两端均含引物的情况，如下图所示，因此题干中所出现的情况是第一次循环的产物。

5.多聚酶链式反应（PCR）是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

请回答下列问题：

（1）DNA的两条链是反向平行的，通常将的末端称为5′端，当引物与DNA母链通过碱基互补配对结合后，DNA聚合酶就能从引物的开始延伸DNA链。

（2）PCR利用了DNA的热变性原理解决了打开DNA双链的问题，但又导致了DNA聚合酶失活的新问题。

到20世纪80年代，科学家从一种Taq细菌中分离到，它的发现和应用解决了上述问题。

要将Taq细菌从其他普通的微生物中分离出来，所用的培养基叫。

（3）PCR的每次循环可以分为三步。

假设在PCR反应中，只有一个DNA片段作为模板，请计算在5次循环后，反应物中大约有个这样的DNA片段。

（4）简述PCR技术的主要应用：

（要求至少答两项）。

答案　

（1）磷酸基团　3′端　

（2）耐高温的TaqDNA聚合酶　选择培养基　（3）变性、退火和延伸　32　（4）遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆和DNA序列测定等

解析　一条脱氧核苷酸链一端是游离的羟基，另一端是游离的磷酸基团，含羟基的一端是3′端，含磷酸基团的是5′端。

引物的5′端与模板链的3′端结合，然后沿着引物的3′端延伸。

耐高温的TaqDNA聚合酶的发现是实现PCR的关键，该酶可以利用选择培养基从一些微生物中分离出来。

PCR一次循环要经历变性、退火和延伸三个阶段。

课时作业

[学考达标]

1.PCR技术扩增DNA，需要的条件是（　　）

①目的基因　②引物　③四种脱氧核苷酸　④DNA聚合酶等　⑤mRNA　⑥核糖体

A.②③④⑤B.①②③⑥

C.①②③④D.①③④⑤

解析　PCR技术需要目的基因作为扩增的模板，DNA聚合酶催化反应的进行，而引物是满足DNA聚合酶起作用的需要，四种脱氧核苷酸是该过程的原料，以及一定的缓冲溶液和能严格控制温度的温控设备。

2.下列有关PCR反应的叙述，正确的是（　　）

A.PCR反应所需要的引物只是RNA

B.PCR反应所需要的材料是核糖核苷酸

C.PCR反应所需要的酶在60℃会变性

D.PCR反应需要在一定的缓冲溶液中进行

解析　PCR反应需要的引物一般是DNA，反应所需要的材料是脱氧核苷酸，PCR所需要的酶是耐高温的，在60℃不会变性。

3.下列各项属于引物作用的是（　　）

A.打开DNA双链

B.催化合成DNA子链

C.使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始复制

D.提供模板

解析　DNA分子的复制具有方向性，即只能从子链的5′端→3′端方向进行复制。

当引物与DNA母链结合后，DNA聚合酶就能从引物的3′端开始延伸DNA链。

4.PCR一般要经过三十多次循环，从第二轮循环开始，上一次循环的产物也作为模板参与反应，由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时（　　）

A.仍与引物Ⅰ结合进行DNA子链的延伸

B.与引物Ⅱ结合进行DNA子链的延伸

C.同时与引物Ⅰ和引物Ⅱ结合进行子链的延伸

D.无需与引物结合，在酶的作用下从头合成子链

答案　B

解析　当由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链作模板时，此单链引物固定端为5′端，因此与它互补的子链应从另一端开始合成，即与引物Ⅱ结合延伸DNA子链。

5.PCR仪实质上是一台自动调控温度的仪器，它调控不同温度的目的是（　　）

①94℃，使DNA分子变性，磷酸二酯键断开　②94℃，使DNA分子变性，解开螺旋　③55℃时，使DNA分子开始复制、延伸　④55℃时，引物与DNA单链结合　⑤72℃时，使DNA分子开始复制、延伸　⑥72℃，使DNA分子恢复双螺旋结构，恢复活性

A.①③⑤B.②③⑤C.②④⑤D.②④⑥

解析　PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

PCR仪实质上是一台能够自动调控温度的仪器。

当温度上升至94℃时，DNA分子变性，解开双螺旋结构；

温度下降到55℃时，引物与DNA单链结合，恢复活性；

温度上升至72℃时，DNA分子开始复制、延伸，根据碱基互补配对原则合成新的DNA链。

6.下列有关PCR过程的叙述中，不正确的是（　　）

A.在PCR的变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的氢键，DNA在人体细胞内复制时可利用解旋酶实现

B.退火过程中引物与DNA模板链的结合是依据碱基互补配对原则完成的

C.延伸过程中需要耐高温的DNA聚合酶、ATP、四种核糖核苷酸

D.PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温度较高

解析　变性是为了使DNA内部的氢键断裂，双螺旋打开，DNA在人体细胞内复制时借助解旋酶来实现；

根据碱基互补配对原则，引物可与DNA模板链结合；

延伸是形成新的DNA分子，需要以四种脱氧核苷酸为原料；

PCR过程所需温度较高，会导致一般的DNA聚合酶失活，需特定的耐高温的DNA聚合酶。

[高考提能]

7.有关下列操作过程的叙述，错误的是（　　）

A.PCR实验中使用的微量离心管、取液器、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌

B.PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃储存

C.PCR所用的缓冲液和酶从冰箱拿出之后，迅速融化

D.在微量离心管中添加反应成分时，每吸取一种试剂后，取液器上的枪头都必须更换

解析　在冰箱中放置的缓冲液和酶从冰箱中取出后应放在冰块上缓慢融化，而不能迅速融化，即C项错误。

8.“X基因”是DNA分子上一个有遗传效应的片段，若要用PCR技术特异性地拷贝“X基因”，需在PCR反应中加入两种引物（注：

引物的作用是与模板链形成双链后在DNA聚合酶的作用下可以继续链的延伸），两种引物及其与模板链的结合位置如图甲所示。

经4轮循环后产物中有五种不同的DNA分子，如下图乙所示，其中第⑤种DNA分子有几个（　　）

A.8B.6C.4D.2

解析　由图分析可知：

X基因第一次复制得到两个两种DNA分子：

①和②；

X基因第二次复制得到四个四种DNA分子：

①复制得①和③、②复制得②和④；

X基因第三次复制得到八个五种DNA分子：

①复制得①和③、③复制得③和⑤、②复制得②和④、④复制得④和⑤；

X基因第四次复制得到16个五种DNA分子：

①复制得①和③、②复制得②和④、两个③复制得两个③和两个⑤、两个④复制得两个④和两个⑤、两个⑤得到4个⑤。

从上面的推测可知，第四轮循环产物中有8个⑤。

9.在PCR扩增DNA的实验中，预计一个DNA分子经过30次循环后，应该得到230个DNA分子，但是结果只有约210个DNA分子，那么出现该现象的原因不可能是（　　）

A.TaqDNA聚合酶的活力不够，或活性受到抑制

B.系统设计欠妥

C.循环次数不够

D.引物不能与母链结合

解析　如果TaqDNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制，则导致催化效率降低，得到的产物比预期的少，A项正确；

如果PCR系统设计欠妥，则达不到预期的结果，B项正确；

如果循环次数过少，产物的量比预期的少，C项正确；

如果引物设计不合理，若不能与模板DNA结合，将造成无法进行扩增，而结果得到了210个DNA分子，D项错误。

10.有关PCR技术的说法，下列叙述不正确的是（　　）

A.多聚酶链式反应，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术

B.在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似

C.PCR反应只需在一定的缓冲溶液中提供DNA模板以及四种脱氧核苷酸

D.PCR一般经历三十多次循环，每次循环分为变性、退火和延伸

解析　PCR是多聚酶链式反应的英文缩写，是一种体外迅速扩增DNA片段的技术。

在用PCR技术扩增DNA时，DNA的复制过程与细胞内DNA的复制类似，也需要提供模板（母链）、酶、原料、引物等条件。

PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、退火和延伸三步。

11.PCR（多聚酶链式反应）技术是一项在生物体外复制特定的DNA片段的核酸合成技术，下图表示合成过程，请据图分析回答下面的问题。

（1）A过程高温使DNA变性解旋，对该过程的原理叙述正确的是。

A.该过程用到耐高温的解旋酶破坏氢键

B.该过程用到限制酶破坏磷酸二酯键

C.该过程不需要解旋酶的作用

D.该过程与人体细胞的过程完全相同

（2）C过程要用到的酶是耐高温的。

这种酶在高温下仍保持活性，因此在PCR扩增时可以加入，（填“需要”或“不需要”）再添加。

PCR反应除提供酶外，还需要满足的基本条件有：

（3）如果把模板DNA的两条链用15N标记，游离的脱氧核苷酸不做标记，控制“94℃－55℃－72℃”温度循环3次，则在形成的子代DNA中含有15N标记的DNA占。

答案　

（1）C

（2）DNA聚合酶　一次　不需要　DNA模板、两种引物、四种脱氧核苷酸，通过控制温度和酸碱度使DNA复制在体外反复进行

（3）25%

解析　

（1）高温所起的作用类似于解旋酶，使双链DNA变为单链。

（2）C过程是PCR技术的延伸阶段，当系统温度上升到72℃左右，溶液中的四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶的作用下合成新的DNA链。

这种DNA聚合酶在高温下不变性，所以一次性加入即可。

（3）PCR技术遵循半保留复制的特点。

经过三次循环，共产生8个DNA分子，其中有2个DNA分子含有15N标记。

12.PCR是一种体外快速扩增DNA的方法，用于放大特定的DNA片段，数小时内可使目的基因片段扩增到数百万个。

PCR需要模板